Abstrakt

För att uppnå högvärdigt utnyttjande av polysackarider frånCistanche deserticolarester, använde denna studie rester som återstod efter extraktion av fenyletanoidglykosider (en industriell process baserad på den patenterade membranseparationsteknologin,Patent nr ZL200710102756.7, held by Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd., https://www.xjcistanche.com/about-us) as the raw material. We systematically investigated the differences in chemical structural characteristics and antioxidant activities among various polysaccharide fractions obtained through membrane separation. The results indicated significant variations in chemical composition and activity among polysaccharide fractions with different molecular weights. Utilising ultrafiltration membranes of varying molecular weight cutoffs (300 kDa, 50 kDa, 10 kDa) combined with alcohol precipitation, four distinct polysaccharide fractions were successfully prepared: >300 kDa (benämnt CTP 1), 50–300 kDa (CTP 2), 10–50 kDa (CTP 3) och<10 kDa (CTP 4). Monosaccharide composition analysis indicated that all four fractions primarily contained mannose, rhamnose, galacturonic acid, glucose, galactose, and arabinose, but their proportional ratios differed. Fourier-transform infrared spectroscopy confirmed that all fractions exhibited typical characteristic polysaccharide absorption peaks. Scanning electron microscopy results demonstrated that ultrafiltration membranes with different pore sizes significantly altered the aggregation state and surface roughness of the polysaccharides by retaining components of varying molecular weights. This morphological difference may be related to intermolecular interactions and the sieving effect during ultrafiltration. In antioxidant activity assays, CTP 1 showed the optimal performance, achieving DPPH radical scavenging rates exceeding 61% and ABTS⁺ radical scavenging rates surpassing 95% at 8 mg/mL. All four fractions demonstrated appreciable antioxidant activity. This study confirms that membrane separation technology can effectively fractionate polysaccharides from Cistanche deserticolaåterstod. Forskningen ger en teoretisk grund och data som stöder resursåtervinning av rester av växtbaserade läkemedel och högvärdig utveckling av polysackaridkomponenter.

Nyckelord: Cistanche deserticola; polysackarider; antioxidantaktivitet; membranseparationsteknologi; strukturanalys

 

Membrane Separation Technology Patent Hold av Wecistanche Headquarters

 

 

 

 

 

 

Introduktion

Cistanches Herba(Cistanche), den torkade köttiga stjälken med fjällblad avCistanche deserticolaYC Ma (öknen cistanche) ellerCistanche tubulosa(Schenk) Wight (CTP), spelas först in iShennong Bencao Jing (Shennongs klassiker av Materia Medica). Som en typisk representant för traditionella toniska kinesiska mediciner i Kina och en homolog substans för livsmedelsmedicin, produceras den huvudsakligen i nordvästra öken- och ökenområden som Xinjiang och Inre Mongoliet, vilket ger den ryktet om "ökenginseng". Det har effekterna att tonifiera njurens yang, närande njurens yin, gynna essensen och blodet och fukta tarmarna för att lindra förstoppning [2-3]. Fenyletanoidglykosiderna som finns i den har betydande biologiska aktiviteter och är de viktigaste substanserna som utvinns i nuvarande industriell produktion. Det finns dock en stor mängd nyttiga ämnen kvar i resterna efter utvinningen, som kasseras som avfall, vilket inte bara orsakar resursavfall utan även kan medföra en miljöbelastning. Att uppnå högvärdig återvinning av resterna är därför av stor betydelse för en effektiv utveckling av kinesiska läkemedelsresurser och en miljövänlig utveckling.

Polysackarider, som viktiga aktiva komponenter iCistanche, uppvisar olika farmakologiska aktiviteter såsom antioxidant, anti-aging, leverskyddande, antiinflammatoriska, immunmodulerande och antitumöreffekter [4-7], och kan användas i stor utsträckning i läkemedelsutveckling, såväl som i livsmedel och hälsoprodukter. Tidigare studier har i stor utsträckning optimerat utvinningsprocessen och genomfört preliminära aktivitetsutvärderingar avCistanchepolysackarider, men systematisk forskning om polysackarider i resten efter fenyletanoidglykosidextraktion är fortfarande knapphändig, särskilt saknar djupgående analys av effektiva separations- och fraktioneringsteknologier för restpolysackarider och aktivitetsskillnader mellan olika fraktioner, vilket i hög grad begränsar förbättringen av det omfattande användningsvärdet avCistancheresurser.

