3D njurorganoider för översättning från bänk till säng

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Navin Gupta, et al

Abstrakt

Njurarna är viktiga organ som filtrerar blodet, tar bort urinavfall samtidigt som vätske- och elektrolythomeostasen bibehålls. Aktuella konventionella forskningsmodeller såsom statiska cellkulturer och djurmodeller är otillräckliga för att förstå den komplexa mänskliga in vivo-situationen eller saknar translationsvärde. Att accelereranjureforskning krävs nya forskningsverktyg. Den senaste utvecklingen har tillåtit riktad differentiering av inducerade pluripotenta stamceller för att generera njurorganoider.Njureorganoider liknar den mänskliga njuren in vitro och kan användas i regenerativ medicin och som utvecklings-, toxicitets- och sjukdomsmodeller. Även om nuvarande studier har visat stort lovande, kvarstår utmaningar inklusive omognad, begränsad reproducerbarhet och brist på perfuserbara kärl- och samlingskanalsystem. Denna recension ger en översikt över vår nuvarande förståelse av nefrogenes som möjliggjorde generering av njurorganoider. Därefter de potentiella tillämpningarna avnjureorganoider diskuteras följt av framtidsperspektiv. Denna recension föreslår att framsteg inom njurorganoidforskning kommer att underlättas genom vår ökande kunskap om nefrogenes och genom att kombinera lovande tekniker som organ-on-a-chip-modeller.

Nyckelord Njure organoid. Stamceller. Bioteknik.Nephron

Klicka här för att få mer information om Cistanche för njure

Introduktion

Njurar är viktiga organ som filtrerar blodet för att generera metabolt avfall, avsett för urinutsöndring. Njurarna har en anmärkningsvärd plasticitet när det gäller att skräddarsy sammansättningen av urin, matcha intag med utsöndring för att bibehålla lösta homeostas och vätskebalans. Eftersom däggdjursnjuren är ett icke-regenerativt organ, ackumuleras förlust av funktionella enheter, eller nefroner, över tiden hos alla individer [1]. Systemiska sjukdomar med hög prevalens, nämligen hypertoni och diabetes mellitus, medicinering eller hemodynamisk inducerad akutnjureskada(AKI) och primära njursjukdomar är vanliga orsaker till påskyndad förlust av njurfunktion och utgör de huvudsakliga orsakerna till kronisk njursjukdom (CKD) [2]. CKD är indelad i stadier baserat pånjure dysfunktion, vilket orsakar störningar i lösta ämnen och obalans i vätskor som är ansvariga för omfattande sjuklighet och mortalitet. I USA har CKD en rapporterad prevalens på 14 procent [3], har en årlig behandlingskostnad på 120 miljarder USD [4], påverkar livskvaliteten negativt [5] och kulminerar i avancerade stadier i njursjukdom i slutstadiet ( ESRD), vilket kräver behov av njurersättningsterapi (RRT). Former av RRT inkluderar dialys och transplantation, den förra står för 7 procent av Medicares budget [6] och den senare begränsad av tillgången på lämpliga organ [7]. CKD och ESRD utgör en stor börda för sjukvårdens resurser och kostnader, såväl som för patienter som lider av dessa sjukdomar [8].

För att ta itu med dessa bördor har grundläggande och translationell forskning utförts inom områdenanjure utveckling, nefrotoxicitetstestning, sjukdomsmodellering och njurregenerativ medicin. Traditionella forskningsverktyg består av cellodling in vitro, från både isolerade primära njurceller och viralt transformerade odödliga cellinjer, och in vivo djurmodeller. Även om dessa vanliga modeller har använts för att studera njurfysiologi och patologi med viss framgång, har de inneboende begränsningar som kan bidra till den dåliga översättningen av labbstudier till klinisk terapi [9]. In vitro-modeller är till stor del begränsade till analys av encellstyper, och ignorerar effekterna av intercellulära och miljömässiga interaktioner inom komplex heterogen vävnad, såsom njuren. Djurmodeller, även om de är integrerade med kroppssystem, begränsas av skillnader mellan arter, vilket resulterar i otrogna slutsatser som kommer till en hög kostnad för tid och kostnad [10]. Nya metoder för experimentering i mänskliga celler och vävnader är en nödvändighet för att övervinna begränsningarna hos traditionella forskningstekniker [11].

