Abstrakt

Hudhyperpigmenteringsstörningar, såsom melasma, fräknar och postinflammatorisk hyperpigmentering (PIH), utlöses ofta av ultraviolett-B (UVB)-strålning, hudskada och lokal hudinflammation. Överskott av melanin försämrar hudens utseende och påverkar patientens psykologiska välbefinnande negativt. Konventionella depigmenteringsmedel som hydrokinon riktar sig främst mot tyrosinas med singelfunktion och medför väldokumenterade säkerhetsrisker. Multi-target naturliga botaniska blandningar har dykt upp som lovande alternativ för modern funktionell kosmetisk formulering.

Fenyletanoidglykosider (PhG) är signaturbioaktiva beståndsdelar isolerade frånCistanche deserticola, en välkänd medicinsk ört från torra ökenområden. Glabridin (Gla), en prenylerad isoflavan extraherad frånGlycyrrhiza glabra, är allmänt erkänd som en högpotent hudupplysande naturlig förening. Denna forskning undersökte systematiskt den synergistiska anti-hyperpigmenteringsprestandan hos PhG i kombination med glabridin. In vitro biokemiska analyser, inklusive tyrosinashämning, DPPH och ABTS⁺ friradikal-fångande tester, användes för preliminär massförhållande screening. Tre cellulära modeller konstruerades ytterligare: UVB-bestrålad B16F10 musmelanomcellpigmenteringsmodell; lipopolysackarid (LPS)-stimulerad HaCaT keratinocytinflammatorisk modell; AAPH-inducerad HaCaT oxidativ stressmodell. Indikatorer som täcker intracellulär tyrosinasaktivitet, melaninhalt, pro-inflammatorisk cytokinfrisättning (IL-6, TNF), superoxiddismutas (SOD) och katalas (CAT) enzymaktivitet kvantifierades. Beräkning av kombinationsindex (CI) implementerades för att kvantitativt identifiera synergistisk interaktion mellan de två botaniska extrakten.

Bland de testade proportionerna uppvisade massförhållandena m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 och 10:1 framträdande tyrosinas-dämpande och antioxidantsynergi. Vid en total koncentration på 0,4 g/L i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med pH 6,8 nådde tyrosinasinhiberingshastigheten 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1) och 88,06 % (10:1). Motsvarande DPPH-radikal-renande procentsatser var 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; ABTS⁺ katjon-radikal-renande kapacitet uppnådde 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. Vid arbetskoncentration 25 ug/ml uppvisade alla tre sammansättningsberedningarna ingen signifikant cytotoxicitet mot B16F10- och HaCaT-cellinjer. Den blandade 1:1-gruppen genererade överlägsen omfattande effektivitet: kvarvarande intracellulär tyrosinasaktivitet sjönk till 23,80 %, den relativa melaninhalten minskade till 30,90 %. Dessutom utövade PhGs/Gla (1:1) starkast undertryckande av IL-6- och TNF-sekretion och återställde maximalt SOD- och CAT-antioxidantenzymaktivitet. Experimentella resultat bekräftade att PhGs parade med glabridin uppnår synergistiska anti-hyperpigmenteringsresultat genom tredubbla vägar: hämmar melaninbiosyntesen, mildrar hudinflammation och motverkar oxidativ stress. Massförhållandet 1:1 ger optimal integrerad biologisk prestanda. Denna studie ger experimentella bevis som stöder tillämpningen avCistanchefenyletanoidglykosider-glabridinkompositmaterial i ren-skönhet, växthärledd blekande hudvårdsråvara.

Nyckelord: Cistanche deserticolafenyletanoidglykosider; glabridin; synergistisk effekt; anti-hyperpigmentering; antioxidant; antiinflammation; kosmetiska botaniska råvaror

1. Introduktion

Överdriven melaninackumulering i epidermala lager resulterar i heterogena hudpigmenteringsfenotyper, inklusive melasma, efelider och postinflammatorisk hyperpigmentering (PIH)Googla efter.... Flera yttre och inneboende drivande faktorer bidrar till patologisk överproduktion av melanin. UVB ultraviolett bestrålning representerar den primära miljöutlösaren; hudtrauma och kroniska lokala inflammatoriska svar förstärker pigmentstörningar ytterligare. Det är väletablerat att korssamtal mellan epidermala keratinocyter och melanocyter dominerar pigmentprogression. Vid extern stimulering frigör aktiverade keratinocyter reaktiva syrearter (ROS) och pro-inflammatoriska mediatorer. Dessa signalmolekyler diffunderar och verkar på intilliggande melanocyter, uppreglerar tyrosinas katalytisk aktivitet, accelererar melaninsyntesen och främjar melanosomtransport mot keratinocyter, och producerar slutligen synliga pigmenterade lesioner på hudytan. Följaktligen kan effektiv intervention för hyperpigmentering inte bara fokusera på tyrosinasinhibering. Multimodala terapeutiska strategier bör samtidigt täcka inhibering av melanogenes, antiinflammatorisk intervention och neutralisering av oxidativ stress.

