Studie om salt- och alkalitoleransen hos en endofytisk bakterie från Cistanche Deserticola (Pseudalkalibacillus Sp. A8)

 

Abstrakt

Mål:För att isolera endofytiska bakterier frånCistanche deserticolaoch undersöka de potentiella mekanismerna bakom salt-alkali-toleransen avPseudalkalibacillussp. A8.
Metoder:Endofytiska bakterier isolerades med användning av utspädningspläteringsmetoden. Klassificeringen av stam A8 bestämdes genom morfologiska egenskaper och 16S rRNA-gensekvensering. Helgenomsekvensering och metabolomiska analyser utfördes sedan.
Resultat:Femtio endofytiska bakteriestammar isolerades från färskaCistanche deserticolaprover, som täcker 4 phyla, 8 klasser och 35 släkten. Bland dem är stam A8 den förstaPseudalkalibacillusarter isolerade från växter, som visar exceptionell salt-alkali-tolerans. Den kunde växa i pH-intervall från 6,0 till 13,0 och NaCl-koncentrationer på upp till 17 %. Genomannotering avslöjade 10 gener associerade med salt-alkali-resistens. Metabolomisk analys under förhållanden med hög salthalt och hög pH identifierade 186 differentiella metaboliter berikade i sju funktionella vägar relaterade till salt-alkali-stressanpassning.
Slutsats:Denna studie ger värdefulla mikrobiella resurser för att förbättra toleransen för grödors salt-alkali och erbjuder teoretiskt stöd för förbättring av salt-alkali jord genom mikrobiella metoder. Det lägger också grunden för att förstå de molekylära mekanismerna hos salt-alkali-toleranta bakterier.

Nyckelord: Cistanche deserticola; endofytiska bakterier; salt-alkalitolerans; helgenomsekvensering; UPLC–MS/MS

 

 

 

Cistanche deserticol blomma

Introduktion

Markförsaltning och alkalisering är stora globala utmaningar som i hög grad bidrar till markförstöring och ökenspridning. Det uppskattas att cirka 20 % av världens åkermark påverkas av salthalt i varierande grad, och Kina ensamt besitter 9,9×10⁷ hektar salt-alkali-mark – den största i världen. Sådana jordar uppvisar vanligtvis dålig permeabilitet, låg fertilitet och hård textur, vilket allvarligt försämrar grödans tillväxt och skörd. Därför är det fortfarande en kritisk fråga att utveckla effektiva strategier för att utnyttja och förbättra salt-alkalijordar.

Nyligen genomförda studier tyder på att mikrobiella ympmedel, särskilt salt-alkali-toleranta stammar, kan öka toleransen för grödor och förbättra markegenskaperna på ett kostnadseffektivt och miljövänligt sätt. Endofytiska bakterier - de som finns i växtvävnader utan att orsaka sjukdomar delar ekologiska och fysiologiska egenskaper med sina värdväxter.Cistanche deserticola, en ökenboende parasitväxt känd för sin extrema salt-alkali-resistens, är en lovande källa för att isolera stresstoleranta endofyter.

Denna studie syftar till att:

Isolera endofytiska bakterier frånCistanche deserticola;

Screen för salt-alkali-toleranta stammar;

Utforska stressbeständighetsmekanismerna för den valda stammenPseudalkalibacillussp. A8 genom helgenom och metabolomiska analyser.

Cistanche deserticol blomma

Material och metoder

1.1 Material

Växtprov: Cistanche deserticolasamlades in i mars 2023 från Xiquan Town, Jingtaixian, Baiyin, Gansu-provinsen, Kina. Identifierad av professor Guo Yehong, Gansu Agricultural University.

Media:TSB flytande medium; stelnade med användning av 20 g/L agar.

Reagens och instrument:NaClO, KH2PO4, K2HPO4, TAE-buffert av analytisk kvalitet; Agilent QTOF 1290–6542 masspektrometer, R-1001V rotationsindunstare, Neofuge 15R centrifug, SureCycler 8800 gradient PCR.

1.2 Isolering av endofytiska bakterier

FärskCistanchevävnaden ytsteriliserades och homogeniserades. Serieutspädningar pläterades på R2A-, TSB-, ISP-2- och 2216E-media. Kolonier isolerades och renades genom tre subkulturer och lagrades sedan i 20% glycerol vid -80 grader.

1.3 16S rRNA-genidentifiering

Genomiskt DNA extraherades och amplifierades med användning av universella primrar 27F/1492R. PCR-produkter sekvenserades och analyserades med hjälp av EzBioCloud-databas.

 

Cistanche bas

Supportive Service Of Wecistanche-För mer information om samarbete
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

1.4 Fenotypisk och fysiologisk karakterisering

SEM:Cellmorfologi observerad efter guldbeläggning.

NaCl-tolerans:Tillväxt bedömd till 0–20 % NaCl.

pH-tolerans:Tillväxt mätt vid pH 4–13.

Temperaturområde:Tillväxt testad vid 4–50 grader.

1.5 Helgenomsekvensering

Stam A8 sekvenserades med användning av PacBio-teknologi. Genomsammansättning och annotering utfördes mot sex stora databaser (NR, Swiss-Prot, Pfam, EggNOG, GO, KEGG). Gener relaterade till salt-alkali-tolerans screenades.