Eftersom nödvändigheten är innovationens moder har framsteg inom protokoll som använder mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) genererat komplex tredimensionell, flercellig och organspecifik vävnad, kallade organoider. Organoider i lever, lungor, hjärta, tarmar och njurar tillåter experiment i mänskliga vävnader in vitro [12]. I teorin kan vävnader som omfattar hela människans soma reproduceras i skala, tack vare hPSCs som definierar egenskaperna för pluripotens och självförnyelse. De två typerna av hPSCs är mänskliga embryonala stamceller (ESCs) och humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). År 1998, Thomson et al. beskrev först genereringen av ESC-linjer härledda från mänskliga blastocyster. För att kringgå kontroverser relaterade till embryonala ursprunget hos ESC: er, 2006, Takahashi et al. beskrev en revolutionerande metod för att inducera pluripotens i terminalt differentierade somatiska celler. Kallas iPSCs, dessa celler bildas av transkriptionell aktivering av Yamanaka-faktorer (Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc) [13]. Förutom att undvika etiska problem tillåter iPSC:er ytterligare personliga medicinska metoder. iPSCs representerar ett obegränsat utbud av celler som är isogena för deras föräldra somatiska cell [13]. Patientspecifika iPSCs med naturligt förekommande mutationer kan användas för att generera kliniskt relevanta sjukdomsmodeller i mänsklig vävnad, särskilt under tillstånd för vilka det inte finns någon djurmodell. I ärftliga sjukdomsmodeller kan genomkorrigerade kontroller etablera en direkt koppling mellan genotyp och fenotyp [14]. Tillvägagångssätt för immunkompetent regenerativ medicin kan använda bulk, organspecifik vävnad som genereras från en patients iPSCs, vilket negerar behovet av immunsuppression och kringgår bristen på transplanterbara organ [15]. Att utnyttja den translationella nyttan av hPSCs, särskilt iPSCs, kan revolutionera områdena läkemedelsutveckling och organtransplantation, vilket leder till dramatiska resultat för människors hälsa och sjukdomar.

Förmågan hos hPSCs att rekonstituera alla kroppens celler utgör en stor utmaning, specifikt hur man kontrollerar differentiering mot specifika cell- och vävnadstyper av intresse. Däggdjursorganogenes fungerar som arketypen för riktad differentiering, den effektiva sekventiella induktionen av mellanliggande celltyper som uppstår under organutveckling [16]. Omvänt involverar direkt omprogrammering induktion av celltypsspecifika transkriptionsfaktorer, förbigående av mellanliggande celltyper under omvandlingen av en somatisk cell mot en definierad målpopulation. Medan man drar nytta av en enklare metod, leder direkt omprogrammering ofta till ofullständig omvandling till målcellen på grund av DNA-metyleringsprofilen och epigenetik hos föräldracellen [17]. Även om direkt omprogrammering skedde med fullständig konvertering, är resultatet sannolikt en enhetlig cellpopulation [18]. När det gäller njuren bidrar mer än ett dussin olika celltyper till nefronets struktur och funktion in vivo. Återuppbyggnaden av ett nefron skulle kräva direkt omprogrammering till en gemensam förfader för alla bidragande celltyper, nämligen nefronstamceller, endotelceller och stromala stamceller [19]. Det erforderliga tillvägagångssättet för att utveckla vävnad som liknar den naturliga njuren är riktad differentiering, en metod som bygger på en djupgående kunskap om njurutveckling. I denna recension lyfter vi fram den viktiga roll som njurutvecklingsbiologi har spelat i genereringen av hPSC-härledda njurorganoider, kommenterar kortfattat tillämpningar av njurorganoidteknologi och diskuterar framtida riktningar som tar itu med nuvarande begränsningar och utmaningar för klinisk översättning.

Njurutveckling

Njurutveckling fungerar som guldstandarden för riktad differentiering, för att producera in vitro-vävnad som är mest bioliknande sin motsvarighet in vivo. Årtionden av utvecklingsstudier i däggdjursmodeller visade att Wnt, FGF, retinsyra och TGF-/BMP-vägar styr morfogenes, vävnadsmönster och induktion av organprimordia [12]. Dessa vägar är avgörande för den iterativa utvecklingen av vävnader över de tre bakterielagren, inklusive den mesoderm-härledda njuren. Mesodermen, inklämd mellan endodermala och ektodermala skikt, mönstras av gastrulation av hPSCs (främre epiblaster) genom den primitiva strimmen, en övergående struktur som definierar de främre-bakre och mediala-laterala axlarna hos det utvecklande embryot [12]. Den främre-bakre axeln av mesoderm bestäms av varaktigheten av involutionen genom den primitiva strimmen med tidsmässig exponering för Wnt-signalering, eftersom hPSCs som involverar genom den primitiva strimmen migrerar anteriort för att initialt bidra till främre strukturer, fylls efteråt [1]. Den mediala-laterala axeln för mesodermen bestäms av en rostrocaudal BMP-gradient i den primitiva strimmen, eftersom hPSCs som genomgår gastrulation genom den rostrala primitiva strimmen (låg BMP-aktivitet) blir paraxiella mesoderm, genom den mittprimitiva strimmen (måttlig BMP-aktivitet) blir intermediär mesoderm (IM), och genom caudal primitiv streak (hög BMP-aktivitet) blir lateral plate mesoderm [20, 21]. I den primitiva streaken är Wnt-signalens varaktighet och BMP-signalgraden viktiga bestämningsfaktorer för mönstring genom hela det mesodermala groddskiktet.

