Abstrakt

Cistanche tubulosaär en värdefull stärkande ört som används i stor utsträckning inom traditionell kinesisk medicin. Fenyletanoidglykosider representerade av echinakosid och akteosid är dess kärnbioaktiva substanser. Denna forskning syftar till att optimera moderna bearbetningsparametrar förCistanche tubulosaavkoksbitar för att förbättra utbytet av echinakosid och acteosid, och ytterligare utforska dess antioxidativa stress och antiinflammatoriska mekanism på cellnivå.

Enfaktorexperiment genomfördes, följt av Box-Behnkens responsytaoptimering med skivtjocklek, ångtid och torkningstemperatur som påverkande faktorer. Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) användes för att detektera innehållet av två markörföreningar. Den LPS-inducerade RAW264.7 makrofagskadamodellen konstruerades för att bedöma farmakologiska aktiviteter. Reaktiva syrearter (ROS), kväveoxid (NO), malondialdehyd (MDA), aktiviteter av antioxidantenzymer inklusive SOD, CAT, LDH och glutation (GSH) innehåll bestämdes. ELISA användes för att testa sekretionsnivån av pro-inflammatoriska cytokiner TNF-, IL-1 och IL-6. Western blot-analys utfördes för att analysera fosforyleringsstatusen för nyckelproteiner i p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalvägen.

De optimala bearbetningsförhållandena var skivtjocklek på 0,6 cm, ångtid på 6 min och torktemperatur på 57 grader. Under detta tillstånd nådde innehållet av akteosid 7,25 % och echinakosid nådde 31,62 %. Extrakt från optimerade avkoksbitar kan avsevärt minska överproduktionen av intracellulär ROS, NO och MDA i LPS-stimulerade RAW264.7-celler. Det förbättrade aktiviteterna av SOD, CAT, LDH och ökade intracellulär GSH-nivå, samtidigt som den markant hämmade frisättningen av TNF-, IL-1 och IL-6. Western-blot-resultat indikerade att extraktet nedreglerade fosforyleringsförhållandet för p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK och p-NF-κB/NF-κB.

Den optimerade bearbetningstekniken för ångande torkning kan effektivt öka återvinningshastigheten för huvudfenyletanoidglykosider avCistanche tubulosa. Avkoksbitar utövar antioxidativa och antiinflammatoriska effekter mot LPS-utlöst cellskada genom att hämma p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalvägen. Denna studie ger praktiska tekniska parametrar för standardiserad industriell bearbetning avCistanche tubulosa, och erbjuder experimentella bevis för utvecklingen av funktionell mat och nutraceutiska produkter härledda från denna växtbaserade resurs.

Nyckelord: Cistanche tubulosa; teknologi för bearbetning av avkok; akteosid; echinakosid; antioxidativ stress; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB-väg

1. Introduktion

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight tillhör familjen Orobanchaceae och dess medicinska del är den torkade köttiga stjälken med fjällblad. I Kina är denna växt huvudsakligen planterad i torra regioner i nordväst, med det största planteringsområdet i södra Xinjiang. Som en välkänd styrkande örtmedicin fungerar den för att tonifiera njur-yang, fylla på essens och blod och fukta tarmarna för att lindra förstoppning. Kliniskt används det för behandling av njur-yang-brist, brist på essens-blod, infertilitet, ömhet och svaghet i midja och knän samt torr tarmförstoppning.

Fenyletanoidglykosider, främst echinakosid och akteosid, är de primära aktiva komponenterna iCistanche tubulosa. Enligt kraven i den kinesiska farmakopén ska det totala innehållet av echinakosid och akteosid i kvalificerade medicinska råvaror inte vara lägre än 1,50 %, vilket fungerar som den kritiska kvalitetsutvärderingsindikatorn. Traditionella behandlingsmetoder förCistanche tubulosa mostly adopt soaking‑moistening, slicing‑drying or wine‑steaming methods. Plenty of studies focus on improving active‑component yield, while researches combining processing‑technology optimization with biological‑activity verification remain insufficient.

