Optimering och sömnförbättrande effekter av ett Congrong-Zaoren-Wumei-drycksextrakt i möss
Jan 30, 2026
2 Resultat och analys
2.1 Optimering av beredningsprocessen för dryckesextraktet Congrong–Zaoren–Wumei
From Figure 1, the established HPLC method achieved effective separation between the chromatographic peaks of the four reference compounds-citric acid, echinacoside, verbascoside, and spinosin-and adjacent peaks. Retentionstiderna var tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min respektive tR4=25.9 min. Linear regressions of peak area versus analyte concentration yielded linear ranges of 12.12–2016, 0.14–110, 0.18–112.50, and 2.44–18.30 µg·mL–1, with R2 values of 0.9998, 1, 1, and 1, indicating excellent linearity. Under these conditions, limits of detection (LOD) for citric acid, echinacoside, verbascoside, and spinosin were 3.636, 0.045144, 0.058, and 0.7564 µg·mL–1, and limits of quantification (LOQ) were 12.12, 0.14, 0.18, and 2.44 µg·mL–1, respektive. Precisionstester visade RSD på 0,10 %, 0,07 %, 0,06 % och 0,33 % för de fyra analyterna, vilket tyder på god instrumentprecision. Stabiliteten över 0–12 timmar var god, med RSD på 0,78 %, 0,16 %, 0,20 % och 1,46 %. Repeterbarhetstester gav RSD på 0,51 %, 0,42 %, 0,37 % och 0,38 % för analyterna, vilket visade god repeterbarhet. Spike-recovery-tester visade genomsnittliga återhämtningar på 97,42 %, 103,32 %, 98,90 % och 99,71 %, med RSD på 0,70 %, 0,52 %, 1,05 % respektive 0,63 %. Therefore, the HPLC method established for simultaneous determination of these four major components is accurate and reliable, suitable for subsequent process optimization assays.
Fig. 1 HPLC-kromatogram av referensen och lösningarna vid 210 nm våglängd (A) och 330 nm våglängd (B och C)
I den metodologiska utvärderingen av orena polysackarider var LOD 0,098 µg·mL–1. OD-värdena för lösningsmedelsblank och blankkontroll vid 485 nm visade inga tydliga förändringar, vilket tyder på god specificitet. Den linjära regressionen av OD mot koncentration gav R2=0.9997, vilket indikerar utmärkt linjäritet. RSD för sex på varandra följande mätningar var 0,47 %, vilket visar god precision. RSD för polysackaridhalt inom 12 timmar var 0,44 %, vilket tyder på god stabilitet. RSD för sex oberoende preparerade prover var 2,51 %, vilket tyder på god repeterbarhet. Därför är metoden lämplig för att kvantifiera råa polysackarider under processoptimering.
Cistanche Roucongrong fördelar i Ancient Book
Supportive Service Of Wecistanche-För mer information om samarbete
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
2.1.2 Resultat av enfaktorsundersökningar
Genom att använda den etablerade HPLC-metoden i kombination med polysackaridanalysen, och med innehållet av citronsyra, echinakosid, verbascoside, spinosin och polysackarider i extraktet som utvärderingsindex, genomfördes enfaktorundersökningar på extraktionstemperatur, fast-vätskeförhållande och extraktionstid för att stödja den ortogonala designen.
Vid extraktionstemperaturer på 60, 80 och 100 grader ökade innehållet av citronsyra, echinakosid, verbaskosid, spinosin och orena polysackarider i extrakten med temperaturen.
Vid förhållanden mellan fast och vätska på 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 och 1:12 (g·mL–1), ökade innehållet av citronsyra, spinosin och orena polysackarider med högre förhållanden; echinacoside och verbascoside toppade vid 1:10 (g·mL–1) och minskade vid 1:12 (g·mL–1). Det totala innehållet av alla markörkomponenter ökade dock med förhållandet mellan fast och vätska.
Vid extraktionstider på 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 och 3,0 timmar varierade innehållet i individuella analyter olika, men det totala innehållet av markörkomponenter ökade med tiden.
Detaljerad information finns i tilläggsmaterialet. Med tanke på industriell praktiskhet (undviker alltför lång extraktion), sattes faktorer och nivåer för den ortogonala designen som i Tabell 2, och det ortogonala schemat visas i Tabell 3.