I utvecklingen av däggdjursnjurar finns det 3 nefriska stadier, pronephros, mesonephros och metanephros, som alla härrör från mesodermen. Studier på möss visar att metanephros, som kvarstår som den vuxna njuren, härrör från den ömsesidiga induktionen av två IM-härledda vävnader, det metanephric mesenkymet (MM) och ureteric knopp (UB) [22]. MM är sammansatt av nefron-progenitorceller (NPC) varvat med stromaceller, medan UB bildas som en kvarleva från Wolffian-kanalen, en degenerativ struktur som dränerar den primitiva mesonephrosen till cloaca [23]. Koncentrerade NPC:er av MM:s cap-mesenkym genomgår progressiv morfogenes från komma-formade till S-formade kroppar, som segmentellt differentierar sig till sammanhängande epitelstrukturer som omfattar nefronet, nämligen podocyter, proximala tubuli, en ögla av Henle, distala tubuli, och 24–27]. De anslutande tubuli av individuella nefroner konvergerar i ett grenat uppsamlingssystem som härrör från UB, efter ömsesidig induktion mellan de två vävnaderna [28]. UB-härledd Wnt-signalering katalyserar mesenkymal-till-epitelövergången (MET) av NPC:er till nefronepitel [29], medan MM-härledda GDNF-signaler genom Ret/GFRA1-komplexet styr förgrenad morfogenes [30] (Fig. 1).

Fig. 1 Utvecklingen av den mänskliga njuren från det primitiva strecket till ett mogen nefron. [1] Den primitiva streaken (PS) ger upphov till mesodermen och därefter till den mellanliggande mesodermen (IM) från vilken posterior IM (PIM) och anterior IM (aIM) kan särskiljas under tidig gastrulation. [2] Metanephric mesenchyme (MM) som inkluderar nefron stamceller (NPC) och stromaceller bildas från PIM medan aIM bildar Wolffian kanalen från vilken ureteric knopp (UB) utvecklas. UB börjar förgrena sig med NPC, stromala stamceller (SPC) och endotelceller (EPC). I detta skede infiltrerar inte vaskulaturen NPC-populationerna. [3] Därefter utvecklar NPC:erna njurvesiklar som bildar en kommaformad kropp följt av en s-formad kropp. Så småningom ansluter denna struktur med UB och blir en mogen nefron. Blodet filtreras i glomerulus (grå) som flyttar ultrafiltratet till uppsamlingsröret (gult) genom den proximala tubuli (orange), en ögla av Henle (blå) och den distala tubuli (grön). Markörer som motsvarar varje struktur ges.

Ett stort genombrott i vår förståelse av njurutveckling inträffade 2014 när Taguchi et al. upptäckte oväntat att T plus MM-prekursorer är utvecklingsmässigt skilda från Osr1 plus UB progenitorer [31], med hjälp av linjespårningstekniker, och noterade att tidigare arbete föreslog gemensamma anor i Osr1 plus IM utan ytterligare avgränsning [22]. I den tidigare nämnda studien användes en Osr1-GFP-mus för att bestämma att Osr1 uttrycks vid olika tidpunkter och olika platser i den nefriska zonen av IM. Genom histologisk analys och sortering/återaggregering av OSR1-GFP plus-celler i olika utvecklingsstadier kunde författarna visa att främre IM bidrar till mesonefros, mesonefri duct (Wolffian duct) och ureteric knop (utposa av Wolffian duct), medan den bakre IM innehåller Six2 plus Sall1 plus NPC från MM som differentierar till nefronets epitelceller. Bestämningen att MM härrör från den bakre IM och UB från den främre IM, tillsammans med karakteristiskt marköruttryck, tillhandahåller en färdplan för den specifika induktionen av de njurspecifika linjerna och har möjliggjort riktade differentieringsprotokoll för att effektivt inducera MM-härledd nefron epitel utan kontaminering av andra IM-derivat. Viktigt är att historiska studier antog musnjurutveckling återspeglade mänsklig nefrogenes. Genom att jämföra utvecklingen av njurar hos människa och mus har nya studier klarlagt både konvergenta och divergerande egenskaper, inklusive lobbildning, progenitor nischorganisation och uttrycket av presumtiva celltypsdefinierande markörer [32]. I sådana studier har mänskliga njurdata erhållits från postum embryonal vävnad, vilket möjliggör insikter i motsats till experiment. Tillkomsten av hPSC-härledda njurorganoider tillåter testbara hypoteser i mänsklig njurutveckling, bland translationella tillämpningar.

3D njurorganoider

Den senaste utvecklingen har möjliggjort bildandet av njurorganoider från humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPCS) genom riktad differentiering [33], vilket genererar en ny translationell plattform för läkemedelsutveckling och regenerativ medicinteknik. Organoider är mini in vitro-organ som självorganiserar sig från (stam)celler i 3D-mikromiljöer. De uppvisar stora likheter med sina motsvarigheter in vivo när det gäller vävnadsmorfologi, cellantal, proliferation och differentiering [34].

