Abstrakt

Syfte: Att undersöka effekterna av en Cistanche-innehållande formel (som ersätter de ursprungliga blodnärande och njurförstärkande örterna) på transformerande tillväxtfaktor- 2 (TGF- 2) uttryck, skleral ombyggnad och vattentransport i formberövande närsynthet (FDM)-råttor genom att reglera (CA-aquaporin)-/cavein1 (AQP1) väg.

Metoder: Fyrtio SD-hanråttor av SPF-grad valdes ut, bland vilka 30 användes för att etablera FDM-modellen. Efter framgångsrik modellering delades råttorna in i FDM-gruppen, pirenzepingruppen (PIR) och Cistanche-formelgruppen, med 10 råttor i varje grupp. De återstående 10 icke-modellerade råttorna fungerade som den normala gruppen. Normalgruppen och FDM-gruppen fick ingen intervention. PIR-gruppen behandlades med PIR-ögondroppar två gånger om dagen (morgon och kväll), medan Cistanche-formelgruppen fick intragastrisk administrering av den Cistanche-innehållande formeln. Brytningsfel och axiell längd hos råttor detekterades med användning av ett retinoskop och diagnostiskt instrument. HE-färgning användes för att observera de morfologiska förändringarna av skleral vävnad. Immunhistokemisk färgning användes för att detektera uttrycket av TGF- 2 i skleral vävnad. Western blot användes för att bestämma de relativa uttrycksnivåerna av AQP1- och CAV1-proteiner i skleral vävnad. RT-PCR utfördes för att mäta de relativa uttrycksnivåerna av glutamat-aspartattransportör (GLAST) och glutamattransportör 1 (GLT-1) mRNA i skleral vävnad. Resultat: Jämfört med den normala gruppen minskade brytningsfelet, TGF- 2-expressionsnivån och relativa expressionsnivåer av AQP1- och CAV1-proteiner i FDM-gruppen, Cistanche-formelgruppen och PIR-gruppen signifikant, medan den axiella längden och relativa expressionsnivåerna för GLAST mRNA och GLT-1.} mRNA var < signifikant ökade. Jämfört med FDM-gruppen ökade brytningsfelet, TGF- 2-expressionsnivån och relativa expressionsnivåer av AQP1- och CAV1-proteiner i Cistanche-formelgruppen och PIR-gruppen signifikant, medan den axiella längden och relativa expressionsnivåerna för GLAST mRNA och GLT-1 mRNA minskade signifikant (alla P < 0,05). Jämfört med Cistanche-formelgruppen minskade brytningsfelet, TGF- 2-expressionsnivån och relativa expressionsnivåer av AQP1- och CAV1-proteiner i PIR-gruppen signifikant, medan den axiella längden och relativa expressionsnivåerna för GLAST mRNA och GLT-1 mRNA ökade signifikant (alla P < 0,05). HE-färgningsresultat visade att det inte fanns några onormala förändringar i strukturen för varje näthinnelager i den normala gruppen; näthinnan i FDM-gruppen tunnades ut och allvarliga vakuolära förändringar uppträdde i gangliecellskiktet; retinaltjockleken hos Cistanche-formelgruppen och PIR-gruppen ökades, cellarrangemanget var i princip regelbundet, antalet ganglionceller ökades och cellerna i varje lager var tätt arrangerade, med den mest signifikanta prestandan i Cistanche-formelgruppen. Slutsats: Den Cistanche-innehållande formeln har en viss positiv effekt på behandlingen av FDM, och dess mekanism kan vara relaterad till att reglera uttrycket av CAV1, AQP1 och TGF- 2, samt att balansera och förbättra skleral ombyggnad och vattentransportfunktioner.

