Abstrakt

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight, en dyrbar matmedicinsk homolog ört från familjen Orobanchaceae, odlas allmänt i södra Xinjiang i Kina. Dess huvudsakliga bioaktiva fenyletanoidglykosidbeståndsdelar,echinakosidochakteosid (verbaskosid), levererar flera farmakologiska aktiviteter inklusive antioxidation, antiinflammation och immunreglering. Ostandardiserade traditionella bearbetningsförfaranden orsakar ofta betydande förluster av dessa kärnaktiva föreningar, vilket begränsar användningen av medicinska och funktionella livsmedel avCistanche tubulosaavkoksbitar. Denna forskning syftade till att optimera moderna processparametrar för färskCistanche tubulosaskivor för att maximera återhämtningen av akteosid och echinakosid, och ytterligare klargöra den antioxidativa stressen och den antiinflammatoriska bioaktiviteten samt den underliggande molekylära mekanismen för optimalt bearbetade avkoksbitar på cellnivå.

Enfaktorexperiment utfördes för att screena lämpliga intervall för skivtjocklek, ångningstid och ugnstemperatur. En tre-faktor tre-nivå Box-Behnken svarsyta metod antogs för att upprätta multi-faktor interaktionsmodeller, med användning av acteosid och echinacoside innehåll som dubbla utvärderingsindikatorer. Därefter byggdes lipopolysackarid (LPS)-stimulerad RAW264.7 musmakrofagcellmodell för att simulera lipidperoxidation och akut inflammatorisk skada. En serie biokemiska analyser inklusive MTT, ROS fluorescensdetektion, ELISA och Western blot implementerades för att bedöma antioxidativ stressstyrka och utforska signaltransduktionsvägar.

Enligt experimentella resultat bestämdes de optimala bearbetningsparametrarna som skivtjocklek på 0,6 cm, ångbehandling i 6 minuter och torktemperatur inställd på 57 grader. Under detta praktiska bearbetningsförhållande nådde de uppmätta halterna av akteosid och echinakosid 7,25 % respektive 31,62 %, vilket visade god överensstämmelse med teoretiska prediktionsvärden. Cellbaserade analyser visade att det var optimalt bearbetatCistanche tubulosaextrakt från avkok reducerade signifikant koncentrationerna av kväveoxid (NO) och malondialdehyd (MDA) i LPS-utmanade RAW264.7-makrofager. Samtidigt ökade det markant intracellulära antioxidantenzymaktiviteter av superoxiddismutas (SOD), katalas (CAT), laktatdehydrogenas (LDH), tillsammans med ökat innehåll av glutation (GSH). Sekretionsnivåerna av pro-inflammatoriska mediatorer inklusive TNF‑, IL‑1 och IL‑6 undertrycktes också på ett dosberoende sätt. Western-blot-detektion validerade detCistanche tubulosaextrakt begränsade överdriven fosforylering av nyckelproteiner inom p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalkaskader.

Sammanfattningsvis förbättrar detta optimerade moderna bearbetningsprotokoll effektivt utbytet av karakteristiska fenyletanoidglykosider (akteosid och echinakosid) iCistanche tubulosaavkoksbitar. Bearbetat örtmaterial utövar framträdande antioxidativ stress och antiinflammatoriska effekter i LPS-inducerad makrofagskadamodell, vars farmakologiska mekanism delvis realiseras genom att hämma överaktivering av p38/AKT/JNK/NF-κB inflammatorisk signalaxel. Detta arbete ger tillförlitliga tekniska parametrar för standardiserad industriell tillverkning och tillhandahåller experimentellt stöd för utveckling av antioxidantfunktionell mat som härrör frånCistanche tubulosa.

Nyckelord: Cistanche tubulosa; teknologi för bearbetning av avkok; akteosid; echinakosid; antioxidativ stress; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB signalväg

1. Introduktion

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight tillhör familjen Orobanchaceae, och dess köttiga fjällande stam är den officiella medicinska delen. Denna medicinalväxt i öknen är till stor del planterad i torra södra Xinjiang, Kina. I traditionell kinesisk örtpraxis,Cistanche tubulosafungerar som en klassisk stärkande ört med dokumenterade terapeutiska funktioner som tonifierar njur-yang, fyller på essens-blod och avslappnande tarmrörelser. Kliniskt används det för att lindra ömhet-svaghet i lumbus och knän, infertilitet orsakad av njurbrist, och torr tarm-inducerad förstoppning维普期刊.