Efter att ha avgränsat de distinkta ursprungen för MM och UB under utveckling av däggdjursnjure och arbetat bakåt i ett stegvis tillvägagångssätt för att identifiera mellanstadier och deras karakteristiska marköruttryck, Taguchi et al. etablerade riktade differentieringsprotokoll för MM i både mus och mänskliga PSCs [31]. Specifikt utsattes embryoidkroppar bildade från OCT3/4 plus SOX2 plus hPSCs för utökad Wnt- och BMP4-signalering för att inducera T plus CDX2 plus begynnande mesoderm, som är avsedd att bidra till celler av bakre begynnande mesoderm. Den mediala-laterala axeln av mesodermen riktades mot WT1 plus HOXD11 plus OSR1 plus posterior IM genom samtidig behandling med BMP4, Activin och retinsyra. Därefter användes låg Wnt och FGF9 för att stödja utvecklingen av OSR1 plus SIX2 plus SALL1 plus WT1 plus NPC, med en rapporterad induktionseffektivitet på ~62 procent. Medan NPC genererades från både mus och mänskliga PSC, var samodling med mus embryonal ryggmärg nödvändig för att ytterligare differentiera dem till proximala tubuli, distala tubuli och podocytkluster.

Genom att använda både hESCs och hiPSCs i monolagerkultur, Morizane et al. beskrev ett riktat differentieringsprotokoll som inducerade SIX2 plus SALL1 plus WT1 plus NPC:er med upp till 90 procents effektivitet vid differentieringsdagarna 8–9. Kortfattat inducerade utökad Wnt-signalering en sen primitiv strimma som var föremål för aktivin för att bilda PIM, som differentierade till NPC:er som svar på FGF9. NPC:er aggregerades sedan i tredimensionell suspensionskultur genom centrifugering, utsatta för en övergående CHIR99021 (CHIR)-puls för att simulera UB-härledd Wnt-signalering för att katalysera MET i NPC:er, och fortsatte att vara föremål för FGF9 för att expandera och bibehålla stamheten hos NPC-nisch [35]. Efter CHIR-pulsen övergick MM till ett PAX8 plus LHX1 plus peritubulärt aggregat, som ytterligare differentierade till en LAM1 plus njurvesikel vid differentiering dag 14. Vid stokastisk differentiering (dvs. inga ytterligare faktorer) mönstrade njurvesiklar till nefronliknande strukturer som består av sammanhängande epitel som bär flera markörer för var och en av podocyter (NPHS1 plus PODXL plus ), proximala tubuli (LTL plus ), ögla av Henle (CDH1 plus UMOD plus ), distala tubuli (CDH1 plus UMOD - ) och anslutande tubuli ( CDH1 plus AQP2 plus ) [36].

Freedman et al. har använt ett annat tillvägagångssätt för att skapa ett förenklat protokoll för att få njurorganoider. Här har författarna använt en sandwich Matrigel-metod för att tillhandahålla en 3D-mikromiljö för hPSCs för att bilda sfäroider som omger ihåliga, fostervattenliknande håligheter [37]. Genom riktad differentiering stimuleras dessa sfäroider att bli njurorganoider med ett tvåstegsprotokoll. De bildade sfäroiderna behandlades med CHIR i 1,5 dagar följt av exponering för B27-kompletterat medium. På dag 10 bildades krystade, genomskinliga, rörformiga organoider efter den mesenkymala-till-epiteliala övergången. Takato et al. har identifierat utvecklingsdrag hos både samlingskanalen och njurens mesenkymföräldrar [38]. Här använde författarna denna information för att inducera både metanephric (vs mesonephric) mesenkym och uretiskt epitel med 4 dagars CHIR-exponering följt av 3 dagars FGF9-exponering. Aggregaten odlades sedan i 20 dagar, vilket tillät organoider att bildas som motsvarade en njure från första trimestern. Författarna har hävdat närvaron av samlingskanalen genom närvaron av GATA3- och ECAD-markörer. Men detta utvärderades senare som opålitligt eftersom distala och samlande tubuli härrörande från MM kan uttrycka dessa markörer också [39, 40] (Fig. 2).

Fig. 2 Riktade differentieringsprotokoll för att generera humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda njurorganoider. Likheterna och skillnaderna mellan de fyra protokollen för att generera mänskliga njurorganoider visualiseras. Varje visualiserat protokoll inkluderar tidsskalan i dagar, stadiet av organoidutvecklingen och de kompletterade faktorerna för att driva den riktade differentieringen och mognaden av organoiderna. Protokollen av Taguchi et al. och Takasato et al. resulterade i organoider på Transwell-membran. Morizane et al. möjliggjorde genereringen av njurorganoiderna i 96-brunnsplattor och Freedman et al. i ett Matrigel-sandwichtillvägagångssätt