 

 

CISTANCHE-ÖRTSUPPLEMENT FÖR ATT FÖRBÄTTRA NJURENS FUNKTION

 

 

Nyckelord

Formberövande närsynthet; Cistanche-innehållande formel; Transformerande tillväxtfaktor- 2; Aquaporin 1; Caveolin-1; Skleral ombyggnad; Vattentransport

 

Under de senaste åren, med förändringar i människors livsstil och den kontinuerliga utvecklingen av elektroniska enheter, har förekomsten av närsynthet ökat. Som en vanlig sjukdom har den blivit ett globalt hälsoproblem. Form-deprivation närsynthet (FDM) är en speciell typ av närsynthet, som vanligtvis orsakas av deprivation eller minskning av visuell stimulans för ögonen. FDM stör inte bara den sklerala ombyggnadsprocessen utan leder också till onormala förändringar i ögonglobens form och störningar i vattentransportfunktionen, vilket ytterligare kan förvärra skleral vävnadsskada och deformation. Aquaporin 1 (AQP1) är ett allmänt existerande protein vars huvudsakliga funktion är att främja snabb transport av vattenmolekyler över cellmembran. I ögat är fördelningen och funktionen av AQP1 relaterad till den dynamiska balansen av intraokulär vätska. Caveolin-1 (CAV1) är ett protein involverat i bildandet av cellmembranets mikrostrukturer och signaltransduktion. I ögat finns CAV1 huvudsakligen i retinala pigmentepitelceller och fotoreceptorceller, och är relaterat till överföringen av visuella signaler och stabiliteten i den intraokulära miljön. Transforming growth factor- 2 (TGF- 2) är ett pleiotropt cytokin med flera biologiska effekter som att främja cellproliferation, differentiering och migration. I den intraokulära miljön spelar TGF- 2 en viktig roll i utvecklingen och underhållet av hornhinnan och skleran. För närvarande är den huvudsakliga behandlingen för FDM läkemedelsbehandling.

Inom traditionell kinesisk medicin (TCM) tros bildandet av närsynthet vara relaterat till faktorer som otillräcklig qi och blod, och brist på njuressens. Njuren betraktas som den "medfödda grunden" och är nära besläktad med ögonens funktion. TCM menar att "njuren styr essensen, och essensen ger näring åt ögonen; levern öppnar sig i ögonen och tillräckligt med leverblod säkerställer klar syn". Därför har tonifiering av njuren och närande blod alltid varit en viktig terapeutisk princip för ögonsjukdomar orsakade av bristsyndrom i TCM.

Cistanche, känd som "ökenginsengen" och en av de "nio odödliga medicinerna" i TCM, har en historia på mer än 2 000 år som medicinsk ingrediens. Cistanche är inspelat som ett närande medicinskt material av högsta kvalitet i uråldriga TCM-klassiker, och är högt värderad för sina effekter som tonifierar njuren, fyller på essens, ger näring till blod och fuktar torrhet. Till skillnad från många andra TCM-örter, växer Cistanche uteslutande i öknar, främst parasitisk på rötterna av Tamarix ramosissima i regioner som Xinjiang, Inre Mongoliet och Gansu i Kina. Den unika ökenmiljön ger den rika aktiva ingredienser, inklusive echinakosid, verbascoside och flavonoider, som har vetenskapligt bevisats ha starka antioxidantegenskaper, minska cellapoptos och främja cellproliferation.

Modern forskning har visat att Cistanche har betydande njurvårdande effekter. Det kan minska njurcellsapoptos, främja njurcellsproliferation, reparera skadade njurceller och vidga njurblodkärl och därigenom förbättra njurfunktionen. Dessutom kan Cistanche förbättra immuniteten genom att främja lymfocytproliferation, motstå trötthet genom att öka leverglykogenproduktionen och utöva anti-aging-effekter genom att ta bort fria radikaler. Dessa biologiska aktiviteter överensstämmer i hög grad med TCM-teorin om "tonifiering av njuren och närande essens", och ger också en vetenskaplig grund för dess tillämpning vid behandling av ögonsjukdomar. Baserat på den terapeutiska TCM-principen att tonifiera njurarna och närande blod, och kombinera de moderna farmakologiska egenskaperna hos Cistanche, ersatte denna studie de ursprungliga blodnärande och njurtonifierande örterna med Cistanche för att bilda en ny Cistanche-innehållande formel, och utforskade dess effektivitet och mekanism för att ge henne en naturlig idé för behandling av FDM. therapies for myopia.