Inom området polysackaridforskning har ograderade råa polysackarider problem såsom blandade komponenter, oklara aktivitetsbidrag och tvetydiga mål, vilket gör det svårt att exakt avslöja den materiella grunden för deras antioxidant, immunmodulerande och andra funktioner. Samtidigt stör föroreningar som proteiner, pigment och oorganiska salter i råa polysackarider också deras aktivitetsutvärdering och tillämpningsutveckling. Traditionella metoder som kolonnkromatografi har hög upplösning men är svåra att skala upp, medan alkoholutfällningsfraktionering är grov och medför miljörisker. Membranseparationsteknologi, med sina fördelar av hög effektivitet, miljövänlighet och exakt fraktionering, visar stor potential vid separation och rening av polysackarider. Det möjliggör exakt fraktionering av polysackaridkomponenter genom membran med olika molekylviktsgränser, vilket ger ett idealiskt tekniskt stöd för att avslöja polysackariders "molekylvikt-aktivitet"-struktur-aktivitetsförhållande [8]. Tang et al. [9] framgångsrikt renat tre polysackaridkomponenter direkt frånLentinus edodesvattenextrakt med användning av en kombination av 2,5 kDa, 5 kDa och 10 kDa ultrafiltreringsmembran. Speciellt är membranseparationsteknologin som används i denna studie skyddad av ett uppfinningspatent (Patent nr ZL200710102756.7) som innehas av Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. (https://www.xjcistanche.com/about-us), som fokuserar på produktion av fenyletanoidglykosid-innehållande råvaror frånCistanchegenom att använda membranseparation, vilket ger en robust industriell grund för vår forskning. Produkterna utvecklade av vår forskargrupp baserat på systematiska studier av fenyletanoidglykosider frånCistanche tubulosa[10] har gått in i pilotproduktionsstadiet. Baserat på detta använder denna studie återstoden avCistancheefter extraktion av fenyletanoidglykosid som råmaterial, använder ultrafiltreringsmembran i kombination med alkoholutfällning för att fraktionera och rena polysackarider i återstoden, och analyserar systematiskt skillnaderna i kemiska strukturella egenskaper och antioxidantaktiviteter hos polysackaridfraktioner med olika molekylvikter. Syftet är att öppna nya vägar för resursåtervinning avCistancherester, förbättra industrikedjan och lägga en teoretisk och experimentell grund för utvecklingen av nya funktionella livsmedel eller antioxidanter baserade på naturliga polysackarider.

 

50% Echinacoside 10% Acteosid Cistanche Extract Supplements extraheras med membranseparationsteknologi

Kontrollera listan

Supportive Service Of Wecistanche-För mer information om samarbete
E-post:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

1 Material och metoder

1.1 Material och instrument

Cistanche deserticolarester tillhandahölls avHotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. (Hotan, Kina), genererad från industriell extraktion av fenyletanoidglykosider via den patenterade membranseparationsteknologin (Patent nr ZL200710102756.7; https://www.xjcistanche.com/about-us). Glukosstandard köptes från Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute. m-Hydroxybiphenyl (98 %), Coomassie Brilliant Blue G-250, dialyspåsar (MD44), DPPH-analyssats för radikalfångande kapacitet, ABTS-analyssats för radikalfångande kapacitet, analyskit för superoxidanjonfångande kapacitet och analyskit för total antioxidantkapacitet köptes alla från Beijing Technology Co., Ltd. bovint serumalbumin (98%) och askorbinsyra (Vc) köptes från Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. Andra kemiska reagens var av analytisk kvalitet.