Oxidativ stress fungerar som den gemensamma patologiska grunden för flera metabola och inflammatoriska sjukdomar. Befintlig forskning har visat att totala glykosider extraheras frånCistanche tubulosakan undertrycka inflammatorisk respons och aktivera Nrf2/HO‑1-vägen för att lindra leverskada hos sepsisdjur. Lignanglykosidfraktioner från denna ört kan lindra makrofaginflammation genom att reglera PI3K/AKT-signalering. Ändå kräver den farmakologiska egenskapen hos moderna bearbetade avkoksbitar och dess underliggande molekylära mekanism fortfarande ytterligare utforskning.

I den här studien användes Box-Behnkens responsytadesign baserat på enfaktortester, som tog skivtjocklek, ångtid och torkningstemperatur som variabler för att optimera bearbetningsarbetsflödet. Efter att ha erhållit optimala tekniska parametrar etablerades LPS-inducerad RAW264.7-cellmodell för oxidativ skada för att utvärdera antioxidativ stress och antiinflammatorisk kapacitet och dissekera relevant signalmekanism. Detta arbete avser att tillhandahålla stabila och funktionsdugliga bearbetningsparametrar för produktion i pilotskala och lägga experimentell grund för ett omfattande utnyttjande avCistanche tubulosaresurser.

2. Material och metoder

2.1 Växtmaterial, reagenser och instrument

Färska köttiga stjälkar avCistanche tubulosaskördades på hösten från Hotan, Xinjiang. RAW264.7 mus monocyt-makrofag leukemiceller köptes från Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina).

Acetonitril och metanol av HPLC-kvalitet erhölls från Merck Company. Echinakosid (större än eller lika med 98 %) och akteosid (större än eller lika med 98 %) referensstandarder tillhandahölls av Beijing North Weiye Metrology Institute. Dimetylsulfoxid (DMSO) köptes från Sigma-Aldrich. DMEM-högglukosmedium, fetalt bovint serum (FBS), penicillin-streptomycin dubbelantikroppslösning, BCA-proteinkvantifieringskit, analyskit för NO, MDA, SOD, CAT, GSH och LDH, lipopolysackarid (LPS), MTT-reagens och ELISA-cytokiner för alla kommersiella produkter för cytokiner.

Experimentella instrument inkluderade Shimadzu högpresterande vätskekromatograf, rotationsindunstare, pulveriserare för kinesiska örter, termostatisk blästrarkugn, ångkokare, fullvågsläsare för mikroplattor, elektronisk analytisk balans, kyld centrifug, biosäkerhetsskåp och inverterat optiskt mikroskop.

2.2 Enfaktors bearbetningsexperiment

FärskCistanche tubulosaköttiga stjälkar skars i skivor med tjockleken 0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm och 1,2 cm. Skivorna ångades i 3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min respektive 21 min och torkades under olika temperaturgradienter inklusive rumstemperatur (25 grader), 40 grader, 50 grader, 60 grader, 70 grader och 80 grader. Torkade prover av avkoksbitar krossades och siktades genom en 40-mesh sikt för efterföljande upptäckt. Sammansatt poängformel användes för omfattande bedömning: Sammansatt poäng=echinakosidinnehåll × 50 % + akteosidinnehåll × 50 %.

2.3 HPLC-bestämning av akteosid och echinakosid

Beredning av provlösning: väg noggrant 1,0 g pulverprov, tillsätt 100 ml 50 % metanollösning. Efter 30 min blötläggning utfördes ultraljudsextraktion i 40 min. Viktförlusten kompletterades med 50 % metanol efter kylning. Supernatanten filtrerades med 0,22 μm mikroporöst membran före HPLC-injektion.