Fenyletanoidglykosider står för de mest kritiska bioaktiva markörerna förCistanche tubulosa. Den kinesiska farmakopén föreskriver att den totala halten av echinakosid plus akteosid inte bör vara mindre än 1,50 % för kvalificerade läkemedelsmaterial. Ändå nuvarande mainstream tillverkning avCistanche tubulosaavkoksbitar följer fortfarande för det mesta uråldriga manuella arbetsflöden: blötläggning av färska råa örter, fuktning ordentligt, skivning och naturlig torkning eller bearbetning av vinångning. Dessa konventionella tillvägagångssätt saknar exakta kvantitativa tekniska specifikationer. Termisk instabilitet hos fenyletanoidglykosider leder ofta till allvarlig nedbrytning av aktiva ingredienser under bearbetning, vilket sänker slutproduktens kvalitet och begränsar storskalig produktion av hög kvalitet. För närvarande är det bara begränsad forskning som samtidigt kombinerar processteknologisk optimering med validering av biologisk aktivitet. de flesta studier upptäcker bara innehåll av kemiska beståndsdelar utan cellulär funktionsverifiering, vilket skapar luckor för industriell omvandling.

Oxidativ stress fungerar som en central patologisk trigger för flera kroniska metabola och inflammatoriska sjukdomar. Överdriven ackumulering av reaktiva syrearter (ROS) stör redoxhomeostas, vilket ytterligare provocerar överaktivering av makrofager och massiv pro-inflammatorisk-cytokinfrisättning, vilket bildar en ond cirkel mellan oxidation och inflammation. Befintliga farmakologiska undersökningar har bevisat detCistancheFenyletanoidglykosider med ursprung har antioxiderande och antiinflammatoriska egenskaper. Tidigare djurförsök visade detCistanche tubulosatotala glykosider förbättrade leverskadan i sepsisgnagarmodeller genom att aktivera Nrf2/HO-1 antioxidantsignalering. Lignan-glykosidkomponenter isolerade frånCistanche tubulosakunde mildra LPS-provocerade inflammatoriska svar via modulerande PI3K/AKT-väg i RAW264.7-makrofager. Huruvida avkoksbitar tillverkade under nyligen optimerade bearbetningsförhållanden bibehåller potent antioxidativ stressbioaktivitet har dock inte utvärderats systematiskt. Den konkreta molekylära regleringsmekanismen kräver fortfarande djupare utforskning.

Den LPS-stimulerade makrofagen RAW264.7 är en väl accepterad modell för in vitro inflammation-oxidativ-skada, allmänt använd för att bedöma naturliga produkters antioxidant- och antiinflammatoriska effekter. I den här studien utför vi först enfaktorscreening följt av Box-Behnken respons-ytaoptimering för att erhålla standardiserade tekniska parametrar för skivning-ångning-torkning som är inriktade på höga akteosid- och echinakosidutbyten. Efter att ha erhållit optimerade avkoksprodukter förbereder vi örtextrakt och använder LPS-inducerad RAW264.7 cellulär skademodell. Flera experimentella plattformar inklusive mätning av oxidativ-stress-biokemiska markörer, cytokin-ELISA-kvantifiering och Western-blot-väganalys används för att klargöra antioxidativ stresseffektivitet och signaltransduktionsmekanism. Denna forskning levererar praktiska processparametrar för produktion i pilotskala av hög kvalitetCistanche tubulosaavkoksbitar med stabil antioxidativ stressaktivitet och lägger experimentell grund för efterföljande utveckling av funktionell mat och kosttillskottsprodukter från XinjiangCistanche tubulosaresurser.