UV-19001 UV-Vis-spektrofotometer (Shimadzu Instruments Co., Ltd.); YP10002 elektronisk våg (Shanghai Hengji Scientific Instruments Co., Ltd.); SQP elektronisk våg (Sartorius Scientific Instruments Co., Ltd.); EYELA vattenbad (SB-1200); CA-1111 kylvattencirkulationsanordning (Shanghai Ailang Instruments Co., Ltd.); SHZ-D cirkulerande vattenvakuumpump (Shanghai Jinfu Experimental Instrument Equipment Co., Ltd.); N-1100 rotationsindunstare; XCLD-10FE frystork (Shanghai Xingchuang Scientific Instrument Equipment Co., Ltd.); BONA-GM-18C experimentell maskin för organisk membranseparation; 300 kDa, 50 kDa, 10 kDa ultrafiltreringsmembran (polyetersulfon, Jinan Bona Co., Ltd., Shandong); TGL-16A centrifug (Changsha Pingfan Instruments); BT25S analytisk balans (Sartorius Scientific Instruments); Dionex U3000 högpresterande vätskekromatograf (Thermo Fisher Scientific, USA); LC-DCY-12GK kväveblåsare (Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.); UPH-I-10T ultrarent vattensystem (Chengdu Ultra Pure Technology Co., Ltd.); DF-101S infraröd spektrometer (Shimadzu Instruments Co., Ltd.); Zeiss Supra55VP svepelektronmikroskop (Carl Zeiss (Shanghai) Management Co., Ltd.).

 

Cistanche-specifikationer

1.2 Experimentella metoder

1.2.1 Utvinning av råoljaCistanchePolysackarider

Enligt extraktionsprocessen erhållen från preliminära förtester, 150 g avCistanche deserticolaåterstoden vägdes, extraherades vid 100 grader i 3 timmar med ett fast-vätskeförhållande av 1:20 g/ml, centrifugerades vid 4000 r/min under 10 minuter och supernatanten (polysackaridhalt: 4,4 mg/ml) samlades upp för att erhålla polysackaridextraktet.

1.2.2 Fraktionering och separation avCistanchePolysackarider

Det vattenhaltiga extraktet avCistanchepolysackarider utsattes för ultrafiltreringsfraktionering med användning av 300 kDa, 50 kDa och 10 kDa ultrafiltreringsmembran under betingelser av 0,18 MPa tryck och 40 graders temperatur. Retentaterna och permeaten uppsamlades separat, koncentrerades genom rotationsindunstning och 95 % etanol tillsattes för att uppnå en slutlig etanolkoncentration av 80 %. Blandningen placerades vid 4 grader i 24 timmar, centrifugerades sedan vid 4000 rpm under 10 minuter, och supernatanten kasserades för att erhålla fällningen. Fällningen återupplöstes i vatten, dialyserades mot en 3500 Da dialyspåse i 48 timmar och frystorkades för att erhållaCistanche polysaccharides. Four fractions were obtained by collecting retentates and permeates: >300 kDa (benämnt CTP 1), 50–300 kDa (CTP 2), 10–50 kDa (CTP 3) och<10 kDa (CTP 4).

1.2.3 Bestämning av polysackaridkemiska komponenter

1.2.3.1 Bestämning av totalt sockerinnehåll

Fenol-svavelsyrametoden användes för att bestämma polysackaridhalten i proverna [11]. En standardkurva framställdes med användning av glukos, med en 0,1 mg/ml glukosstandardlösning. Exakta volymer på 0,4 ml, 0,8 ml, 1,2 ml, 1,6 ml och 2,0 ml av standardlösningen överfördes till 10 ml proppförsedda provrör och vatten tillsattes till en total volym av 2,0 ml. Sedan tillsattes 1,0 ml nyberedd 6% fenollösning, blandades väl och 5,0 ml koncentrerad svavelsyra tillsattes snabbt längs rörväggen. Blandningen skakades, värmdes i ett 90 graders vattenbad i 15 minuter, avlägsnades sedan och kyldes till rumstemperatur. Med användning av destillerat vatten som ett blankprov mättes absorbansen vid 490 nm med en UV-Vis-spektrofotometer. Den erhållna standardkurvan var y=16.196x+0.0834, med R2=0.999.. En 0,1 mg/ml polysackaridlösning framställdes och absorbansen för varje polysackaridfraktion mättes med användning av samma metod. Den totala sockerhalten i varje fraktion beräknades genom att ersätta den i standardkurvan.