Traditionella syntetiska hudupplysande aktiva ämnen som hydrokinon ger depigmenterande effekt främst genom direkt tyrosinasdämpning. Icke desto mindre begränsar mekanismer med enstaka mål den praktiska prestandan, och långvarig lokal applicering av hydrokinon kan utlösa hudirritation, kontaktdermatit och potentiella säkerhetsrisker, vilket begränsar användningsområdet för kosmetisk kvalitet. Naturliga växtbaserade bioingredienser lockar till sig ett växande intresse från kosmetikaframställare och konsumenter för deras milda profiler och multi-path farmakologiska effekter. Sammansatta blandningar av olika botaniska extrakt kan ge synergistiska biologiska effekter, förbättra den totala effekten samtidigt som effektiva doskrav sänks, vilket öppnar nya tekniska anvisningar för antipigmentering av kosmetisk-råmaterialforskningGoogle

Cistanche deserticola, vanligen kallad "ökenginseng", är en klassisk stärkande ört inom traditionell kinesisk medicin. Moderna fytokemiska undersökningar visar att fenyletanoidglykosider (PhGs) utgör dess huvudsakliga farmakologiskt aktiva fraktion, med echinakosid och acteosid som representativa föreningar. Publicerad farmakologisk forskning visar att PhG har en robust antioxidantkapacitet, antiinflammatorisk bioaktivitet och måttlig tyrosinashämmande potential, vilket innebär framtida tillämpningsmöjligheter i dermatologiska hudvårdsmaterial. Glabridin är en karakteristisk isoflavonoid förening isolerad frånGlycyrrhiza glabraroot, välkänd inom kosmetisk industri som "blekning av guld". Det undertrycker kraftigt melanogenes och modulerar samtidigt kutana inflammatoriska kaskader. Ur ett traditionellt medicinskt teoretiskt perspektiv,Cistancheger näring till njuressens och tonifierar yang, medan lakritsrötter förstärker mjälten och rengör värmetoxin. Kombinerad användning överensstämmer med sammansatta kompatibilitetsprinciper för växtbaserade dermatologiska terapier.

Mekanistisk hypotes hävdar att PhGs-glabridin-kombinationen kan reglera hudpigmentering via multi-target och multi-path lägen: gemensamt hämmande av tyrosinas katalytisk funktion för att skära av melaningenererande ursprung; dämpar uppbyggnad av reaktiva syrearter; begränsa överfrisättning av pro-inflammatorisk faktor, för att avbryta ROS- och cytokinmedierad signalförstärkning för melanocytaktivering. Hittills har få forskningsartiklar systematiskt rapporterat synergistisk anti-hyperpigmenteringsutvärdering för denna binära blandning.

Denna artikel syftar till att utforska kombinatoriska biologiska effekter mellanCistanchefenyletanoidglykosider och glabridin. Biokemiska in vitro-enzymhämning och radikalfångande screeningexperiment implementerades först. Tre representativa cellmodeller som efterliknar pigmentavlagring, hudinflammation och oxidativ skada konstruerades för multidimensionell effektivitetsbedömning. Kombinationsindexmetod användes för att kvantifiera synergi- eller antagonisminteraktioner. Vi strävade efter att bestämma det optimala massförhållandet för föreningen, förtydliga funktionella mekanismer i trippelläge och tillhandahålla experimentellt datastöd för att utveckla naturliga synergistiska hudupplysande kosmetiska råmaterial.