2. Material och metoder

2.1 Råmaterial, reagens och instrument

FärskCistanche tubulosaköttiga stjälkar skördades på hösten från Hotan, den autonoma regionen Xinjiang Uyghur, Kina. RAW264.7 mus-monocyt-makrofag leukemicellinje köptes från Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina). Acetonitril och metanol av kromatografisk kvalitet levererades av Merck (Tyskland). Referensstandardämnen echinakosid och akteosid (renhet Större än eller lika med 98 %) erhölls från Beijing North Weiye Metrology Technology Research Institute. Dimetylsulfoxid (DMSO) köptes från Sigma-VETEC (USA). DMEM högglukosmedium, BCA totalproteinanalyskit var produkter från Thermo Fisher Scientific (USA). Fetalt bovint serum (FBS) köptes från BI (Israel). Penicillin-streptomycin dubbelantikroppslösning kom från HyClone (USA). Kommersiella analyssatser för NO, MDA, SOD, CAT, GSH förvärvades från Beyotime Biotechnology (Shanghai, Kina). LDH-detektionskit och lipopolysackarid (LPS,E. coli055:B5) erhölls från Solarbio (Peking, Kina).

Viktiga laboratorieinstrument inkluderade Shimadzu högpresterande vätskekromatografi (HPLC), LabTech rotationsindunstare, swing-typ höghastighets pulveriserare för kinesiska örter, termostatisk blästrarkugn, ångkärlsutrustning, BioTek SYNERGY-4-mode-läsare, mikroplattor HFA 1, microplate-läsare, 1 mikroplattor, HFA elektronisk analytisk våg, CF1524R kyld centrifug, BSC-1300IIA2 biosäkerhetsskåp och BDS200-PH inverterat optiskt mikroskop.

2.2 Single-Factory Processing Experiment

FärskCistanche tubulosaköttiga stjälkar skars i skivor av olika tjocklek (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Skivorna ångades under olika varaktigheter (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Efteråt torkades material under olika temperaturgradienter (omgivningstemperatur 25 grader, 40 grader, 50 grader, 60 grader, 70 grader, 80 grader). Fullt torkade prover av avkoksbitar pulveriserades och siktades genom en 40-mesh sikt för efterföljande HPLC-komponentkvantifiering.

2.3 Bestämning av akteosid- och echinakosidinnehåll

Beredning av provlösning: Väg noggrant upp 1,0 g pulveriserat avkokspulver i en konisk kolv med propp. Tillsätt 100 ml 50 % metanollösning exakt. Utför 30 min blötläggning följt av 40 min ultraljudsextraktion. Efter avkylning, fyll på viktminskning av lösningsmedel med 50 % metanol, blanda jämnt och tillåt statisk sättning. Supernatanten filtrerades genom 0,22 μm mikroporöst membran för HPLC-injektion.

Beredning av referensstandardlösning: Väg noggrant upp lämplig mängd akteosid- och echinakosidreferensämnen, lös upp med 50 % metanol i mätkolvar, förbered standardlösningar med seriell gradient, filtrera med 0,22 μm filtermembran.

Kromatografisk uppställning: COSMOSIL C₁8 analytisk kolonn; mobilfassystem: mobilfas A: 0,1 % vattenlösning av fosforsyra; mobil fas B: acetonitril. Detektionsvåglängden sattes till 330 nm; kolonntemperatur 35 grader; flödeshastighet 1 ml/min. En extern standardmetod användes för kvantitativ beräkning av innehållet av akteosid och echinakosid. Omfattande utvärderingspoäng=(echinakosidinnehåll × 50 %) + (akteosidinnehåll × 50 %). Omfattande poäng fungerade som sammansatt bedömningsindikator för prestanda för bearbetningstillstånd.

2.4 Box-Behnken Response-Surface Experimental Design

Baserat på enfaktorsexperimentella resultat användes Design-Expert 13.0-programvaran för att implementera Box-Behnken tre-faktors tre-nivå experimentellt arrangemang. Skivtjocklek (X₁, cm), ångbehandlingstid (X₂, min), torkningstemperatur (X₃, grad ) valdes som oberoende variabler. Akteosidhalt (Y^, %) och echinakosidhalt (Y^, %) var svarsvärden. Sjutton grupper av experiment genomfördes. Nollnivån för varje faktor valdes enligt optimal parameter som erhållits i enfaktortest. Efter att ha avslutat respons-ytförsök, slutfördes modellvariansanalys, 3D-respons-ytplotting och tillståndsprediktion. Praktiska verifieringsexperiment utfördes efter justering av teoretiska förutsagda parametrar till verkliga verkliga produktionsvärden.