Tabell 2. Faktornivåer för ortogonal experimentell design för extraktionsmetoden för Congrong–Zaoren–Wumei Beverage
Faktorer:
A: Extraktionstemperatur (grad)
B: Förhållande mellan fast och vätska (g mL–1)
C: Extraktionstid (h)
| Nivå | A: Temperatur (grad) | B: Förhållande (g mL–1) | C: Tid (h) |
|---|---|---|---|
| 1 | 60 | 1:7 | 1.0 |
| 2 | 80 | 1:10 | 1.5 |
| 3 | 100 | 1:12 | 2.0 |
2.1.3 Ortogonala designresultat
Extraktion utfördes per den ortogonala arrayen. Innehållet av citronsyra, echinakosid, verbaskosid, spinosin och orena polysackarider visas i tabell 3. Baserat på analys av intervall (R) var faktorns inverkan på totalt markörinnehåll A > B > C, dvs extraktionstemperatur > fast-vätskeförhållande > extraktionstid. Att jämföra k-värden föreslog den optimala kombinationen A3B3C3: extraktionstemperatur 100 grader, förhållande mellan fast och vätska 1:12 (g·mL–1) och extraktionstid 2 timmar. ANOVA (tabell 4) visade att extraktionstemperaturen hade en signifikant effekt på det totala markörinnehållet, medan effekterna av förhållandet mellan fast och vätska och tiden inte var signifikanta.
Tabell 3. Ortogonal experimentell design och uppmätt komponentinnehåll i Congrong–Zaoren–Wumei-dryck (mg g–1)
Faktorer: A (temperatur), B (förhållande mellan fast och vätska), C (tid)
| Rättegång nr. | A | B | C | Totalt markörer | Citronsyra | Spinosin | Echinacoside | Verbascoside | Rå polysackarider |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 3 | 1 | 116.71 | 75.55 | 4.08 | 1.62 | 0.48 | 34.98 |
| 2 | 1 | 2 | 3 | 70.98 | 59.01 | 2.60 | 0.80 | 0.36 | 8.22 |
| 3 | 3 | 1 | 3 | 117.86 | 73.87 | 3.53 | 1.21 | 0.45 | 38.80 |
| 4 | 1 | 3 | 2 | 72.55 | 59.73 | 2.37 | 0.94 | 0.41 | 9.99 |
| 5 | 2 | 3 | 3 | 83.64 | 63.20 | 2.15 | 1.08 | 0.44 | 16.77 |
| 6 | 2 | 1 | 2 | 117.76 | 74.09 | 2.58 | 1.37 | 0.48 | 39.24 |
| 7 | 2 | 2 | 1 | 110.74 | 70.96 | 2.36 | 1.07 | 0.43 | 35.92 |
| 8 | 2 | 1 | 1 | 69.63 | 58.37 | 1.74 | 0.54 | 0.34 | 8.65 |
| 9 | 1 | 1 | 3 | 69.66 | 58.14 | 2.48 | 0.86 | 0.36 | 7.83 |
K-statistik (summan av summor per faktornivå)
K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49
K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65
K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83
Område R: A=46.38, B=5.25, C=4.19
2.1.4 Validering och uppskalning
Processvalidering under optimala förhållanden gav ett genomsnittligt totalinnehåll av markörkomponenter på 119,74 mg·g–1 med RSD 0,57%, vilket indikerar stabilitet och tillförlitlighet. Uppskalningsförsöket under samma förhållanden gav ett genomsnittligt totalt markörinnehåll på 120,89 mg·g–1 med RSD 0,95%, i överensstämmelse med resultaten från förskalningen, vilket ytterligare bekräftar robustheten. Prover från de tre uppskalningssatserna användes för efterföljande sömnrelaterade studier; deras medelhalt var: citronsyra 77,73 mg·g–1, echinakosid 2,69 mg·g–1, verbaskosid 1,03 mg·g–1, spinosin 0,50 mg·g–1 och polysackarider 38,93 mg·g–1.
Tabell 4. Variansanalys från ortogonala experiment
| Faktor | Summan av kvadrater | df | Genomsnittlig kvadrat | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Extraktionstemperatur | 4010.50 | 2 | 2005.25 | 116.26 | 0.01 |
| Fast-vätskeförhållande | 49.79 | 2 | 24.90 | 1.44 | 0.41 |
| Extraktionstid | 47.37 | 2 | 23.68 | 1.37 | 0.42 |
Liu et al. [16] optimerad vattenextraktion av fenyletanoidglykosider från Cistanche tubulosa och identifierade 1:15 (g·mL–1), 80 grader och 2 timmar som optimala; Innehållet av fenyletanoidglykosid minskade över 90 grader. I den aktuella studien nådde echinakosid- och verbascoside-innehållet en topp i förhållandet 1:10 (g·mL–1) och sjönk vid 1:12 (g·mL–1), men ökade med temperaturer på 60, 80 och 100 grader. Denna avvikelse kan relatera till användningen av Cistanche deserticola (öknen Cistanche) i vår dryck och till matriseffekter från samexisterande Suanzaoren och Wumei som kan påverka upplösningen av fenyletanoidglykosid.