2. Material och metoder

2.1 Reagenser, cellstammar och laboratorieinstrument

B16F10 musmelanomcellinje (STCC20013G-1) köptes från Saierbio Co., Ltd. Immortaliserad human epidermal keratinocyt HaCaT (iCell-h066) erhölls från iCell Bioscience Inc.CistancheFenyletanoidglykosider (PhGs) och glabridin (Gla) levererades kommersiellt av Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Svamptyrosinas, arbutin, L-tyrosin, L-DOPA, DPPH, ABTS diammoniumkoraminsalt, L-AAas, (L-PH,Ps), X-100, DMSO och andra kemiska reagenser av analytisk kvalitet kom från vanliga biokemiska reagensleverantörer. Förbrukningsmaterial för cellodling inkluderade DMEM-medium med hög glukoshalt, fetalt bovint serum, penicillin-streptomycin blandad lösning. ELISA-analyssatser riktade mot humant IL-6, TNF-, CAT och total-SOD-detektionskit anskaffades från motsvarande biotekniktillverkare.

Nyckellaboratorieutrustningen innehöll Multiskan FC-mikroplattläsare med full våglängd, Heracell 371 CO₂-inkubator (Thermo Fisher); KQ‑200VDB ultraljudsrengörare; vattenbad med konstant temperatur; DHG-9246A blästringsugn; KN4006B UVB ultraviolett bestrålningsinstrument med utgående strålning på 8 mW/cm².

2.2 Beredning av provlösning

Stamlösningar av PhG och glabridin framställdes i pH 6,8 PBS-buffert eller 50 % (v/v) etanol-vattenlösningsmedel, serieutspädd till arbetskoncentrationer: 0,001 g/L, 0,005 g/L, 0,025 g/L, 0,1 g/L, 0,1 g/L, 0,4 g/L, 0,4 g/L, 0,4 g/L. 1,6 g/L, 2,0 g/L. Nio sammansatta grupper konfigurerades med en fast total masskoncentration av 0,4 g/L med varierande massproportioner m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:40, betecknade som Phla PhGs/1) (Gla PhGs:1) (1:40).

För cellulära experimentanalyser löstes pulverprover i serumfritt DMEM-medium för att framställa serier av arbetskoncentrationslösningar.

2.3 Biokemiska in vitro-analyser

2.3.1 Tyrosinasinhiberingsanalys

50 μL provlösning, 50 μL pH 6,8 PBS och 50 μL 1 g/LL-tyrosinsubstratlösning tillsattes sekventiellt i varje brunn på 96-brunnars mikroplatta. Förinkubationen fortsatte under 37 graders vattenbad i 10 minuter. Därefter tillsattes 50 μL 0,4 g/L svamptyrosinaslösning (200 U/mL) och inkubationen fortsatte vid 37 grader i 10 minuter. Arbutin fungerade som positiv kontrollsubstans, blankkontroll antog pH 6,8 PBS-buffert. Absorbansvärdet uppmättes under 490 nm våglängd på mikroplattläsare. Formel för beräkning av tyrosinashämningshastighet:

Tyrosinashämningshastighet (%)={1 − [(A_reaction − A_reaction-control) / (A_blank − A_blank-control)]} × 100 %

Där: A_reaktion: absorbans innehållande prov, substrat, PBS och tyrosinas; A_reaktionskontroll: absorbans av prov, substrat och PBS utan enzym; A_blank: absorbans av substrat, PBS och tyrosinas; A_blank-kontroll: absorbans endast för substrat och PBS-buffert.

2.3.2 Bestämning av DPPH-friradikalrening

DPPH-pulver löstes i vattenfri etanol för att framställa 0,2 mmol/L DPPH-arbetsvätska. PhG, glabridin och vitamin C-referenssubstans löstes i 50 % etanol-vattenlösningsmedel för att bilda stamlösningar med koncentrationsgradient. Binära blandningsprover med nio massförhållanden blandades jämnt. Varje brunn fick 100 μL provvätska plus 100 μL DPPH-arbetslösning. Efter noggrann blandning hölls mikroplattan borta från ljus vid omgivningstemperatur under 30 minuter. Absorbansavläsningen registrerades vid λ = 517 nm. Vitamin C fungerade som positiv kontroll, varje experimentgrupp upprepades i 3 biologiska replikat. DPPH-rengöringshastighetsformel:

DPPH renshastighet (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

Ai: absorbans av prov + DPPH-arbetsvätska; A2: absorbans av 50 % etanol + DPPH arbetsvätska; A3: absorbans av provlösning blandad med 50 % etanollösningsmedel.