1 Material och metoder

1.1 Försöksdjur

Fyrtio SD-hanråttor av SPF-grad, som vägde 180-200 g och åldrade 6-8 veckor, köptes från Beijing Keyu Animal Breeding Center [licensnummer: SCXK (Jing) 2022-0004] och föds upp rutinmässigt i Animal Laboratory of the Chinese Eye Hospitals Academy of China. Detta experiment överensstämde med de relevanta bestämmelserna i "Regler om administrering av försöksdjur" och godkändes av den medicinska etiska kommittén vid Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences (batchnummer: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Huvudreagenser och instrument

Cistanche tubulosa (köpt från Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., med aktiva ingredienser inklusive echinacoside Större än eller lika med 30,0 %, verbascoside Större än eller lika med 12,0 %, och totala fenetylalkoholglykosider Större än eller lika med 75,0 %) användes som läkemedelsmaterial. Pirenzepine (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Förening Tropicamid ögondroppar (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., specifikation 5 ml); 4 g·L⁻¹ Oxybuprocaine Hydrochloride ögondroppar (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1-antikropp (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); CAV1-antikropp (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -aktinantikropp (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); Get anti-kanin IgG (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); HE Staining Kit (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Modelleringsmetod och gruppering

Trettio råttor användes för att etablera FDM-modellen. Råttor bedövades genom intraperitoneal injektion av pentobarbitalnatrium (30 mg-kg-1). Efter rengöring och desinficering av höger öga med povidon-jod limmades en ogenomskinlig ögonmask på höger öga. Ögonmasken kontrollerades dagligen för avlossning eller lätt läckage och limmades om om den var lös. Det vänstra ögat lämnades obehandlat. Efter 4 veckors avsaknad av monokulär form utfördes binokulär retinoskopi och axiell längdmätning på råttorna. Framgångskriterierna för modellering: efter cykloplegi mättes brytningsfel med ett retinoskop eller en automatisk refraktometer, och det berövade ögat visade en signifikant närsynt förskjutning i brytningsstatus [dvs skillnaden i binokulärt brytningsfel Större än eller lika med 2 D ansågs vara framgångsrik modellering, och den genomsnittliga närsynthetsförskjutningen för det berövade ögat jämfördes med ca (-1) ± 1.5. Alla 30 råttor modellerades framgångsrikt och delades in i FDM-gruppen, PIR-gruppen och Cistanche-formelgruppen, med 10 råttor i varje grupp. De återstående 10 icke-modellerade råttorna fungerade som den normala gruppen.

1.4 Interventionsmetoder

Normalgruppen och FDM-gruppen fick ingen intervention. PIR-gruppen fick 5 droppar PIR ögondroppar i höger öga två gånger om dagen (morgon och kväll) med ett intervall på 2 minuter i 15 dagar. Cistanche-formelgruppen ingrep med den Cistanche-innehållande formeln. Cistanche tubulosa (50 g, kärningrediensen) avkokades med vatten och koncentrerades till en medicinsk lösning med en koncentration av 1000 g·L⁻1. Råttorna gavs intragastrisk administrering i en dos av 12,70 g-kg-1 en gång om dagen under 15 dagar. Doseringen av Cistanche bestämdes baserat på dess kliniska applikationserfarenhet och modern farmakologisk forskning, vilket säkerställer effektiva koncentrationer av aktiva ingredienser såsom echinacoside och verbascoside.