Blandad referensstandardlösning av akteosid och echinakosid bereddes med 50 % metanol och späddes till seriella koncentrationer för plottning av standardkurvor. Kromatografiska betingelser: COSMOSIL C18 kromatografikolonn; mobilfassystemet bestod av 0,1 % fosforsyravattenlösning (A) och acetonitril (B); detektionsvåglängden sattes till 330 nm; kolonntemperatur 35 grader; flödeshastighet 1 ml/min. En extern standardmetod användes för kvantitativ beräkning av målföreningar.

2.4 Box-Behnken Response-surface Experimental Design

Enligt enfaktorsexperimentella resultat valdes skivtjocklek (X₁), ångtid (X₂) och torkningstemperatur (X₃) ut som oberoende variabler. Akteosidhalt (Yi, %) och echinakosidhalt (Y2, %) fungerade som svarsvärden. Design-Expert 13.0-programvaran användes för att upprätta ett tre-faktor tre-nivå Box-Behnken experimentellt system med totalt 17 grupper av tester. Modellanpassning, variansanalys och parameterförutsägelse fullbordades med mjukvara. Praktiska verifieringsexperiment utfördes i tre exemplar efter justering av teoretiska optimala parametrar för att passa faktisk produktionsdrift.

2.5 Cellodling och provberedning

Prov av avkok erhållet under optimerade bearbetningsförhållanden bereddes till extraktpulver. Pulvret löstes i DMSO och späddes ytterligare med komplett DMEM-medium innehållande 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin för cellexperiment. RAW264.7-celler odlades i fuktad inkubator vid 37 grader med 5 % CO2.

2.6 MTT-analys för cellviabilitet

Cellsuspension inokulerades i 96-brunnars plattor vid celltäthet på 8 × 10⁴ celler/ml. Grupper sattes som lösningsmedelskontrollgrupp (0,1 % DMSO), LPS-modellgrupp (1 ug/ml LPS) och flera koncentrationsgrupper avCistanche tubulosaextrakt (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Efter 2 timmars förinkubation av prover tillsattes LPS med slutkoncentrationen 1 ug/ml förutom lösningsmedelskontrollbrunnar och inkuberades i ytterligare 24 timmar. MTT-lösning (5 mg/ml) tillsattes under 4 timmars reaktion. Efter avlägsnande av supernatanten tillsattes DMSO för att lösa formazankristall. Absorbansvärde vid 490 nm detekterades av mikroplattläsare för att beräkna cellviabilitet. Säkert koncentrationsområde valdes för uppföljande funktionstester.

2.7 Intracellulär ROS-mätning

RAW264.7-celler såddes i 6-brunnars plattor med en täthet av 4 × 10⁵ celler per brunn. Efter vidhäftning till väggen förbehandlades cellerna med gradientkoncentrationCistanche tubulosaextrakt (12,5, 25, 50, 100 ug/ml) i 2 timmar, stimuleras sedan med 1 ug/ml LPS under 24 timmar. Intracellulär ROS-nivå detekterades med fluorescerande sondreagenskit. Fluorescensintensiteten registrerades under excitationsvåglängden 488 nm och emissionsvåglängden 525 nm.

2.8 Detektion av NO, MDA, SOD, CAT, LDH och GSH

Cellkultursupernatant samlades in för att detektera NO-innehåll via Griess-metoden. Celler tvättades med förkyld PBS och lyserades på is. Cellysat centrifugerades vid 10 000 rpm under 4 grader i 5 minuter för att förvärva intracellulär supernatant. MDA-innehåll, enzymaktiviteter för SOD, CAT, LDH och GSH-nivåer mättes strikt i enlighet med kitspecifikationerna. BCA-metoden användes för total-proteinnormalisering.

2.9 ELISA Detektion av pro-inflammatoriska cytokiner

RAW264.7-celler behandlades med prov och LPS i 16 timmar. Odlingssupernatanten uppsamlades och centrifugerades vid 10 000 rpm under 10 min. Sekretionskoncentrationerna av TNF‑, IL‑1 och IL‑6 kvantifierades med ELISA-kit.