2.3.3 ABTS⁺ katjonradical-renande analys

7,4 mmol/L ABTS-stamlösning och 2,6 mmol/L kaliumpersulfatlösning blandades lika, inkuberades i mörk miljö under 12 timmar för att producera stabilt ABTS+-arbetsreagens. Provlösningar konfigurerades enligt protokoll som beskrivs i avsnitt 2.3.2. 40 μL provlösning och 160 μL ABTS⁺ arbetsvätska pipetterades till mikroplattsbrunnar. Efter ljusskyddad inkubation i 6 minuter vid rumstemperatur mättes absorbansen vid 734 nm. ABTS⁺-formel för radikalfångande hastighet:

ABTS⁺ reningshastighet (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: absorbans av provlösning plus ABTS+ arbetslösning; A2: absorbans av avjoniserat vatten blandat med ABTS+ arbetsreagens; A₃: absorbansvärde för provlösning blandad med rent avjoniserat vattenlösningsmedel.

2.4 Cellkulturprocedurer

B16F10-melanomceller och HaCaT-keratinocyter odlades i DMEM-medium med hög glukoshalt kompletterat med 10 % fetalt-bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin. Inkubatorparametrar: 37 grader, 5 % volymfraktion CO₂, relativ fuktighet 70 %. Cellpassage och mediumuppfräschning utfördes enligt celltillväxttäthet observerad under inverterat optiskt mikroskop. Celler i logaritmisk tillväxtfas samlades in för efterföljande sådd på odlingsplattor med 96 brunnar.

2.5 Etablering av tre cellulära funktionsmodeller

2.5.1 UVB-inducerad B16F10-pigmenteringsmodell

Efter 1 timmes förbehandling med motsvarande provmedium täcktes cellskiktets yta med PBS-buffert. UVB-strålningsintensiteten sattes till 8 mW/cm², bestrålningsavståndet 3 cm, bestrålningens varaktighet 110 s. Normalgrupp fick identiskt medium utan UVB-strålningsintervention. Modellkontrollgruppen erhöll PBS-förbehandling följt av UVB-exponering i lika doser utan provtillskott.

2.5.2 LPS-medierad HaCaT-inflammatorisk aktiveringsmodell

HaCaT-celler förinkuberades med testprov DMEM-medium i 24 timmar. Efteråt kompletterades lipopolysackarid LPS-lösning för att nå en slutlig koncentration på 20 ug/ml, och samodlingen varade ytterligare 24 timmar. Modellgruppsceller utmanades av LPS utan provförbehandling. Normal grupp upprätthöll vanlig komplett-medium odling.

2.5.3 AAPH-utlöst HaCaT-oxidativ-stressmodell

Celler fick 24-timmars provförinkubation. AAPH-reagens sattes till odlingsmediet, slutkoncentration 25 mmol/L, fortsatt 24-timmars inkubation. Modellkontrollgruppen stimulerades av AAPH utan provintervention. Normalkontrollgruppen växte under vanligt medium kondition.

Alla cellmodellgrupper innehöll tre tekniska replikatbrunnar.

2.6 Cytotoxicitetstest (CCK-8-metod)

Cellsuspension justerades till densitet 1 × 10⁴ celler/ml och inokulerades på mikroplattor med 96 brunnar. Efter cellvidhäftning administrerades provmedium med gradientkoncentration och inkubationen fortsatte i 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar. CCK-8-detektionsreagens blandat med färskt DMEM-medium (volymfraktion 10 %) ersatte gammalt medium, inkubationen fortsatte i 60 minuter. Mikroplattläsare mätte absorbansen vid 450 nm våglängd. Beräkningsformel för relativ cellviabilitetsprocent:

Cellviabilitet (%)=[(A_sample − A_blank) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_prov: absorbans av brunnsinnehållande celler, CCK‑8-reagens och provmedium; A_blank: absorbans för odlingsmedium plus CCK‑8 utan ympade celler; A_0: absorbans av celler och CCK‑8-reagens odlade med blankmedium (inga testprover).

2.7 Kvantifiering av intracellulär tyrosinasaktivitet

Efter 48 timmars modelletableringsbearbetning kasserades cellsupernatanten. Cellmonoskiktet tvättades två gånger med pH 7,4 PBS. 50 μL 1 % Triton X-100 lyslösning tillsattes per brunn. Mikroplattan frystes i -80 graders kylskåp i 30 minuter och tinades sedan under rumstemperatur för full cellmembransbrott. Förvärmningsbehandling vid 37 grader varade i 5 min. L-DOPA-substrat (10 mmol/L, 10 μL) kompletterades. Mikroplattan inkuberades under 1 timme inuti CO2-inkubatorn. Absorbans detekterades vid 475 nm för beräkning av relativ intracellulär tyrosinasaktivitet.