Efter att ovanstående fyra riktade differentieringsprotokoll publicerades 2015, har flera grupper följt ett liknande tillvägagångssätt för att sekventiellt konvertera hPSCs till sent primitiv streak, PIM, MM, peritubulärt aggregat, njurvesikel och slutligen njurorganoider [41–44]. Wu et al. utförde en encellig transkriptomik som en jämförande analys mellan Morizane- och Takasato-protokollen, både mot varandra och mot mänsklig fosternjure (16 veckors graviditet) och vuxen mänsklig njure (62-årig man med normalnjurefungera). När de utvärderades under statiska förhållanden vid differentieringsdag 26 genererade båda protokollen omogen vävnad, som var och en uttryckte ~ 20 procent av vuxna proximala tubuli och podocyttranskriptionsfaktorer [41]. Emellertid har Tran et al. använde encellig transkriptomik på njurorganoider utvecklade med Morizane-protokollet för att stödja tillämpningen av organoidhärledda podocyter för sjukdomsmodellering och återställande av filtreringsfunktionen. Podocyter från organoider delade mycket liknande, progressiva transkriptionsprofiler med mänskliga fostrets njurar och rekryterade värdkärl vid transplantation för att främja ytterligare mognad [42]. Garreta et al. fann att transkriptionsprofilen för njurorganoider utökades till den för mänskliga fosternjurar under andra trimestern på dag 16 av differentiering genom att använda en mjuk hydrogel för att förlänga varaktigheten av en 3D-mikromiljö för att underlätta interaktioner mellan celler och celler [44] . Efter ett liknande differentieringsprotokoll, Low et al. utförde encellig RNA-sekvensering (RNAseq) som identifierade en undergrupp av nefronstamceller som en potentiell källa till njurkärlen, vilket skiljer sig från studier i musutveckling som visar källan som FLK1 plus endotelceller, som skiljer sig från NPC:er av MM [45] och härrör delvis från FOXD1 stromala stamfaderceller [46]. Ändå inkluderade andra viktiga fynd att Wnt-signalering styr vaskularisering och andelen proximala kontra distala nefronsegment, funktionell mognad av organoider efter implantation och modellering av autosomal recessiv polycystisk njursjukdom (ARPKD) med hjälp av patienthärledda iPSCs [43].

Translationell nytta av njurorganoider

I allmänhet är nuvarande forskningsmodeller för att studera sjukdomar eller föreningar ofta begränsade till cellstudier och djurmodeller. Cellmodeller är lätta att använda och kan appliceras i höga antal. Dessa inkluderar emellertid ofta encelliga linjer och kan inte förstå komplexiteten hos de mänskliga in vivo-njurarna, såsom 3D-mikromiljön och flera närvarande celler. Därför kan cellmodeller inte efterlikna in vivo 3D-vävnadsmorfologin och den heterogena och komplexa mikromiljön. För att ta hänsyn till den komplexa miljön in vivo har djurmodeller som möss varit en konventionell forskningsmodell. Dessa modeller är dock dåligt översättbara till mänskliga förhållanden [47, 48]. Dessutom har etiska farhågor om djuranvändning för forskningsändamål ökat [49, 50]

Därför krävs nya modeller som kan efterlikna specifikt den mänskliga situationen in vivo mer exakt [51].

Organoider har potential att övervinna dessa begränsningar på grund av deras unika förmåga att efterlikna människors in vivo-situation. Och eftersom organoider härrör från hiPSCs, kan de också användas för personlig medicin. Till exempel kan vissa (kombinationer av) föreningar testas med organoider som härrör från celler från en specifik person för att testa för toxicitet eller effektivitet. Även större applikationer är möjliga. Organoider kan till exempel användas som prekliniska modeller för att bestämma egenskaperna hos vissa föreningar. Dessutom kan tillförlitliga mänskliga sjukdomsmodeller användas i kliniska prövningar för att påskynda utvecklingen av behandlingar för särskilt sällsynta sjukdomar där det är ont om patienter.

Även om det krävs fler framsteg för att skapa fullt fungerande njurar in vitro, visar studierna hittills mycket lovande. Vissa studier har redan visat tillämpningar av njurens organoider som de är idag. Dessa framsteg inom njurorganoider möjliggör (framtida) tillämpning för regenerativ medicin och som utvecklings-, toxicitets- och sjukdomsmodeller. Bland dessa translationella tillämpningar betraktas organoider också som potentiella metoder för tillämpning av regenerativ medicin för att skapa biotekniska njurar för att introducera alternativa terapier till dialys och njurtransplantation (Fig. 3). Eftersom många recensioner har rapporterat de publicerade translationella tillämpningarna av njurorganoider [1, 52–59], fokuserar denna recension på den framtida generationen av stamcellshärledd njurvävnad som är histologiskt biolik den inhemska mänskliga njuren för att underlätta översättning av njurorganoidforskning för att påverka den kliniska vården.