2.10 Western blot-analys

Efter 45 minuters intervention av prover och LPS extraherades totalt cellulärt protein med RIPA-lysbuffert. Proteinkoncentrationen kvantifierades med BCA-kit. Lika mängd proteinprov (50 ug för varje bana) denaturerades, separerades med SDS-PAGE-elektrofores och överfördes till PVDF-membran. Membran blockerades med 5 % skummjölk TBST-lösning i 1 timme och inkuberades sedan med primära antikroppar över natten vid 4 grader. Efter upprepad tvättning med TBST inkuberades sekundär antikropp vid rumstemperatur under 1 timme. Målproteinband visualiserades med ECL-kemiluminescensreagens. Bandgråskalaanalys utfördes för att beräkna förhållandet fosforylering-protein/totalprotein.

2.11 Statistisk analys

GraphPad Prism 8.0.2-programvaran användes för grafritning och statistisk analys. Envägs ANOVA och t-test användes för datajämförelse.P < 0.05 represented statistically significant difference; P < 0.01 and P < 0.001 stood for higher significance. All experimental data were expressed as mean ± standard deviation (\(\bar{x}\pm s\)).

3. Resultat

3.1 Enfaktorsexperimentella resultat

Skivtjockleken utövade framträdande inverkan på målglykosidinnehållet. Skivor med 0,2 cm tjocklek var lätta att överångas, vilket orsakade termisk nedbrytning av aktiva ingredienser. För tjocka skivor hindrade frisättningen av inre aktiva substanser. När ångtiden var fixerad till 10 minuter och torkningstemperaturen vid 60 grader var 0,4 cm den optimala skivtjockleksparametern i enfaktorsscreening.

Otillräcklig ångtid kunde inte helt förstöra växtcellstrukturen och ledde till lågt glykosidutbyte. När ångningstiden översteg 6 minuter inträffade vävnadssönderdelning och echinakosid såväl som acteosid bröts ned. Under en fast skivtjocklek på 0,4 cm och en torktemperatur på 60 grader var 6 min det bästa ångtidsförhållandet.

Inom ett visst intervall steg halten av fenyletanoidglykosider samtidigt som torkningstemperaturen ökade, men nedbrytningen ägde rum när temperaturen översteg 60 grader. Med en skivtjocklek på 0,4 cm och ångtid på 6 minuter visade 60 grader den bästa omfattande prestandan i enfaktorsscreening.

3.2 Test för optimering och verifiering av responsytan

Variansanalys visade att regressionsmodeller för akteosid- och echinakosidinnehåll var signifikanta (P < 0.05, P < 0.01). The lack‑of‑fit term was non‑significant (P >0,05), vilket indikerar god modellpassningsgrad. Bestämningskoefficienten R² var nära 1, vilket visade hög korrelation mellan förutsagt värde och faktiska experimentella data.

Den påverkande ordningen av faktorer för akteosidinnehåll var skivtjocklek > torkningstemperatur > ångtid. För echinakosidinnehåll var ordningen ångtid > torkningstemperatur > skivtjocklek.

Teoretiska optimala parametrar beräknade av mjukvara var skivtjocklek 0,600 cm, ångtid 5,685 min och torktemperatur 57,009 grader. Med hänsyn till praktiska produktionsförhållanden justerades parametrarna till skivtjocklek 0,6 cm, ångtid 6 min och torktemperatur 57 grader. Tre grupper av parallella verifieringsexperiment erhöll en akteosidhalt på 7,25 % och en echinakosidhalt på 31,62 %. Avvikelsen mellan praktiskt värde och teoretiskt förutsagt värde var 3,89 % respektive 4,92 %, vilket visade på tillförlitligheten hos denna respons-yta-modell.

3.3 Resultat av cellviabilitetsscreening

Inom 0-100 ug/ml koncentrationsintervall,Cistanche tubulosaextrakt av avkok hade ingen uppenbar cytotoxicitet på RAW264.7-celler och uppvisade en liten proliferationsfrämjande effekt. När koncentrationen nådde 200 ug/ml och däröver minskade cellviabiliteten signifikant. Därför valdes 12,5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml och 100 ug/ml som arbetskoncentrationer för efterföljande cellexperiment.