2.8 Intracellulär mätning av melanininnehåll

NaOH-klyvningsmetod användes för detektion av melaninhalt. Efter 72-timmars modellintervention togs odlingssupernatanten bort, cellerna sköljdes två gånger med PBS-buffert . 100 μL 1 mol/L NaOH-vattenlösning innehållande 10 % DMSO tillsattes. Mikroplattan inkuberades inuti 90 graders ugn under 60 minuter för fullständig melaninupplösning. Absorbansen avlästes vid 490 nm för att beräkna den relativa melaninhalten i procent.

2.9 Detektering av inflammatoriska faktorer och antioxidant-enzymindikatorer

Efter 48 timmars modellbearbetning skrapades HaCaT-celler och samlades in, centrifugerades för att skörda cellsupernatant. Kommersiella ELISA-kit användes för kvantitativ bestämning av IL-6- och TNF-pro-inflammatoriska-cytokinkoncentrationer. För antioxidant-enzymtestning utsattes cellpellets för upprepade frys-upptiningscykler för att uppnå cellfragmentering. Centrifugeringstillstånd: 12 000 r/min, 4 grader, 10 min. Supernatantfraktion samlades upp för att analysera SOD-vitalitet och CAT-enzyminnehåll enligt satsens driftsspecifikationer.

2.10 Analys av kombinationsindex (CI).

Chou-Talalay-kombinationsindex (CI)-algoritmen implementerades för att bedöma synergistisk/additiv/antagonistisk interaktion mellan PhG och glabridin inom tyrosinas-inhibering och antioxidantanalyser:

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 representerar antagonistisk interaktion; Cl ≈ 1 betyder additiv effekt; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Statistisk analys

Experimentella mätresultat uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (medelvärde ± SD). GraphPad Prism 9.5.0 programvara utförde statistiska beräkningar. Envägsvariansanalys (ANOVA) användes för jämförelse mellan flera grupper. P-värde< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Resultat och diskussion

3.1 In vitro tyrosinashämmande prestanda av PhG, glabridin och binära blandningsprov

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

Vid en total koncentration på 0,4 g/L för sammansatt PBS-lösning, gav PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) en tyrosinasinhiberingshastighet på 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. Både 5:1 och 1:1 förhållanden överträffade hämningseffektiviteten av enkomponent PhG (36,92 %) och enkomponent glabridin (92,71 %) vid matchande total masskoncentration. 1:1-gruppen uppnådde en hämningsgrad som var jämförbar med positiv kontroll-arbutin. Enligt CI-värdeberäkningsresultat: m(PhGs):m(Gla) från 40:1 till 1:1 genererad CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, manifesterar antagonistisk interaktion.

Fenoliska hydroxylgrupper utgör den centrala funktionella delen för tyrosinas-hämmande kapacitet. PhG innehåller orto-dihydroxifenyl strukturella fragment som kan kelera kopparjoner i tyrosinas katalytiskt aktiv ficka, vilket konkurrerande hindrar substrat-enzymbindning. Glabridinisoflavanskelett bär 2-OH- och 4-OH-grupper på sin B-ring, strukturellt analogt med L-tyrosin/L-DOPA aromatisk hydroxyl-substituerad ring, vilket möjliggör konkurrenskraftig ockupation av domänen för den enzymaktiva platsen. Efter blandning av blandningen ökar den kumulativa mängden fenol-hydroxyl; under tiden kan två molekyler fästa till distinkta bindningsställen för tyrosinasprotein, vilket gemensamt förstärker den hämmande effektiviteten.

3.2 Radikalfångande antioxidantaktivitet hos testprover

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridin. PhG är rikligt förekommande i koffeoylgrupp och 3,4-dihydroxifenyletanol, med konjugerade dubbelbindningssystem som stärker friradikalneutraliserande prestanda. Glabridin flavonoid-ramverket tillhandahåller också hydroxylgrupper och utökad konjugerad-ringarkitektur för att stabilisera oparade elektroner från reaktiva syrearter.

Tre lovande sammansättningsgrupper PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) uppvisade utmärkta DPPH- och ABTS⁺-renande prestanda. ABTS⁺-fångningshastigheten nådde nästan 100 %, vilket indikerar nästan fullständig eliminering av katjonernas fria radikaler. Olika massförhållanden producerar olika molekylära interaktionstillstånd mellan två molekyler, vilket leder till skillnader i exponeringsstatus för hydroxylgrupper och resulterar i divergens av antioxidantsynergistisk storlek.