Aktuella utmaningar och framtidsperspektiv

Njuren är ett starkt vaskulariserat organ som tillsammans tar emot 20 procent av hjärtminutvolymen och filtrerar upp till 180 l blod per dag [60]. Nitton kilometer glomerulära kapillärer, med en yta på ~ 6000 cm2, bidrar till den glomerulära filtrationsbarriären (GFB) [61]. Beståndsdelar i GFB är fenestrerade glomerulära kapillärer, det negativt laddade glomerulära basalmembranet och podocyter som uppvisar slitsmembran mellan fotprocesser [61]. Strukturen av GFB ger dess funktion, blodfiltrering baserat på storleken och laddningen av lösta ämnen. Den primitiva urinen som bildas från glomerulär filtration kommer in i nefrontubuli, där den bearbetas av absorptiva och sekretoriska mekanismer. Av de upp till 180 l filtrat absorberas ~ 99 procent med endast 1–2 l avsedd för urinutsöndring under normala förhållanden. Med tanke på avsevärd volymresorption i peritubulära kapillärer är det föga förvånande att flera nefroner dräneras till delade uppsamlingskanaler som konvergerar vid njurbäckenet för att bilda solitära urinledare. Den övergripande strukturen, från omfattande proximal nefronvaskularisering till utbredd tubulär epitel-peritubulär kapillärbäddskommunikation till arboriserad distal nefrondränage, spelar en avgörande roll för njurfunktionen. Njurar bibehåller en relativt nödvändig funktion även när kapaciteten minskar till 20 procent, med många av dessa patienter förblir symtomfria. Men minskningar till under 15 procent leder ofta till behovet av RRT [62, 63]. NPC:er med regenerativ förmåga går förlorade hos människor före födseln, och därför kan nefronerna inte förnyas. För närvarande finns det inga terapier tillgängliga för att fylla på förlorad njurfunktion, så det finns en stor efterfrågan på tillämpningar för regenerativ medicin. Dessutom krävs en GFB för att modellera sjukdomar som påverkar filtration, funktionell tubulär transport som krävs för en mängd olika toxicitetstester och sjukdomsmodellering, och kombinationen av MM-härledda nefroner med UB-härledda uppsamlingskanaler som är nödvändiga för att modellera de flesta medfödda anomalier i njuren och urinvägar (CAKUT) [64]. Utvecklingen av organiserad renal vaskulatur och ett förgrenat uppsamlingssystem skulle representera betydande translationella språng i njurorganoidteknologi.

Njurorganoid vaskularisering

Vaskularisering av njuren involverar två distinkta processer: vaskulogenes och angiogenes [65]. I vaskulogenes sker kärlsammansättning de novo, medan angiogenes involverar förgrening eller förlängning av redan existerande kärl. Samspelet mellan dessa två processer under nefrogenes är fortfarande okänt, men vaskulogena njuremikrokärl kan föregå utvecklingen av den angiogena njurartären [65]. Hos möss har MM ingen vaskulatur under invasion av uretisk knopp, men utvecklar ett rikt kapillärnätverk följande dag med efterföljande bildning av vaskulariserade glomeruli. Det senare realiseras av endotelceller som invaderar den vaskulära klyftan för att bilda glomeruli i enkelkapillärslinga [66–68]. Samtidigt bidrar vaskulogena FLK1 plus endotelceller insprängda i MM till det rika glomerulära kapillärnätverket [69]. I likhet med riktade differentieringsmetoder för att bilda MM ex vivo, bör vaskularisering av hPSC-härledd njurvävnad följa dess embryonala ursprung för att utveckla det mönstrade, hierarkiska njurvaskulära nätverket.

3D-njurorganoider utvecklade från de initiala protokollen för PIM-härledd MM visade sig innehålla vaskulära celler; glomeruli förblev dock till stor del avaskulär, och den totala mängden blodkärl var dålig jämfört med inhemsk njurvävnad [70]. Viktigt är att dessa vaskulogena blodkärlsaggregat efterliknar tidig bildning av mikrokärl under utvecklingnjurevävnad, som inträffade före angiogen njurartärinvasion [65]. I deras framstående arbete, Taguchi et al. transplanterade deras inducerade mus-MM till möss, med angiogen värdhärledd kärl som resulterade i ökade glomerulära kapillärer. WT1 plus podocytkluster samlokaliserade med PECAM1 plus kärl, som visade sig innehålla röda blodkroppar från värdar vid bildbehandling [31]. Liknande subkapsulär transplantation av njurorganoider har upprepats, vilket visar att kärlstrukturen i glomeruli hos organoider ihållande härrör från värden och bildandet av ett tidigt glomerulärt basalmembran bestående av fenestrerade endotelceller och podocytfotprocesser [71]. En liten grad av glomerulär filtration har hävdats vid subkutan transplantation av njurorganoider, baserat på intracellulär detektion i tubuli av systemiskt administrerade fluorescerande dextraner tagna för att beteckna upptag från glomerulärfiltratet [72]; dock kan apikalt upptag som möjliggörs av brist på täta förbindelser genom hela Bowmans kapsel till den proximala tubuli eller basolateralt upptag via tubulära fagocytiska mekanismer inte uteslutas [73]. Byggande på deras arbete där njurorganoider transplanterade under njurkapseln blir vaskulariserade av värden och visar glomerulär och tubulär mognad [71], nyligen, nyligen, van den Berg et al. utvecklat ett elegant in vivo-system som använder högupplöst multifotonavbildning för att demonstrera storleksselektiv glomerulär siktning [74]. Noterbart är att vaskulariserade glomeruli som bildas från interspecies chimär vävnad misslyckas med att övervinna begränsningar relaterade till det pågående beroendet av djursystem, inklusive utvecklingsmässiga och fysiologiska skillnader mellan arter, en betydande förlust av personliga medicinmetoder, låg genomströmning och höga kostnader.