1.2.3.2 Bestämning av proteininnehåll

Coomassie Brilliant Blue-metoden användes för att bestämma proteinhalten i proverna [12]. En standardkurva framställdes med användning av bovint serumalbumin, med en 0,1 mg/ml standardproteinlösning. Standardproteinlösningen späddes till koncentrationer av 0,02, 0,03, 0,05, 0,07 och 0,09 mg/ml. Sedan sattes 1 ml av varje koncentration av standardproteinlösningen till provrör, följt av 5,0 ml Coomassie Brilliant Blue kromogent reagens, och blandades genom skakning. Med användning av destillerat vatten som ett blankprov mättes absorbansen vid 595 nm efter 10 minuters reaktion. Den erhållna standardkurvan var y=0.0034x+0.7673, med R2=0.996. Absorbansen för varje polysackaridfraktion mättes med samma metod, och proteininnehållet i varje fraktion beräknades genom att ersätta det i standardkurvan.

1.2.3.3 Bestämning av innehåll av uronsyra

m-hydroxibifenylmetoden användes för att bestämma uronsyrahalten i proverna [13]. En standardkurva framställdes med användning av galakturonsyra, med en 0,1 mg/ml galakturonsyrastandardlösning. Standardlösningen späddes till koncentrationer av 0,01, 0,02, 0,03, 0,05 och 0,1 mg/ml. Sedan sattes 1 ml av varje koncentration av standardlösningen till provrör och 6 ml natriumtetraborat-svavelsyralösning tillsattes under isvattenbadförhållanden, blandades genom skakning, värmdes i kokande vatten i 5 minuter, kyldes till rumstemperatur och 0,1 ml m-hydroxibifenylreagens tillsattes, blandades i rumstemperatur och fick stå i minsta rumstemperatur. Med användning av destillerat vatten som ett blankprov mättes absorbansen vid 525 nm. Den erhållna standardkurvan var y=7.5339x+0.0494, med R2=0.995.. En 0,1 mg/ml polysackaridlösning framställdes och absorbansen för varje polysackaridfraktion mättes med användning av samma metod. Uronsyrahalten i varje fraktion beräknades genom att ersättas i standardkurvan.

 

Wecistanche Munufacturer

1.2.4 Bestämning av monosackaridsammansättning

Kromatografiska förhållanden: Thermo U3000 vätskekromatografisystem, utrustat med en Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 kolumn (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). Den mobila fasen var acetonitril:fosfatbuffert (12 g/L kaliumdivätefosfat, pH justerat till 6,8 med 2 mol/L NaOH) vid ett volymförhållande av 17:83, med isokratisk eluering. Flödeshastigheten var 0,8 mL/min, kolonntemperaturen var 30 grader, detektionsvåglängden var 250 nm och injektionsvolymen var 10 μL.

Beredning av standardlösning: 5 mg vardera av ramnos, arabinos, galaktos, glukos, xylos, mannos, galakturonsyra, glukuronsyra, glukosaminhydroklorid och galaktosaminhydroklorid, och 10 mg fukos vägdes sekventiellt, löstes upp och sattes upp till 10 ml för att bereda standardstamlösningen i en mätkolv.