2.5 Cellodling och provberedning

Råmaterial av avkoksbitar tillverkades under optimerade bearbetningsförhållanden. Örtpulver extraherades enligt ovannämnda provberedningsprotokoll, koncentrerades genom rotationsindunstning och vakuumtorkades för att erhålla fast extraktpulver. Stamlösning framställdes genom att lösa extraktpulver i DMSO, ytterligare utspädd med komplett DMEM-medium (innehållande 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin) för cellulära experiment; slutlig DMSO-arbetskoncentration kontrollerades under 0,1 % (v/v). RAW264.7 makrofager odlades i DMEM komplett medium under 37 grader, 5 % CO2 fuktad inkubatormiljö.

2.6 MTT-cytotoxicitetsanalys

RAW264.7-celler såddes på mikroplattor med 96 brunnar vid celltäthet på 8 × 10⁴ celler/ml. Experimentella grupper inkluderade lösningsmedelskontrollgrupp (0,1 % DMSO-medium), LPS-modellgrupp (slutlig LPS-koncentration 1 ug/ml) och fleraCistanche tubulosaextraktkoncentrationsgrupper (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Efter 2 timmars förinkubation med örtprov kompletterades LPS (1 ug/ml slutkoncentration) till varje grupp förutom lösningsmedelskontrollgruppen. Inkubationen fortsatte under 24 timmar. Sedan tillsattes MTT-reagens (5 mg/ml) och inkuberades i 4 timmar. Kassera supernatanten, tillsätt 150 μL DMSO per brunn, skaka vid 37 grader i 15 min. Absorbansvärdet vid 490 nm våglängd avlästes på mikroplattläsare och cellöverlevnadshastigheten beräknades. Säkert arbete-koncentrationsområde fastställdes för uppföljande funktionstester.

2.7 Intracellulär ROS-mätning

RAW264.7-makrofager inokulerades på plattor med sex brunnar med en täthet av 4 × 10⁵ celler per brunn. Efter cellvidhäftning utfördes grupperingsbehandling: lösningsmedelskontrollgrupp, LPS-modellgrupp och CT-extraktbehandlingsgrupper (12,5, 25, 50, 100 ug/ml). Efter 2 timmars förbehandling med prov tillsattes LPS 1 ug/ml förutom lösningsmedelskontrollgruppen, inkubera 24 timmar. Intracellulär ROS-nivå detekterades med hjälp av fluorescerande sondladdningsmetod enligt kitinstruktionerna. Fluorescensintensiteten mättes med fluorescensmikroplattläsare (excitation 488 nm, emission 525 nm).

2.8 Detektion av NO, MDA, SOD, CAT, LDH och GSH

Efter motsvarande cellbehandling samlades cellkultursupernatanten in för NO-mätning med hjälp av Griess-reaktion. Fästa celler tvättades med förkyld PBS, lyserades på is, cellysatsupernatanten skördades efter centrifugering (10 000 r/min, 4 grader, 5 min). BCA-kit bestämde den totala proteinkoncentrationen för varje prov. Innehållet i MDA-, GSH- och enzymaktivitetsindikatorer SOD, CAT, LDH analyserades strikt enligt satsens bruksanvisningar.

2.9 ELISA-bestämning av pro-inflammatoriska cytokiner

RAW264.7-celler fick provförbehandling och LPS-stimulering i totalt 16 timmar. Cellkultursupernatant samlades upp och centrifugerades. Koncentrationer av TNF‑, IL‑1, IL‑6 i supernatanten kvantifierades med kommersiella ELISA-kit.

2.10 Western-blot-analys

Efter 45 minuter av LPS och saminkubation av prov lyserades RAW264.7-celler med RIPA-lysbuffert kompletterad med proteas-fosfatasinhibitorcocktail. Cellysat centrifugerades vid 10 000 r/min under 4 grader under 5 min. BCA-kit kvantifierad totalproteinkoncentration. Provproteiner (50 ug per bana) denaturerades vid 100 graders metallbad under 5 min. SDS-PAGE gelelektrofores separerade målproteiner, som sedan överfördes till PVDF-membran. Membran blockerades i 1 timme med 5 % skummjölk TBST-lösning. Primära antikroppar riktade mot p38, p-p38, AKT, p-AKT, JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65 och GAPDH inkuberades över natten vid 4 grader. Efter TBST-tvättning inkuberades motsvarande sekundära antikroppar vid rumstemperatur under 1 timme. Efter upprepad tvätt applicerades ECL ultrakänsligt kemiluminescerande reagens för proteinbandsavbildning. Kvantitativ bandanalys i gråskala implementerades för att utvärdera relativ fosforyleringsproteinexpressionsnivå.