Njurorganoid vaskularisering har uppnåtts in vitro, med liknande resultat som rapporterats i transplantationsexperiment. Genom att kombinera njurorganoid- och njure-på-ett-chip-teknologier för att rekapitulera den flytande mikromiljön in vivo, har Homan och Gupta et al. fann att flytande skjuvspänning applicerad på inbäddade njurorganoider på chipet underlättade bildandet av perfuserbara kärlnätverk som utvecklats från expansionen och differentieringen av saminducerade endoteliala progenitorceller. Dessutom visade författarna ökad polaritet och mognad av tubulära epitelceller och podocyter, som manifesterar fotprocesser som stötte mot glomerulära kapillärer för att bilda en primitiv GBM [70, 75]. Även om njurens organoider var superfuserade, i motsats till att strömma begränsat till inom kärlsystemet, simulerar appliceringen av flytande skjuvspänning på hela organoider det interstitiella flödet som genereras av vätskeförskjutningar i fack under reabsorption av ~ 99 procent av det glomerulära filtratet. Med andra ord, ~ 99 procent av volymen i tubulära lumen överförs över interstitium och reabsorberas av de peritubulära kapillärerna in vivo. Även om perfuserbar vaskulatur visades med fluorescerande prober, stöddes inte glomerulär filtration av detektering av fluorescens i tubulära lumen på grund av användningen av pärlor som var 500 nm i diameter, samtidigt som den genomsnittliga diametern för fenestrationer i glomerulära kapillärer är ~ 70 nm [ 76]. Noterbart är att all kärlstruktur i systemet härrör från njurens organoider utan angiogen invasion.

Metoder för att övervinna de nuvarande utmaningarna inkluderar koppling av angiogena vaskulära nätverk in vitro med vaskulogena njurorganoider för att tillåta mognad av GBM med funktionell glomerulär filtrering. Det finns en mängd rimliga orsaker till att definitiv glomerulär filtration ännu inte har inträffat i njurorganoid-på-chip-tillvägagångssätt, inklusive avsaknad av longitudinella experiment, begränsat hydrostatiskt tryck som överförs i glomerulära kapillärer, omogning av nefronepitel och potentialen för väsentlig cirkulation faktorer som underlättar utvecklingen av embryonal njure. Direkt perfuserbara angiogena vaskulära nätverk in vitro har tidigare beskrivits, som kan stödja tjock vävnad eller invadera inbäddade cellulära konstruktioner på chip [77, 78]. Sådan kärlstruktur kan anastomisera med organoidhärledda mikrokärl för att begränsa perfusion till kärlutrymmet, vilket möjliggör överföring av betydande hydrostatiskt tryck till glomerulära kapillärer. Andra begränsningar kan åtgärdas genom att använda longitudinella studier, perfusion med embryonalt serum och använda optimala organoider för differentieringsdag (som påverkar mognad) i sådana enheter. Om det angiogena vaskulära nätverket bestod av mänskliga celler, skulle begränsningar relaterade till skillnader mellan arter kringgås. På liknande sätt skulle användningen av hPSC-härledda blodkärl, som har beskrivits [79], underlätta personliga medicinmetoder för både läkemedelsutveckling och regenerativa medicinstrategier.

Ureterisk knoppbildning

Produktionen av glomerulärt ultrafiltrat ex vivo skulle representera en milstolpe upptäckt för att underlätta translationella tillämpningar av stamcellshärledd njurvävnad, men ändå skulle ett uppsamlingssystem krävas för efterföljande dränering. Ett dikotomt förgrenat samlingskanalnätverk konvergerar produktionen av en individuell njures ~ 1 miljon nefroner till en enda urinledare [60]. Uppsamlingskanalerna transporterar inte bara filtratet utan är också involverade i vattenreabsorption och elektrolytbalans via olika transportörer och kanaler i dess olika typer av tubulära epitelceller. Samlingskanalerna är en produkt av förgrenad morfogenes av ureterknoppen som styrs av olika molekylära signaler som kan utnyttjas in vitro för att efterlikna denna process, inklusive FGF, GDNF/RET och Wnt-signalvägar [68].

Njurutvecklingsstudier med mikrodissekerade mus MM och UB ger betydande insikt i den tidiga bildandet av vad som kommer att utgöra den vuxna mänskliga njuren. Oinducerad MM, separerad från epitelstrukturer i UB, förhindrar mognad av någon av vävnaderna. Samodling av MM och UB ex vivo kan emellertid rekonstituera musnjuren, vilket tyder på att dessa njurprekursorpopulationer har ett självautonomt program som är tillräckligt för att driva njurorganogenes [80]. Ur ett utvecklingsperspektiv kommer den optimala metoden för att utveckla funktionell njurvävnad från hPSCs in vitro sannolikt att involvera separat inducering av MM och UB med hög effektivitet och samodling av de två distinkta populationerna.