3.4 Effekt på intracellulär ROS-nivå

Jämfört med lösningsmedelskontrollgruppen uppvisade LPS-modellgruppen anmärkningsvärt förhöjd intracellulär ROS-fluorescensintensitet (P < 0.001), proving the successful establishment of oxidative‑stress injury model. Pretreatment of Cistanche tubulosaextrahera minskad överdriven ROS-ackumulering på ett dosberoende sätt (P < 0.001 versus model group).

3.5 Förordning om NO-, MDA- och antioxidantrelaterade indikatorer

LPS-stimulering inducerade kraftig ökning av NO- och MDA-innehåll i RAW264.7-celler. Jämfört med LPS-modellgruppen sänkte extraktintervention signifikant NO-nivån med dosberoende tendens. 12.5 ug/mL extrakt gav ingen uppenbar effekt på MDA-innehållet, medan 25-100 ug/mL extrakt observerbart minskade MDA-koncentrationen (P < 0.001).

Efter LPS-behandling minskade aktiviteterna av SOD, CAT, LDH och intracellulärt GSH-innehåll markant . 12.5 ug/mL extrakt kunde förbättra SOD-aktiviteten utan att förbättra CAT- och LDH-aktiviteterna. Extrahera vid en koncentration av 25-100 ug/mL signifikant förhöjda SOD, CAT, LDH enzymaktiviteter och GSH-innehåll på ett koncentrationsberoende sätt.

3.6 Hämmande effekt på pro-inflammatorisk cytokinutsöndring

LPS-stimulering utlöste massiv frisättning av TNF‑, IL‑1 och IL‑6 i RAW264.7-makrofager.Cistanche tubulosaFörbehandling av avkoksextrakt undertryckte på ett anmärkningsvärt sätt utsöndringen av ovan nämnda tre pro-inflammatoriska cytokiner (P < 0.001), presenting prominent dose‑dependent anti‑inflammatory property.

3.7 Modulering på p38/AKT/JNK/NF‑κB Signaling Pathway

Jämfört med lösningsmedelskontrollgruppen ökade LPS-intervention fosforyleringskvoten för p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK och p-NF-κB/NF-κB. Medel- och högdosextraktgrupper reducerade signifikant förhållandet p-p38/p38 och p-JNK/JNK. Alla koncentrationsgrupper nedreglerade p‑AKT/AKT- och p‑NF‑κB/NF‑κB-nivån (P < 0.05 or P < 0.001). Results illustrated that optimized Cistanche tubulosaextrakt av avkok höll tillbaka aktiveringen av p38/AKT/JNK/NF-κB-signalvägen genom att hämma proteinfosforylering.

4. Diskussion

Nuvarande handläggningskrav förCistanche tubulosaregistrerade i kinesisk farmakopé beskriver endast kvalitativa operationssteg utan exakta kvantitativa parametrar. Tidigare forskning indikerade att olika bearbetningsmetoder skulle orsaka stora skillnader i kemisk sammansättning och farmakologisk aktivitet mellan rå och bearbetadCistanche tubulosaprover. Bearbetade produkter uppvisar bättre antioxidant- och immunreglerande prestanda jämfört med råvaror.

I den här forskningen erhöll den moderna ångtorkningsbearbetningen optimerad via responsytmetodologin mycket högre utbyte av echinakosid och akteosid än många traditionella bearbetningstekniker. Det tyder på att exakt kontroll över skivtjocklek, ångningstid och torkningstemperatur effektivt kan behålla och förbättra innehållet av fenyletanoid-glykosid iCistanche tubulosa.