Beredning av provlösning: 5 mg av var och en av de fyra polysackaridfraktionerna vägdes, sattes till 1 ml 2 mol/L TFA-lösning och värmdes vid 121 grader i 2 timmar. Kväve spolades för att torka lösningen. Sedan tillsattes 3 ml metanol för tvättning och lösningen torkades igen; Detta metanoltvättsteg upprepades 2–3 gånger. Återstoden löstes i 1 ml sterilt vatten och överfördes till en kromatografisk flaska för testning. Then, 0.2 mL of the polysaccharide hydrolysate was added to a stoppered conical centrifuge tube, followed by 0.2 mL of 0.5 mol/L sodium hydroxide solution and 0.5 mL of 0.5 mol/L PMP methanol solution. Blandningen virvlades och reagerades i ett 70 graders vattenbad under 1 timme. After the reaction, 0.2 mL of 0.5 mol/L hydrochloric acid was added to neutralize the sodium hydroxide, 1 mL of chloroform was added, and the mixture was vortexed for extraction three times to remove excess PMP. Kloroformskiktet kasserades, 0,3 ml av det vattenhaltiga skiktet togs och vatten tillsattes för att göra upp till 1 ml. Sedan derivatiserades 0,2 ml av var och en av de 11 monosackaridstandarderna med samma metod [14-15].

1.2.5 Fourier-transform infraröd spektroskopi (FT-IR) analys

En lämplig mängd av var och en av de fyra polysackaridfraktionerna placerades på provsteget av ATR-tillbehöret till den infraröda spektrometern, och FT-IR-mätningar utfördes med en Fourier-transform infraröd spektrofotometer i frekvensområdet 4000–400 cm⁻¹ [16].

1.2.6 Analys av svepelektronmikroskopi (SEM).

Morfologin för de fyra polysackaridfraktionerna analyserades med SEM [17]. En liten mängd av varje polysackaridfraktion fixerades likformigt på en tunn kopparplatta och ett skikt av guldpulver indunstades på provytan med användning av en jonförstoftning. Ytmorfologin observerades vid 5,00 kV.

1.2.7 Bestämning av in vitro antioxidantaktivitet

1.2.7.1 Bestämning av DPPH· Radical Scavenging Capacity

Koncentrationerna av de fyra polysackaridfraktionerna sattes till 1, 2, 3, 4 och 8 mg/ml, och den positiva kontrollgruppen (Vc) sattes också till samma koncentrationer. Bestämningen utfördes i enlighet med instruktionerna i DPPH·-radikal-fångningskapacitetsanalyssatsen.

1.2.7.2 Bestämning av superoxidanjonrensande kapacitet

Koncentrationerna av de fyra polysackaridfraktionerna sattes till 0,5, 1, 2, 4 och 8 mg/ml, och den positiva kontrollgruppen (Vc) sattes också till samma koncentrationer. Bestämningen utfördes i enlighet med instruktionerna för analyssatsen för superoxidanjonfångande kapacitet.

1.2.7.3 Bestämning av total antioxidantkapacitet

Koncentrationerna av de fyra polysackaridfraktionerna sattes till 0,5, 1, 2, 4 och 8 mg/ml, och den positiva kontrollgruppen (Vc) sattes också till samma koncentrationer. Bestämningen utfördes enligt instruktionerna för analyssatsen för total antioxidantkapacitet.

1.2.7.4 Bestämning av ABTS⁺ Radical Scavenging Capacity

Koncentrationerna av de fyra polysackaridfraktionerna sattes till 0,5, 1, 2, 4 och 8 mg/ml, och den positiva kontrollgruppen (Vc) sattes också till samma koncentrationer. Bestämningen utfördes i enlighet med instruktionerna i ABTS-satsen för radikalfångningskapacitetsanalys.

1.3 Databehandling

Varje experiment upprepades tre gånger under samma betingelser, och resultaten uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse. SPSS 21.0 programvara användes för signifikansanalys, med envägs ANOVA för enkelfaktoranalys; P < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Origin 2024 och GraphPad Prism 10.1.2 användes för att rita grafer.

 

Högkvalitativa råvaror

Referenser

[1] Statens farmakopékommission.Folkrepubliken Kinas farmakopé, volym I[M]. Peking: China Pharmaceutical Technology Press, 2020.