De tidigare beskrivna differentieringsprotokollen genererar huvudsakligen MM, avsett att bli nefronstrukturer. Riktad differentiering mot att samla in kanalens stamceller från UB publicerades först 2013, innan Taguchi avgränsade de divergerande IM-ursprunget för MM och UB. Xia et al. konverterade hPSCs till mesodermal engagerad vävnad med FGF2 och BMP4 i 2 dagar, inducerade sedan UB-progenitorceller med en kombination av aktivin, BMP2 och retinsyra under ytterligare 2 dagar i ett tvåstegsdifferentieringsprotokoll [81, 82]. hPSC-härledda UB-progenitorceller självmonterade till chimär vävnad mellan arter när de kombineras med embryonal mus MM. Under 2017, genom att analysera genuttrycksprofiler under utveckling av ureterknoppar i musembryon, tog Taguchi et al. har upprättat ett protokoll för att inkludera både MM- och UB-vävnad i njurens organoider med hjälp av mus-ESCs (mESCs) [83]. Detta protokoll var baserat på FACS-sorterande CXCR4 plus KIT plus Wolffian duct stamfader. Samodling av Wolffian duct progenitors med mESC-härledd MM krävde närvaron av stromala progenitorceller för att bilda återmonterade organoider som genomgick högre ordningens organogenes för att bilda nefroner sammankopplade med ett förgrenat ureteriskt epitel. I slutändan replikerades fynden inte i hPSCs-härledda MM och UB på grund av för tidigt upphörande av UB-grening, vilket författarna trodde kan bero på avsaknaden av den stromala progenitorpoolen [83]. Etableringen av riktad differentiering till humana njurstromala progenitorer och ökad tillgång till primära humana fetala njurvävnader kan urskilja orsaken till den rapporterade ofullständiga förgrenade morfogenesen. Ändå kan det finnas begränsningar i induktionseffektiviteten för den erforderliga celltypen, nämligen prolifererande Ret plus UB spetsceller, som är ansvariga för att förgrena sig och bilda en strukturell koppling med de anslutande tubuli av distala nefroner [84].

Det finns en brist på riktade differentieringsprotokoll för hPSCs mot UB och dess derivat, med de publicerade protokollen som visar begränsningar. Förbättrade protokoll krävs för att tillåta tillägget av ett samlingskanalnätverk för att täcka hela nefroninnehållande njurorganoider. Analogt med att maximera induktionseffektiviteten för NPC:er baserade på SIX2-uttryck, är maximering av induktionseffektiviteten för UB-spetsceller baserad på Ret-uttryck en sådan strategi. För detta krävs en förståelse för njurutveckling. Noterbart bildas UB som en utposning av Wolffian-kanalen (alias mesonephric duct), som genereras från den kaudala migrationen av främre IM-celler ner i urogenitala sinus till cloaca, och noterar att dessa celler genomgår MET längs vägen. UB:s kretslopp utgör en utmaning för upprättandet av ett robust riktat differentieringsprotokoll. Ret-uttryckande mesenkymala celler som finns i aIM kan dock bidra till UB [84], så att ett 3-stegprotokoll kan konvertera hPSCs till tidig primitiv streak (steg 1), sedan aIM (steg 2) , sedan Ret plus UB spetsceller (steg 3). Noterbart inkluderar det cellulära arkivet för NIH:s ReBuilding a Kidney (RBK) konsortium en Ret-reporterlinje

Slutsats

Njuren är ett märkligt organ som bland annat reglerar kroppens vatten- och elektrolythomeostas. Oreglering av dessa processer kan leda till allvarliga hälsokomplikationer med hög samhällelig och ekonomisk belastning. Genom vår förståelse av mänsklig nefrogenes in vivo, kastar vi ljus på att återskapa denna process in vitro. Aktuella framsteg har möjliggjort genereringen av hiPSC-härledda njurorganoider. Dessa njurorganoider liknar den mänskliga njuren och ger ytterligare fördelar jämfört med konventionella forskningsmodeller. Användningen av njurorganoider inkluderar regenerativ medicin och utvecklings-, toxicitets- och sjukdomsmodeller. Trots framsteg under de senaste åren kräver njurorganoider förbättrade protokoll och modifieringar mot vävnadsmognad, perfuserbar kärl och integrering av uppsamlingssystem. Därefter måste dessa system vara anpassade för att ge ytterligare värde till de konventionella cell- och djurforskningsmodellerna eller till och med ersätta dem. Att förbättra protokollen för generering av organoider genom vår ökande kunskap om njurutveckling, kombinerat med antagandet av organ-on-a-chip-teknologi, kan underlätta och påskynda översättningen av 3D-njurorganoider till klinisk användning.

Från: '3D njurorganoider för översättning från bänk till säng' avNavin Gupta, et al

---J Mol Med (2021) 99:477–487