2.11 Statistisk analys

GraphPad Prism 8.0.2-programvaran användes för statistisk beräkning och grafritning. Experimentella kvantitativa dataresultat uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Envägs ANOVA följt av post-hoc multipla jämförelsetester användes för jämförelse mellan grupper. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Experimentella resultat

3.1 Resultat av enfaktorsexperiment

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) hindrade frisättning av inre ämnen, vilket sänker det slutliga innehållet av detekterbara komponenter. Under fast ångtid (10 min) och torkningstemperatur (60 grader) uppnådde 0,4 cm skivtjocklek högsta utvärderingspoäng.

Resultat av ångbehandlingens varaktighet: när skivtjockleken var fixerad till 0,4 cm och torktemperaturen hölls vid 60 grader kunde otillräcklig ångtid inte tillräckligt förstöra växtcellstrukturen så att aktiva föreningar var svåra att lösa upp. När ångtiden översteg 6 minuter skadade överångning örtvävnad och inducerade nedbrytning av echinakosid och akteosid. Därför identifierades 6 minuter preliminärt som en föredragen ångbehandlingslängd.

För ugnstorkande temperaturgradientexperiment: skivtjocklek 0,4 cm och ångtid 6 min fastställdes. Komponentinnehållet steg med ökande torktemperatur inom ett visst intervall. När torkningstemperaturen översteg 60 grader orsakade termisk sönderdelning vid hög temperatur en anmärkningsvärd minskning av innehållet av målämne. Därför valdes 60 grader som initialt optimalt torktemperaturförhållande för efterföljande optimering av responsytan.

3.2 Box-Behnken Response-Surface Optimization and Verification

Sjutton grupper av Box-Behnken experimentella körningar avslutades enligt designmatris. Variansanalysresultat visade att regressionsmodeller för både akteosid- och echinakosidinnehåll uppnådde statistisk signifikans (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >skivtjocklek.

Genom matematisk modellberäkning var teoretiska optimala bearbetningsparametrar: skivtjocklek 0,600 cm, ångbehandlingstid 5,685 min, torktemperatur 57,009 grader. Med tanke på den faktiska genomförbarheten för industriell drift, justerades parametrarna till skivtjocklek 0,6 cm, ångtid 6 min, torktemperatur 57 grader. Tre parallella valideringsexperiment utfördes. Under detta praktiska tillstånd var den uppmätta akteosidhalten 7,25 %, echinakosidhalten nådde 31,62 %. Avvikelsen mellan uppmätta värden och teoretisk förutsägelse stannade under 5 %, vilket bevisade att denna responsytemodell var tillförlitlig och användbar för att styra verklig produktion av avkok.

3.3 Cytotoxicitetsscreening av optimerad-bearbetadCistanche tubulosaExtrahera i RAW264.7-celler

MTT-cytotoxicitetsresultat avslöjade att extraktkoncentrationer i intervallet 0-100 ug/ml inte utövade någon uppenbar toxisk effekt på RAW264.7-makrofager, och till och med visade mild cellproliferation-främjande tendens. När behandlingskoncentrationen klättrade till 200 ug/mL och 400 ug/mL, minskade cellöverlevnadsgraden signifikant jämfört med lösningsmedelskontrollgruppen, vilket visade koncentrationsberoende cytotoxicitet. Därför valdes koncentrationsgradienter på 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/ml, 100 ug/ml som säkra arbetskoncentrationer för efterföljande oxidativ stress och inflammationsrelaterade cellulära analyser.