1.5 Detektionsmetoder

1.5.1 Utvärdering av brytningsfel och ändringar i axiella längder

Morfologiska och brytningsfeldetektion: 24 timmar efter slutet av formbrist valdes 3 råttor slumpmässigt från varje grupp för detektion. Före experimentet placerades råttor i en mörkeranpassad miljö i 30 minuter, sövdes sedan genom isofluraninandning och fixerades på en speciell djurhållare. Ett högupplöst OCT-bildsystem användes för panoramaskanning av ögongloben. Under skanningen justerades sonden för att vara vinkelrät mot hornhinnan för att erhålla tydliga tvärsnittsbilder av näthinnan och linsen. Varje öga skannades 3 gånger i följd, och det axiella avståndet från den främre hornhinnans yta till det retinala pigmentepitelskiktet (dvs. axiell längd) mättes automatiskt av systemets inbyggda programvara för att beräkna det sfäriska ekvivalenta brytningsfelet. För att säkerställa dataprecisionen analyserade två professionellt utbildade forskare bilderna oberoende av varandra på ett förblindat sätt. Om skillnaden mellan de två mätresultaten var större än 0,50 D, kasserades data och mättes på nytt. Bekräftande detektering av axiell längd: För att verifiera OCT-mätresultaten användes även A-scan ultraljudsdiagnosinstrument. Först instillerades ögondroppar av oxibuprokainhydroklorid i råttornas båda ögon för topisk anestesi, och sedan placerades A-scan-sonden försiktigt i kontakt med hornhinnan. Instrumentet justerades till manuellt läge och den exakta ultraljudsutbredningshastigheten ställdes in enligt det intraokulära mediet: 1540 m·s⁻1 för den främre kammaren och glaskroppen. Under drift lokaliserades varje gränssnitt genom manuell märkning, och varje öga mättes 3 gånger upprepade gånger för att ta medelvärdet. Detta experiment utfördes på ett förblindat sätt och alla operatörer fick enhetlig utbildning för att säkerställa konsekventa mättekniker. Instrumentet kalibrerades före mätning och några prover valdes slumpmässigt ut för repeterbarhetstestning för att utvärdera intraklass- och interklasskorrelationskoefficienterna (ICC). Strikt standardiserade operationsprocedurer följdes under experimentet för att säkerställa datas vetenskaplighet och tillförlitlighet.

1.5.2 HE-färgning

Efter detektering av brytningsfel och axiell längd, avlivades råttor genom överdriven anestesi. Ögonlocken och omgivande vävnader i båda ögonen desinficerades, och den nasala och temporala limbus vinkelrät mot mittpunkten av hornhinnan markerades. Bindhinnan skars in enligt märkena och ögongloben skars ut. Limbus skars in för att avlägsna den främre segmentvävnaden och glaskroppen, och skleralvävnaden hölls kvar. Skleralvävnaden fixerades med 40 g·L⁻1 paraformaldehyd i 24 timmar, dehydrerades med gradientetanol, inbäddades rutinmässigt i paraffin, renades med xylen, monterades med neutral balsam, sektionerades vid 5 μm, färgades med HE och observerades med avseende på morfologiska förändringar av skleral vävnad under ett optiskt mikroskop.

1.5.3 Immunhistokemisk färgning för TGF- 2-uttryck i skleral vävnad

Två råttor valdes ut från varje grupp. Sklerala vävnadssnitt utsattes för antigenhämtning och blockering, inkuberades med mus anti-TGF- 2 (1:3000) i 24 timmar, tvättades, inkuberades med sekundär antikropp (1:2000) i 1 timme, framkallades rutinmässigt och motfärgades, monterades med neutral balsam, och 2-3 observerade vävnadsförändringar togs under ett optiskt mikroskop. Gråvärdet för den positiva delen detekterades av ett bildanalyssystem.

1.5.4 Western Blot Detektion av AQP1- och CAV1-proteinuttrycksnivåer i skleral vävnad

Två råttor valdes ut från varje grupp. Scleral tissue was excised, homogenized, and total protein was extracted by adding RIPA lysis buffer. Protein denaturation, quantification, electrophoresis, membrane transfer, and blocking were performed. Primary antibodies AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000), and -actin antibody (1:2000) were added and incubated overnight at 4℃. Secondary antibody (1:2000) was added and incubated at room temperature for 1 hour. ECL reagent was added, and the protein gray value was analyzed with Image Lab software. The ratio of the gray value of the target band to that of -actin was its relative expression level.

1.5.5 RT-PCR-detektion av GLAST- och GLT-1-mRNA-uttryck i skleral vävnad

Den återstående sklerala vävnaden från råttor togs och totalt RNA extraherades enligt Trizol-metoden. Det totala RNA:t mättes med en spektrofotometer och cDNA transkriberades omvänt enligt kitinstruktionerna. RT-PCR-reaktionssystem framställdes med följande reaktionsbetingelser: 75 grader i 30 s, 85 grader i 60 s, 80 grader för glödgning i 30 s, 65 grader för förlängning i 30 s, totalt 40 cykler. Med -aktin som intern referens beräknades de relativa uttrycksnivåerna för glutamat-aspartattransportör (GLAST) och glutamattransportör 1 (GLT-1) med 2⁻ΔΔCt-metoden. Primersekvenser visas i tabell 1. Envägsvariansanalys användes för jämförelse mellan grupper, och LSD-t-test användes för parvis jämförelse mellan grupper. Testnivån:=0.05.