3.3 Cytotoxicitetsutvärdering av PhG, Glabridin och blandade preparat

CCK-8 cytotoxicitetstestning visade att PhG inom koncentrationsomfånget 62,5 ~ 500 ug/mL och glabridin 6,25 ~ 25 ug/mL inte utlöste uppenbar viabilitetsminskning för B16F10- och HaCaT-cellinjer. Under 25 ug/mL total masskoncentration bibehöll tre föreningsförhållandegrupper PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) hög cellviabilitet och visade ingen detekterbar cytotoxisk effekt mot båda cellstammarna. Följaktligen valdes 25 ug/ml som säker arbetskoncentration för efterföljande cellulär funktionsutvärdering. För grupper med enstaka medel definierades PhGs låg-/medium-/hög dos som 125 ug/mL, 250 ug/mL, 500 ug/ml; glabridin låg-/medium-/hög dos: 6,25 ug/mL, 12,5 ug/ml, 25 ug/ml.

3.4 Inverkan på intracellulär tyrosinasaktivitet och melanininnehåll i UVB-stimulerade B16F10-celler

Efter UVB-bestrålningsbehandling uppvisade B16F10-modellgruppen statistiskt signifikant förhöjning av intracellulär tyrosinasaktivitet och melaninackumulering (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Vid en enhetlig total koncentration på 25 ug/ml visade föreningsgrupper överlägsna biologiska resultat jämfört med motsvarigheter med en enkomponent. Bland tre förhållanden gav PhGs/Gla (1:1) optimal effekt: kvarvarande intracellulär tyrosinasaktivitet endast 23,80 %, den relativa melaninhalten sjönk till 30,90 %. Statistisk jämförelse visade signifikant skillnad jämfört med 5:1 och 10:1 föreningsgrupper. Proportionen 1:1 visade en framträdande synergistisk amplifiering för att begränsa melaninbiosyntesen inuti melanocytceller.

UVB-bestrålning provocerar melanocyt-inneboende melanogen signalkaskad, uppreglerar MITF-transkriptionsfaktoruttryck och inducerar ytterligare överuttryck av tyrosinasprotein. Resultaten från våra cellexperiment validerade att PhG i kombination med glabridin effektivt kunde vända UVB-inducerad tyrosinasaktivering och minska melaningenereringen.

3.5 Anti-inflammatorisk effekt mot LPS-utmanade HaCaT-keratinocyter

LPS-stimulering höjde kraftigt IL-6- och TNF-pro-inflammatorisk-cytokinsekretion i HaCaT-modellgrupp (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). 1:1-formuleringen genererade maximal minskning för IL-6- och TNF-frisättning, vilket översteg den hämmande effekt som erhölls genom separat applicering av PhG eller glabridin.

Förklaring av molekylär mekanism: PhGs fenol-hydroxyl-del tar bort inflammatoriskt utlösande fria radikaler; Dessutom kan PhG störa NF-κB och MAPK intracellulära signalkaskader för att begränsa pro-inflammatorisk gentranskription. Glabridin hämmar fosforylering av stressaktiverat kinas JNK och p38, vilket blockerar nedströms inflammatorisk signaltransduktion. En enda substans kan bara delvis undertrycka aktivering av inflammatorisk signalväg. Binär kombination intervenerar samtidigt flera noder inom inflammatoriskt signaleringsnätverk och uppnår synergistisk antiinflammatorisk prestanda.

Kutan inflammation fungerar som kritisk drivkraft uppströms för PIH-förekomst. Inflammatoriska cytokiner som utsöndras av keratinocyter fungerar som parakrina signalerande budbärare och stimulerar närliggande melanocyter för att påskynda melaninproduktion och melanosomöverföring. Effektiv minskning av epidermal inflammation är avgörande för att förebygga och förbättra hyperpigmenteringsskador. Därför ger den antiinflammatoriska fördelen med PhGs-glabridinföreningen ytterligare värde för antipigmentering av kosmetiska material.

3.6 Antioxidant-enzym-reglerande kapacitet under AAPH-inducerad oxidativ-stresstillstånd

AAPH oxidativ stress modellgrupp visade uppenbar minskning av intracellulär SOD och CAT antioxidant-enzym vitalitet (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Hud som utsätts för ultraviolett strålning genererar stora mängder reaktiva syrearter. Överskott av ROS oxiderar inte bara direkt melaninsyntesrelaterade biomolekyler, utan aktiverar också flera melanogena signalvägar. Endogent antioxidant-enzymsystem (SOD, CAT) utgör en stor försvarsbarriär för att eliminera intracellulär ROS. När oxidativ stress överväldigar den inneboende antioxidantkapaciteten, accelererar ROS-ackumulering pigmenteringsförloppet. PhGs-glabridinföreningen avlägsnar inte bara direkt fria radikaler via en kemisk fenol-hydroxylreaktion, utan reparerar också cellulär antioxidant-enzymsystemfunktion, vilket lindrar skador från oxidativ stress från två dimensioner. Olika massförhållanden ändrar molekylärt interaktionsmönster mellan två naturliga molekyler, vilket resulterar i diskrepans i slutgiltig antioxidantreglerande effekt.