Oxidativ stress och inflammation är nära sammankopplade patologiska processer. Överdriven ROS ger upphov till lipidperoxidation och MDA-ackumulering; under tiden aktiverar den nedströms inflammatoriska kaskader och främjar genereringen av NO och flera pro-inflammatoriska cytokiner. Inflammatoriska mediatorer accelererar ytterligare ROS-produktion och bildar en ond patologisk cykel. Våra cellulära experimentella resultat visade att det var optimeratCistanche tubulosaextrakt av avkok kan eliminera överflödig ROS, minska oxidativa skademarkörer NO och MDA, återställa aktiviteten hos antioxidantenzymsystemet representerat av SOD, CAT, LDH och fylla på intracellulärt GSH, samt hämma frisättningen av pro-inflammatoriska cytokiner med uppenbart dos-effektsamband.

p38, JNK som tillhör MAPK-familjen och AKT-NF-κB-axeln är centrala signaltransduktionsnav som förmedlar oxidativt-inflammatoriskt svar från makrofager. LPS-stimulering främjar fosforylering av p38, JNK och AKT, aktiverar ytterligare NF‑κB och inducerar transkription av många pro-inflammatoriska gener. Western-blot-data avslöjade detCistanche tubulosaavkoksextrakt blockerade fosforyleringsaktivering av p38, JNK, AKT och NF‑κB. Man drar slutsatsen att echinakosid och akteosid med högt innehåll från optimerad bearbetning tillsammans bidrar till att undertrycka p38/AKT/JNK/NF-κB signalkaskad, för att lindra LPS-orsakad oxidativ stress och inflammatorisk skada i RAW264.7-makrofager.

Det finns fortfarande begränsningar i denna studie. Alla farmakologiska utvärderingar genomfördes på in vitro-cellmodell. Ytterligare experiment på djurnivå krävs för att verifiera in vivo effektivitet och metaboliska egenskaper hos bearbetadeCistanche tubulosaavkoksbitar.

Sammanfattningsvis etablerade denna studie kvantifierbar och skalbar modern processteknik förCistanche tubulosaavkoksbitar. Under bearbetningsparametrar med skivtjocklek 0,6 cm, ångtid 6 min och torktemperatur 57 grader förbättras innehållet av huvudsakliga fenyletanoidglykosider avsevärt. Bearbetade avkoksbitar kan lindra oxidativ stress och inflammatorisk skada i LPS-stimulerade RAW264.7-makrofager genom att hämma signalvägen p38/AKT/JNK/NF-κB. Denna forskning ger praktisk teknisk referens för industrialiserad produktion och erbjuder experimentell grund för att utveckla funktionella livsmedel och kosttillskottsprodukter av Xinjiang-ursprungCistanche tubulosa.

Erkännanden

Detta arbete stöddes av Youth Science and Technology Backbone Innovation Capacity Cultivation Project vid Xinjiang Academy of Agricultural Sciences (xjnkq-2022022) och Xinjiang "Tianchi Doctor Program" (2021).

Referenser

[1] Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Extraktion av echinakosid frånCistanche tubulosaoch undersökning av dess skyddande effekt på leverskada hos sepsisråttor.Matvetenskap och teknik. 2023;43:e010523.

[2] Guo J, Tang S, Miao Y, et al. De antiinflammatoriska effekterna av lignanglykosider frånCistanche tubulosastammar på LPS/IFN-inducerade RAW264.7 makrofagceller via PI3K/AKT-vägen.Aktuell farmaceutisk bioteknik. 2021;22(10):1380‑1391.

[3] Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oxidativ stress och metabola störningar: Patogenes och terapeutiska strategier.Livsvetenskap. 2016;148:183‑193.

[4] Martínez-de-Toda I, Ceprián N, Díaz-de-Castro E. Rollen av oxi-inflammation åldrande i mänsklig patofysiologi.Celler. 2021;10(11):2974.

[5] Chung YC, Song SJ, Lee A, et al. Isobavacin lindrar lipopolysackarid-inducerade inflammatoriska svar i makrofager och zebrafiskar genom att undertrycka MAPK- och NF-κB-signalvägar.Journal of Ethnopharmacology. 2024;321:117501.