1.6 UPLC-MS/MS-analys

Prover odlades under tre förhållanden:

A: pH 7,2, NaCl 0,5 %

B: pH 7,2, NaCl 14 %

C: pH 13,0, NaCl 0,5 %

Supernatanter torkades, löstes i metanol och analyserades med användning av UPLC-MS/MS (ZORBAX Eclipse Plus C18, positiv jonläge).

Resultat och analys

2.1 Endofytisolering

Femtio stammar isolerades frånCistanche deserticola, tillhörande 4 phyla och 35 släkten.

2.2 Identifiering av stam A8

16S rRNA-sekvens visade 99,30% likhet medPseudalkalibacillus salsuginis. Fylogenetisk analys bekräftade det som medlem avPseudalkalibacillus. Morfologiskt var kolonierna släta, gulbruna, stavformade (1–6 µm) med lätt ludd under SEM.

Tillväxtintervall:20–45 grader (optimalt: 30 grader)

pH-intervall:6–13 (optimalt: 9,0)

Saltintervall:0–17 % NaCl (optimalt: 0–5 %)

2.3 Genomanalys

Genomets längd: 6,022,064 bp

GC-innehåll: 40.99%

Proteinkodande gener: 5,825 (82.5%)

tRNA/rRNA:76 tRNA, 24 rRNA

ANI-värden:Alla<95%, indicating a potential novel species.

COG-anteckning:4 683 gener (80,39 %)

Aminosyratransport/metabolism (556), kolhydratmetabolism (501), transkription (464), lipidmetabolism (440), koenzymmetabolism (298), försvarsmekanismer (100)

Salt-alkali-toleransgener identifierade:

Glycin/betaintransportör

Natriumsymportör

Antiporters

F0F1 ATP-syntas

2.4 Metabolomisk analys

Metabolitidentifiering:Totalt 986 metaboliter upptäcktes

OPLS-DA-analys:Tydlig åtskillnad mellan grupper; R²X > 0,5, R²Y=1, Q² > 0,85,P< 0,005

Differentiella metaboliter:

186 totalt:

Grupp B: 96 (13 uppreglerade, 83 nedreglerade)

Grupp C: 132 (41 uppreglerade, 91 nedreglerade)

49 uppreglerad i både B & C

196 unikt uttryckta metaboliter i B & C

246 totala uppreglerade eller unika metaboliter

Pathway Enrichment (KEGG):

Sesquiterpenoid och triterpenoid biosyntes

Purin metabolism

Lysinbiosyntes och nedbrytning

Pantotenat och CoA-biosyntes

Arginin och prolin metabolism

Steroidbiosyntes

Dessa resultat tyder på att stam A8 anpassar sig till salt-alkali-stress genom både genetisk och metabolisk reglering.

---

Slutsats

Denna studie framgångsrikt isolerade och identifieradePseudalkalibacillussp. A8 frånCistanche deserticola, en potentiell ny art som uppvisar stark salt-alkali-resistens. Genom hela genomet och metabolomiska analyser har flera gener och metabola vägar identifierats som bidragande till dess stressanpassning. Dessa fynd ger en teoretisk grund för att utveckla mikrobiella medel för att förbättra toleransen för grödor och återvinna salt-alkalijordar.

 

Referenser

Wang Y., Wang Y., Zhang Q., et al.Salt-alkalisk jordegenskap förbättrad av synergistiska effekter avPriestia aryabhattaiJL-5,Staphylococcus pseudoxylosusXW-4,Leymus chinensisoch jordmikrobiota. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(9): 7737.

Chen Wentao, Guo Lizhuo, Shan Bin, et al.Effekter av jordändringar på tillväxten av havre och markens fysiska egenskaper i salt-alkalisk mark. Journal of Gansu Agricultural University, 2024, 59(5): 136–144. (på kinesiska)

Lu Yuxin, Yan Hong, Bai Yani, et al.Isolerings- och salt-alkali-toleransmekanism förRhizobiumStam BFL-3. Journal of Agricultural Biotechnology, 2023, 31(7): 1501–1512. (på kinesiska)

Yu Jiang, Wang Xinzhen, Wang Chun, et al.Applicering av en salt-alkali-tolerantCitrobacterStam för att främja växttillväxt och brytning av dess salt-alkali-toleransgener. Mikrobiologi Kina, 2024, 51(3): 864–879. (på kinesiska)

Wani ZA, Ashraf N., Mohiuddin T., et al.Växt-endofyt symbios: ett ekologiskt perspektiv. Tillämpad mikrobiologi och bioteknik, 2015, 99(7): 2955–2965.

Venieraki A., Dimou M., Katinakis P.Endofytiska svampar som finns i medicinalväxter har förmågan att producera samma eller liknande farmakologiskt aktiva sekundära metaboliter som deras värdar. Hellenic Plant Protection Journal, 2017, 10: 51–66.

kinesisk farmakopékommission.Folkrepubliken Kinas farmakopé, volym I. Peking: China Medical Science Press, 2020: 79–80.(på kinesiska)

Fu Kejian, Cui Yonghe, Huang Zhihua, et al.Screening, identifiering och antagonistisk mekanism av biokontrollbakterier mot tobaksvartskaftpatogen. Journal of Southern Agriculture, 2023, 54(8): 2245–2256. (på kinesiska)

Hu Chunhui, Xu Qing, Sun Xuan, et al.Framställningsmetoder för flera typiska biologiska prover för svepelektronmikroskopi. Hubei jordbruksvetenskap, 2016, 55(20): 5389–5392+5402. (på kinesiska)