Tabell 5. Effekt av Congrong–Zaoren–Wumei-drycksextrakt på direkt sömn hos möss (n=12)
| Grupp | Totalt antal djur | Sovande djur | Sömnfrekvens (%) |
|---|---|---|---|
| Tom | 12 | 0 | 0 |
| Estazolam | 12 | 0 | 0 |
| Lågdosextrakt | 12 | 0 | 0 |
| Medeldosextrakt | 12 | 0 | 0 |
| Högdosextrakt | 12 | 0 | 0 |
Sammanfattningsvis, med hjälp av HPLC och fenol-svavelsyrametoden, optimerade vi extraktionsprocessen baserat på innehållet av citronsyra, echinakosid, verbaskosid, spinosin och polysackarider. Enkelfaktor- och ortogonala experiment följt av validering fastställde de optimala förhållandena: 100 grader, 1:12 (g·mL–1) förhållande mellan fast och vätska och 2 timmars extraktionstid, vilket ger en referens för framtida industriell utveckling.
Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85 000 tunnland), färsk-cistanche lagringskapacitet (~15 000 ton) och GMP-certifierade tillverkningsverkstäder (100 000 klass renrum) utrustade med avancerad ultrafiltrering och nanofiltrering för rening och koncentration, plus ett 10 000 klass mikrobiologilab. Certifieringar inkluderar China SC, HACCP och ekologiska program (t.ex. NOP). Denna infrastruktur stöder direkt översättning av det optimerade vattenextraktions- och markörstandardiseringsprotokollet till storskalig, exportkompatibel produktion av funktionella drycker och extrakt.
Tabell 6. Effekt av extraktet på den hypnotiska effekten av subtröskelnatriumpentobarbital hos möss (x̄ ± s, n=12)
| Grupp | Totalt antal djur | Sovande djur | Sömnfrekvens (%) |
|---|---|---|---|
| Tom | 12 | 1 | 8.33 |
| Estazolam | 12 | 10 | 83.33** |
| Lågdosextrakt | 12 | 4 | 33.33 |
| Medeldosextrakt | 12 | 5 | 41.67 |
| Högdosextrakt | 12 | 6 | 50.00* |
Obs: Jämfört med blank grupp, * P < 0,05; ** P < 0,001.
2.2 Effekter av extraktet på musbeteende och sömn
2.2.1 Direkt sömn
Som visas i tabell 5, efter 30 dagars kontinuerlig administrering, visade möss i estazolamgruppen och i låg-/medel-/högdosextraktgrupperna inte uppenbar sömn inom 20 minuter efter den slutliga dosen, utan signifikanta skillnader jämfört med den tomma gruppen. Detta indikerar ingen direkt sömninducerande effekt efter 30 dagars extraktadministrering.
2.2.2 Beteendeeffekter
Ett öppet fälttest bedömde sedativa-liknande effekter. Effekterna på det totala tillryggalagda avståndet och mittposterna visas i figur 2. Jämfört med blankgruppen ökade estazolam det totala avståndet och mittposterna med 14,48 % respektive 31,07 % utan statistisk signifikans. Lågdosextraktet ökade avsevärt det totala avståndet med 25,10 % (P < 0,05) och ökade obetydligt mittinträden med 50,93 %. Medeldosen ökade signifikant totala distans- och centrumingångar med 27,09 % och 72,33 % (P < 0,05). Den höga dosen ökade totala distans- och centrumingångar med 15,60 % respektive 40,78 %, utan betydelse. I motsats till estazolam ökade de låga/medelhöga/höga doserna det totala avståndet med 1,73, 1,87 och 1,07 gånger, och centrumingångarna med 1,64, 2,33 respektive 1,31 gånger, ingen signifikant. Dessa resultat indikerar att extraktet minskade ångestliknande beteende i det öppna fältet efter 30 dagar, vilket tyder på en lugnande effekt.
2.2.3 Undertröskelnatriumpentobarbital-inducerad sömn
Som visas i tabell 6, jämfört med den tomma gruppen, ökade estazolam och alla tre extraktdoserna sömnhastigheten under en undertröskeldos av natriumpentobarbital. Estazolam ökade antalet sovande djur med 9 gånger jämfört med blank (P < 0,001). Låg-, medel- och högdosextraktgrupper ökade sovande djur med 3-, 4- respektive 5-faldigt; endast den höga dosen nådde statistisk signifikans (P < 0,05). Jämfört med estazolam visade ingen av extraktdoserna en starkare sömninducerande effekt. Således kan extraktet förbättra sömn inducerad av subtröskelnatriumpentobarbital i viss utsträckning.