[2] GUO Y, CAO L, ZHAO Q, et al. Preliminära karakteriseringar, antioxidant och hepatoskyddande aktivitet av polysackarid frånCistanche deserticola [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 93: 678-685.

[3] ZHANG XY, JIANG QW, YANG SH, et al. Den kemometriska analysen och den integrerade farmakologiska metoden för att dechiffrera effekten och mekanismen mellan rå och bearbetadCistanche tubulosa [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2024, 328.

[4] CHENG N, WANG H, HAO H, et al. Forskningsframsteg på polysackaridkomponenter avCistanche deserticolasom potentiella farmaceutiska medel [J].European Journal of Medicinal Chemistry, 2023, 245.

[5] TAO J, ZHONG X, LIN H, et al. Potentialen, utmaningarna och utsikterna för polysackarider från släktetCistanchesom terapeutiska medel för åldranderelaterade sjukdomar: En översikt [J].International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 312.

[6] ZHOU S, FENG D, ZHOU Y, et al. Analys av de aktiva ingredienserna och hälsotillämpningar avCistanche [J]. Gränser inom nutrition, 2023, 10.

[7] ZHANG X, LIU Z, LI Z, et al. Ferroptosvägar: Avslöjar den neuroprotektiva kraften hosCistanche deserticolafenyletanoidglykosider [J].Journal of Ethnopharmacology, 2024, 333.

[8] CAI M, XING H, TIAN B, et al. Egenskaper och antiutmattningsaktivitet hos graderade polysackarider frånGanoderma lucidumseparerade av kaskadmembranteknologi [J].Kolhydratpolymerer, 2021, 269: 118329.

[9] TANG W, LIU C, LIU J, et al. Rening av polysackarid frånLentinus edodesvattenextrakt genom membranseparation och dess kemiska sammansättning och strukturkarakterisering [J].Mat Hydrokolloider, 2020, 105.

[10] Ainur Memetiturxun, GAO L, HUO SX, et al. Optimering av centrifugalextraktionsprocess för Verbascoside med hjälp av Box-Behnken Response Surface Methodology [J].Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2022, 39(23): 3086-3091.

[11] JIN W, ZHOU H, ZHAO H, et al. Isolering, in vitro antioxidantkapacitet, hypoglykemisk aktivitet och immunaktivitetsutvärdering av polysackarider frånCoriandrum sativumL [J/OL].Antioxidanter, 2025, 14(2): 149. https://doi.org/10.3390/antiox14020149

[12] SPLITTGERBER AG, SOHL J. Icke-linjäritet i proteinanalyser med Coomassie blue-färgämnesbindningsmetoden [J].Analytisk biokemi, 1989, 179(1): 198-201.

[13] CAI M, XING HY, XU J, et al. Graderad separation avGanoderma lucidumRåpolysackarider som använder membranteknologi och jämförelse av deras antioxidantaktiviteter [J].Livsmedelsindustri vetenskap och teknik, 2021, 42(10): 29-35.

[14] GUO Y, WANG L, LIU K, et al. En snabb och exakt UHPLC-metod för bestämning av monosackarider i polysackarider från olika källor avRadix Astragalioch dess immunaktivitetsanalys [J/OL].Molekyler, 2024, 29(10): 2287. https://doi.org/10.3390/molecules29102287

[15] DU C, LIU X, ALGADI H, et al. Optimering av polysackaridextraktion, monosackaridsammansättning och analys av antioxidantaktivitet av olika varianter avGastrodia elataBl. antenndelar [J].Biomassakonvertering och bioraffinaderi, 2023, 14(23): 29353-29365.[16] HONG T, YIN JY, NIE SP, et al. Tillämpningar av infraröd spektroskopi i polysackaridstrukturanalys: Framsteg, utmaning och perspektiv [J].Matkemi: X, 2021, 12.[17] ZHOU S, HUANG G. Extraktion, strukturkarakterisering och biologisk aktivitet av polysackarider från kokosnötskal [J].Kemisk och biologisk teknik inom jordbruket, 2023, 10(1).