3.4 Cistanche tubulosaExtrahera reducerad intracellulär ROS-nivå i LPS-stimulerade makrofager

Jämfört med lösningsmedelskontrollgruppen ökade den intracellulära ROS-fluorescensintensiteten för LPS-modellgruppen extremt signifikant (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaextrakt minskade intracellulär ROS-ackumulering på ett dosberoende sätt. Varje läkemedelsbehandlingsgrupp visade statistiskt signifikant minskning av ROS jämfört med LPS-modellgruppen (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Effekter på NO- och MDA-innehåll

NO fungerar som klassisk inflammatorisk mediator frisatt av aktiverade makrofager. MDA är en guldstandard biomarkör som återspeglar oxidativ skada på lipidperoxidation. Jämfört med lösningsmedelskontrollgruppen höjde LPS-stimulering markant NO- och MDA-halten i RAW264.7-celler (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosaextraktbehandling kan sänka NO-koncentrationen avsevärt. För MDA-indikator: 12,5 ug/ml grupp gav ingen statistiskt signifikant förbättring; 25-100 ug/mL koncentrationsgrupper minskade observerbart MDA-nivån (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Effekter på antioxidantrelaterade biokemiska indikatorer SOD, CAT, LDH, GSH

Efter LPS-utmaning sjönk den intracellulära SOD-, CAT-, LDH-enzymatisk aktivitet såväl som GSH-innehållet kraftigt i förhållande till lösningsmedelskontrollgruppen (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaextrakt av avkok kan återställa cellulär endogen antioxidantförsvarskapacitet mot oxidativa förolämpningar inducerade av LPS.

3.7 Hämmande effekt på pro-inflammatoriskt cytokin TNF‑, IL‑1, IL‑6 frisättning

ELISA-detektionsresultat visade att LPS-stimulering starkt främjade utsöndringen av TNF-, IL-1, IL-6 från RAW264.7-makrofager (\\(P)<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosaextraktbehandlingskoncentration undertrycktes frisättningsmängden av dessa tre viktiga pro-inflammatoriska cytokiner progressivt, vilket visade en tydlig dos-respons-korrelation. Den bekräftade att örtextrakt utövade en kraftfull antiinflammatorisk funktion genom att hålla tillbaka pro-inflammatorisk cytokinutsöndring från aktiverade makrofager.

3.8 Föreskrift om p38/AKT/JNK/NF‑κB Signaling-Pathway Fosforylering

Western-blot experimentella data visade att förhållandena mellan p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK och p-NF-κB/NF-κB var signifikant förhöjda i LPS-modellgruppen jämfört med lösningsmedelskontrollgruppen (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaextraktintervention minskade anmärkningsvärt p‑p38/p38 och p‑JNK/JNK-förhållandet (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaextrakt av avkok lindrade oxidativ-inflammatorisk skada genom att undertrycka hyperfosforyleringsaktivering av p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalnätverket.

4. Diskussion

Traditionella bearbetningskrav registrerade i kinesisk farmakopé förCistanche tubulosaomfattar huvudsakligen borttagning av föroreningar, tvättning, fuktning, skivning och torkning, utan att specificera exakta numeriska parametrar för skivtjocklek, ångningstid och torktemperatur. Icke-standardiserad manuell bearbetning medför stora kvalitetsfluktuationer för kommersiella avkoksprodukter. Fenyletanoidglykosider (echinakosid och acteosid) är termiskt labila bioaktiva föreningar. Felaktig uppvärmningstid eller temperatur kommer att utlösa kemisk nedbrytning och minska det medicinska värdet. Våra enfaktorsexperiment avslöjade att både otillräcklig och överdriven ångning såväl som för hög torktemperatur skulle orsaka förlust av målglykosidkomponenter. Ytterligare Box‑Behnken multifaktoroptimering erhöll praktiska tillverkningsparametrar: skivtjocklek 0,6 cm, ångning 6 min, torkning 57 grader. Under detta tillstånd nådde innehållet av akteosid och echinakosid 7,25 % och 31,62 %, vilket vida översteg farmakopéns minimikvalitetströskel. Detta optimerade protokoll tillhandahåller möjliga kvantitativa tekniska referenser för standardiserad industriell bearbetning av Xinjiang-ursprungCistanche tubulosa.