3.7 Omfattande mekanismdiskussion för synergistisk anti-hyperpigmentering

Hudhyperpigmenteringspatologiska processer bildar ett komplext signalnätverk: UVB-bestrålning verkar på både melanocyter och omgivande keratinocyter. Keratinocyter frisätter ROS och pro-inflammatoriska cytokiner. Dessa biosignaler aktiverar melanocyter ytterligare, uppreglerar tyrosinasaktivitet, ökar melaninbiosyntesen och underlättar transport av melanosomer mot epidermala keratinocyter, vilket slutligen leder till synlig pigmentavlagring på hudytan. Följaktligen kan tyrosinasinhibering med ett mål inte helt vända patologisk pigmentering. Flervägsinterventionsstrategi bör integrera melanogenes-hämning, anti-inflammation och antioxidantskydd.

Våra experimentella resultat visade att PhG i kombination med glabridin realiserar multimodal intervention mot hyperpigmentering:

Direkt undertrycka tyrosinaskatalytisk aktivitet inuti melanocyter för att hämma melaninbiosynteskällan;

Hämmar överutsöndring av pro-inflammatorisk cytokin från keratinocyter, skär av parakrin inflammatorisk stimuleringssignal mot melanocyter;

Eliminera överskott av reaktiva-syre-arter och återställ endogen SOD/CAT-antioxidant-enzymaktivitet, vilket minskar oxidativ-stress-medierad pigmentförstärkning.

Förhållandet m(PhGs):m(Gla) = 1:1 uppvisade optimala omfattande synergistiska prestanda över biokemisk enzyminhibering, radikalfångande, melanocytpigmentmodell, keratinocytinflammationsmodell och oxidativ stressmodell. Detta förhållande överträffade grupperna 5:1 och 10:1 i nästan alla testindikatorer. Synergi kan härröra från komplementära molekylär-strukturella egenskaper: PhG och glabridin har distinkta fenolskelettstrukturer, som interagerar med olika målproteiner (tyrosinas, inflammatoriska signalerande kinaser, antioxidant-enzymrelaterade vägar). Efter blandning av föreningen optimeras exponeringsstatus för fenol-hydroxyl genom intermolekylär interaktion, vilket förbättrar den övergripande biologiska aktiviteten.

För kosmetisk industris praktiska perspektiv ger synergistiska botaniska sammansatta råmaterial två stora fördelar. För det första möjliggör synergistisk effekt minskning av den nödvändiga dosen för varje enskild aktiv ingrediens, vilket sänker formuleringskostnaden; för det andra matchar flervägsfunktionsprofilen den komplexa patologiska mekanismen för kliniskt observerad hudhyperpigmentering som PIH och melasma, och erbjuder en teoretisk grund för att utveckla högeffektiva naturliga hudupplysande kosmetiska formler.

4. Slutsats

Denna forskning utvärderade systematiskt synergistisk anti-hyperpigmentering bioaktivitet avCistanche deserticola-härleddfenyletanoidglykosider (PhGs) i kombination med glabridin (Gla). Biokemisk in vitro-screening och tre representativa cellulära modeller användes för multidimensionell effektkarakterisering. De viktigaste experimentella slutsatserna sammanfattas enligt följande:

Inom biokemiska in vitro-analyser för tyrosinasinhibering och fria radikaler, visade sammansättningsformuleringar m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 gynnsam hämmande prestanda och synergistisk-interaktion. Under total koncentration 0,4 g/L i pH 6,8 PBS nådde tyrosinasinhiberingshastigheten 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). DPPH-radikala rensningshastigheter: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺‑radikala rensningshastigheter: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

Vid säker arbetskoncentration 25 ug/ml, PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) DMEM-lösningar visade ingen cytotoxicitet mot B16F10 melanomceller och HaCaT humana keratinocyter. Bland dessa grupper uppnådde PhGs/Gla (1:1) bästa integrerade effekt: intracellulär tyrosinasaktivitet minskade till 23,80 %, melaninhalten minskade till 30,90 %. Det genererade den starkaste hämningen av IL-6, TNF-inflammatorisk-cytokinfrisättning och maximal restaurering för SOD- och CAT-antioxidant-enzymvitalitet. Gruppen med massförhållandet 1:1 uppvisade en uppenbar synergistisk förstärkningseffekt som var överlägsen grupper med ett medel och andra grupper med sammansättningsförhållande.