2.2.4 Sodium Pentobarbital Sleep Latens
Jämfört med den tomma gruppen förkortade estazolam och alla tre extraktdoserna signifikant pentobarbital-inducerad sömnlatens (P < 0,001). Estazolam minskade latensen med 58,44 % (P < 0,001). Låg-, medel- och högdosextraktgrupperna minskade latensen med 29,59 %, 31,42 % respektive 53,83 % (alla P < 0,001). Det fanns ingen signifikant skillnad mellan låga och medelstora doser; den höga dosen förkortade latensen signifikant jämfört med både låga och medelhöga doser med 34,43 % och 32,69 % (P < 0,01), med en effekt liknande estazolam (tabell 7). Därför förkortade alla tre doserna markant pentobarbital-inducerad sömnlatens, med den höga dosen som presterade bäst.
Traditionella kinesiska läkemedel innehåller olika bioaktiva beståndsdelar som verkar på flera mål, vilket erbjuder unika fördelar för behandling av sömnlöshet [17]. Med växande uppmärksamhet på sömnproblem, undersöks medicinskt ätbara TCM alltmer för sömnmodulering [18]. Till exempel förkortade en sammansatt fast dryck huvudsakligen Suanzaoren och Poria signifikant pentobarbital-inducerad sömnlatens och förlängd sömnvaraktighet hos möss, potentiellt via förändringar i 5-HT, DA och GABA [19]. Här ökade extraktet signifikant sömn under pentobarbital under tröskelvärdet och förkortade pentobarbital-inducerad sömnlatens, vilket främjade sömnstart och minskad latens, samtidigt som det inte visade någon direkt sömninducerande effekt. De uppmätta innehållen av primära komponenter var, i fallande ordning: citronsyra (77,73 mg·g–1), polysackarider (38,93 mg·g–1), echinakosid (2,69 mg·g–1), verbascoside (1,03 mg·g–1) och spinosin (0,50 mg·g–1). Spinosin har visat sig förbättra pentobarbital-inducerad sömn; det kan öka icke-REM-sömn och förändra c-Fos-uttryck i sömn-vakna reglerande hjärnregioner [20], dämpa PCPA-inducerad sömnlöshet, minska sömnfördröjningen och förlänga sömnen [21]. Verbascoside har rapporterat anxiolytiska, hypnotiska och muskelavslappnande aktiviteter [22]. Däremot har huvudbeståndsdelarna-citronsyra, polysackarider (från Cistanche, Suanzaoren och Wumei) och echinakosid färre direkta rapporter om sömnförbättring; Ny forskning om TCM-polysackarider (t.ex. Acanthopanax senticosus polysaccharides) tyder dock på potentiella sömnfördelar via vägar som SIRT1/PGC-1 [23]. Därför motiverar rollerna för citronsyra, polysackarider och echinakosid i sömnmodulering ytterligare studier.
7. Effekt av extraktet på sömnlatens inducerad av natriumpentobarbital hos möss (x̄ ± s, n=12)
| Grupp | Totalt antal djur | Sömnfördröjning (min) |
|---|---|---|
| Tom | 12 | 32.34 ± 4.27 |
| Estazolam | 12 | 13.44 ± 3.20** |
| Lågdosextrakt | 12 | 22.77 ± 5.81**# |
| Medeldosextrakt | 12 | 22.18 ± 6.05**# |
| Högdosextrakt | 12 | 14.93 ± 3.35** |
Anmärkningar:
Jämfört med blank grupp: ** P < 0,0001.
Jämfört med högdosextraktgrupp: # P < 0,01.
3 Slutsats
Med hjälp av de medicinskt ätbara TCM:erna Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen och Mume Fructus för att formulera en Congrong-Zaoren-Wumei-dryck, optimerade vi beredningsprocessen för dess extrakt med hjälp av innehållet i fyra markörkomponenter (echinacoside, verbascoside, spinosin, citronsyrainduser) och polysackarider. De optimala extraktionsförhållandena bestämdes som 100 grader, ett förhållande mellan fast och vätska på 1:12 (g·mL–1) och 2 timmar, vilket ger teoretisk vägledning för industriell produktion. Ytterligare utvärdering visade att 30 dagars kontinuerlig administrering inte hade någon direkt sömninducerande effekt hos möss, men det minskade signifikant ångestliknande beteende i det öppna fältet (vilket tyder på en lugnande effekt), förbättrade sömnen under en subtröskeldos av natriumpentobarbital och markant förkortade pentobarbital-inducerad sömnlatens. Dessa fynd tyder på att extraktet som framställts under den optimerade processen uppvisar gynnsamma sömnförbättrande effekter hos möss, vilket ger en vetenskaplig grund för att utveckla Cistanche-baserade sömnförbättrande produktlinjer.
Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85 000 tunnland; färsk cistanchelagring ~15 000 ton) stödjer råvarukonsistens och kvalitetskontroll av internationell standard, vilket underlättar kommersialisering av funktionella drycker och hälsotillskott som uppfyller USA/EU:s förväntningar.