Oxidativ stress och inflammation är tätt sammanlänkade patologiska processer. Överskott av ROS inducerar lipidperoxidation och genererar MDA, som ytterligare aktiverar medfödda immunmakrofager. Aktiverade makrofager utsöndrar rikligt med NO och flera pro-inflammatoriska cytokiner, som omvänt förstärker intracellulär ROS-produktion och bildar självförstärkande oxidativ-inflammatorisk ond cirkel. Naturliga växtbaserade antioxidantämnen kan bryta denna patologiska loop genom att höja det endogena antioxidantenzymsystemet och begränsa inflammatorisk signaltransduktion. I denna in vitro-studie, optimalt bearbetadCistanche tubulosaextrakt från avkok sänkte ROS-, NO- och MDA-nivåerna, samtidigt som de förbättrade SOD-, CAT-, LDH-aktiviteter och GSH-innehåll i LPS-stimulerade RAW264.7-makrofager. Samtidigt hämmade den TNF-, IL-1, IL-6 pro-inflammatorisk-cytokin-utsöndring, vilket visar integrerad antioxidativ stress och anti-inflammatorisk kapacitet.

Mitogenaktiverade-proteinkinasfamiljens molekyler p38, JNK tillsammans med AKT och NF-κB utgör centrala signaltransduktionsnav som förmedlar inflammatoriska-oxidativa reaktioner från makrofager. Vid LPS-stimulering utlöser uppströmssignalen fosforyleringsaktivering av p38, JNK och AKT, vilket sekventiellt främjar NF-κB p65 subenhetsfosforylering och nukleär translokation. Aktiverat NF-κB fungerar som transkriptionsfaktor och initierar transkription av stora partier av pro-inflammatoriska cytokiner och oxidativ stressrelaterade gener. Våra Western-blot-resultat visade detCistanche tubulosaextrakt kan undertrycka fosforylering av p38, JNK, AKT och NF‑κB p65. Därför drar vi slutsatsen att dess antioxidativa stress och antiinflammatoriska bioaktivitet uppnås, åtminstone delvis, genom att blockera överaktivering av p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalaxeln.

Det finns flera begränsningar inom aktuell forskning. Alla funktionella verifikationer är begränsade till cellodlingsnivå in vitro. Ytterligare djurmodellexperiment in vivo krävs för att verifiera in vivo farmakodynamiska prestanda för optimerade avkoksbitar. Dessutom antog denna studie totalt blandat extrakt från avkoksbitar, så vi kan inte särskilja individuella bidrag från echinakosid, akteosid och andra mindre sekundära metaboliter. Uppföljningsforskning kan isolera monomerföreningar för att jämföra respektive antioxidativ-stressstyrka och utföra undersökningar av kompatibilitetseffekter. Trots detta levererar vårt nuvarande arbete fortfarande praktiska processtekniska parametrar och preliminära mekanistiska bevis för att utvecklaCistanche tubulosarelaterade hälsovårdsprodukter.

5. Slutsats

Sammanfattningsvis kan det moderniserade bearbetningsarbetsflödet optimerat av Box-Behnkens responsytametodik (skivtjocklek 0,6 cm, ångkokning 6 min, torktemperatur 57 grader) avsevärt öka innehållet av akteosid och echinakosid avCistanche tubulosaavkoksbitar. Extrakt framställda av dessa optimalt bearbetade örtskivor utövar framträdande antioxidativ stress och antiinflammatoriska effekter mot LPS-inducerad RAW264.7 makrofagskada. Den underliggande mekanismen är korrelerad med återställande av intracellulärt antioxidantförsvarssystem och hämning av överdriven aktivering av p38/AKT/JNK/NF‑κB inflammatorisk signalväg. Denna studie ger en solid experimentell grund för standardiserad industriell produktion och exploatering av funktionell matCistanche tubulosaresurser.

Referenser

Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Extraktion av echinakosid frånCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight och undersökning av dess skyddande effekt på leverskada hos sepsisråttor. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y, et al. De antiinflammatoriska effekterna av lignanglykosider frånCistanche tubulosastammar på LPS/IFN-inducerade RAW264.7 makrofagceller via PI3K/AKT-vägen. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oxidativ stress och metabola störningar: Patogenes och terapeutiska strategier. Life Sciences, 2016,148:183-193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Anti-inflammatorisk av dise-necionyl cis-khellactone i LPS-stimulerade RAW264.7-celler och dess hämmande aktivitet på lösligt epoxidhydrolas. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin lindrar lipopolysackarid-inducerade inflammatoriska svar i makrofager genom att undertrycka MAPK och NF-κB signalvägar. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. PI3K/AKT-signalvägen vid inflammation, celldöd och gliaärrbildning efter traumatisk ryggmärgsskada. Cell Proliferation, 2022,55(9):e13275.