PhGs och glabridin binär blandning utövar en anti-hud-hyperpigmenteringseffekt genom trippelvägar: undertrycker melaninbiosyntesen, lindrar epidermal inflammation och motverkar skador på oxidativ stress. Det optimala synergistiska massförhållandet m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Denna studie tillhandahåller experimentella bevis och tekniskt stöd för att utveckla naturliga, växtbaserade multifunktionella kosmetiska råmaterial för hudupplysande och antipigmenteringsapplikationer.

Erkännanden

Detta arbete fick ekonomiskt stöd av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82160772). Vi tackar Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research för stöd till experimentella plattformar.

Referenser

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Hantering av hyperpigmentering: Aktuella behandlingar och nya terapier[J]. Pigment Cell & Melanoma Research, 2021, 34(6):1000-1014.

[2] Yardman-Frank J M, Fisher DE. Hudpigmentering och dess kontroll: Från ultraviolett strålning till stamceller[J]. Experimental Dermatology, 2021, 30(4):560-571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et al. Melasmabehandling: En systematisk översikt[J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816-1837.

[4] Hossain MR, Ansary TM, Komine M, et al. Diversifierade stimuli-inducerade inflammatoriska vägar orsakar hudpigmentering[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Song X, Ni M T, Zhang Y, et al. Jämför de hämmande egenskaperna hos epigallokatekin-3-gallat och gallokatekingallat mot tyrosinas och deras kombinerade effekter med kojinsyra[J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad TF, et al. Inriktning på tyrosinas vid hyperpigmentering: Nuvarande status, begränsningar och framtida löften[J]. Biochemical Pharmacology, 2023, 212:115574.

[7] Cicero A L, Delevoe C, Gilles-Marsens F, et al. Exosomer frisatta av keratinocyter modulerar melanocytpigmentering[J]. Nature Communications, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Inre och yttre reglering av human hud melanogenes och pigmentering [J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40(4):328-347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U, et al. Ett mekanistiskt tillvägagångssätt för toxicitet och riskbedömning av tungmetaller, hydrokinon och mikroorganismer i kosmetiska krämer[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L, et al. Hydrokinon-inducerad hudirriterande reaktion kan uppnås genom att aktivera mastceller via masrelaterade G-proteinkopplade receptor X2[J]. Experimental Dermatology, 2023, 32(4):436-446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R, et al. Bibliometrisk analys av effekterna av ginseng på huden[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21(1):99-107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H, et al. Framsteg i biomedicinska funktioner av naturliga blekningsämnen vid behandling av hudpigmenteringssjukdomar[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J, et al. Synergistisk hudvård av Lonicera japonica polyfenoler och etanolextrakt av Vaccinium vitis-idaea L.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W, et al. Användning av komplex av flyktig olja från Salvia miltiorrhiza och maskrosextrakt i kosmetika[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen JR, Zhu XY, Cui HY, et al. Variationer av aktiva ingredienser och antioxidantaktiviteter analys av Cistanche deserticola från olika raser och delar i Xinjiang-provinsen[J]. Food Industry Science and Technology, 2024, 45(21):227‑233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y, et al. Tubulosid B, isolerad från Cistanche tubulosa, ett lovande medel mot M1-makrofagaktivering via synergistisk inriktning mot Mob1 och ERK1/2[J]. Biomedicin & Farmakoterapi, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Studie av fenyletanoidglykosider av Herba cistanches transdermal leverans och hämmande effekter på melaninsyntes i B-inducerad pigmentering hos brunt marsvin[D]. Urumqi: Xinjiang Medical University, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Synergistisk blekning, antioxidant och antiinflammatoriska aktiviteter av glabridin, resveratrol och poldatinkomplex[J]. Flavor Fragrance Cosmetics, 2024(3):99-107 233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Studie och tillämpning av Chou-Talalay-metoden för kombination av läkemedel mot tumör[J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2013, 30(4):449-453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Skin whitening agents: Medicinal chemistry perspective of tyrosinase inhibitors[J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017, 32(1):403-425