[6]-Gingerol underlättar CXCL8-sekretion och ROS-produktion i primära mänskliga neutrofiler genom att rikta in sig på TRPV1-kanalen del 1

1. Introduktion

Att identifiera livsmedelsingredienser med immunmodulerande egenskaper tillsammans med deras respektive molekylära mål har tilldragit sig ett ökat intresse de senaste åren. På grund av deras höga liganddiversitet representerar den transienta receptorpotentialöverfamiljen av jonkanaler (TRP-kanaler) en mycket intressant klass av potentiella målstrukturer.

Ett molekylärt mål är en specifik molekyl som ett läkemedel verkar på i kroppen. Immunitet hänvisar till styrkan i kroppens förmåga att motstå sjukdomar.

Det finns ett nära samband mellan molekylära mål och immunitet. Effekterna av läkemedel påverkar ofta kroppens immunitet. Till exempel kan vissa läkemedel behandla vissa kroniska sjukdomar genom att störa funktionen hos en organisms immunsystem. Dessutom använder tumörbehandling ofta riktad terapi, det vill säga inriktning på vissa molekylära mål för att attackera cancerceller, och därigenom förbättra immunitetens förmåga att bekämpa cancerceller.

Dessutom kommer styrkan av immunitet också att påverka effekten av läkemedel. Personer med försvagat immunförsvar kan uppleva biverkningar eller mindre effektiva mediciner när de används eftersom immunsystemet inte absorberar läkemedlen bra, vilket resulterar i mindre effektiv behandling. Därför är det mycket viktigt att upprätthålla ett sunt immunförsvar för läkemedelsbehandling.

Sammanfattningsvis finns det ett nära samband mellan molekylära mål och immunitet, och en fullständig förståelse för detta samband är av stor betydelse för rationell användning av droger. Vi bör aktivt förbättra vår immunitet, använda droger korrekt enligt läkarens råd och förbättra immuniteten genom riktad terapi för att bättre skydda vår hälsa. Ur denna synvinkel måste vi förbättra vår immunitet. Cistanche kan förbättra immuniteten avsevärt eftersom Cistanche även har antivirus- och anticancereffekter, vilket kan stärka immunförsvarets förmåga att bekämpa och förbättra kroppens immunitet.

Klicka på hälsofördelarna med cistanche

Däggdjurs-TRP-kanalsuperfamiljen inkluderar sex besläktade proteinfamiljer, nämligen ankyrin (TRPA), den kanoniska (TRPC), melastatin (TRPM), mucolipin (TRPML), polycystin (TRPP) och vanilloida (TRPV) familjen, som alla vanligtvis delar sex transmembransegment som sätts samman som tetramerer för att bilda katjonpermeabla porer med varierande katjonselektivitet.[1] TRPV1-kanalen kan vara den överlägset mest intensivt undersökta medlemmen av TRP-superfamiljen. TRPV1 identifierades initialt som receptorn för capsaicin, den skarpa komponenten i chilipeppar.[2] Senare visades också de skarpa ingredienserna från ingefära, gingerolerna, aktivera TRPV1.[3]

Den biologiska rollen för TRPV1 i icke-neuronala celltyper är fortfarande under omfattande utredning, men de tillgängliga resultaten innebär funktioner långt bortom sensorisk och termisk perception. Till exempel förhindrade en 12-veckas intervention med en daglig dos av 0,15 mg av TRPV1-agonisten nonivamid, en strukturell capsaicinanalog, en kostinducerad ökning av kroppsfettmassan och ökad plasmaserotonin nivåer hos friska överviktiga försökspersoner.[4]

I 3T3-L1-adipocyter minskade aktivering av TRPV1 av nonivamid lipidackumulering under differentiering och mognad genom att undertrycka PPAR𝛾-uttryck.[5] I makrofager försvagade kapsaicin och nonivamid en LPS-inducerad frisättning av pro-inflammatoriska cytokiner som IL6, CXCL8 och TNF-alfa, på ett TRPV1-beroende sätt.[6] Ändå förblir de särskilda funktionerna hos TRPV1 i humana blodleukocyter vaga. I humana NK-celler inducerade 10 och 50 μM capsaicin en ökning av intracellulär Ca2 plus-koncentrationer, vilket indikerar en funktionell TRPV1-kanal.[7]

Dämpade NK-cellseffektorfunktioner såsom cytotoxisk degranulering och cytokinutsöndring, inducerad av förbehandling av cellerna med capsaicin under 1 timme i ett koncentrationsområde på 10–100 μM, var dock till stor del TRPV1-oberoende.[7 ] I T-celler dokumenterades TRPV1 vara involverad i processerna för T-cellsreceptorsignalering, T-cellsproliferation och differentiering, såväl som cytokinproduktion.[8] Tidigare arbete från vår grupp visade också funktionellt uttryck av TRPV1 i humana primära T-celler.[9] Vidare visade dos-responsanalyser i koncentrationer från 0,03 till 300 μmol L−1 att [6]-gingerol hämmar cytokinutsöndring av primära humana leukocyter med ett IC50-värde på 82,2 μmol L−1.

Kvantifiering av [6]-gingerol i plasmaprover från friska försökspersoner visade dock en genomsnittlig maximal plasmakoncentration på endast 42.0 ± 16.3 nmol L−1 efter intag av 1 L ingefärste. Eftersom dessa [6]- gingerolkoncentrationer inte hade någon signifikant inverkan på cytokinutsöndringen i tidigare studier, [9] är det oklart om en kostrelevant koncentration på 50 nmol L−1 uppnås i blodplasma efter konsumtion av 1 L ingefära te, är tillräckligt för att modulera cellulära immunsvar i andra humana primära leukocyter.

För mänskliga neutrofiler är kunskapen om TRPV1:s funktionella roll begränsad. Medan Köse och Nazıroglu˘ [10] visade att Ca2 plus-flöden i neutrofiler som svar på 10 μM kapsaicin minskade av TRPV1-antagonisten kapsazepin, visade andra resultat inte att capsaicin inducerade ett Ca2 plus-inflöde när det testades i ett koncentrationsområde på 1 –100 μM, trots ett detekterbart TRPV1 RNA-uttryck.[11]

Neutrofiler är de vanligaste leukocyterna i mänskligt blod och står för 60–70 procent av alla cirkulerande vita blodkroppar. De är de första immuncellerna som rekryteras till infektionsställena; de kallas därför ofta för den första försvarslinjen.[12] Rekrytering av neutrofiler utlöses av bland annat den bakteriella eller mitokondrierhärledda peptiden N-Formylmetionin-leucyl-fenylalanin (fMLF) eller kemokiner som CXCL8 (IL-8).[13]

Neutrofilers försvarsmekanismer inkluderar fagocytos,[14] frisättning av antimikrobiellt enzym via degranulering,[15] generering av reaktiva syrearter (ROS),[16] och bildandet av neutrofila extracellulära fällor.[17] Förutom dessa direkta försvarsmekanismer bidrar neutrofiler ytterligare till efterföljande immunsvar via frisättningen av olika cytokiner och kemokiner.[18] Neutrofiler kan också genomgå en primingsprocess som gör att de kan svara starkare på efterföljande full aktivering.[16b]

Under de senaste åren har bevis vuxit fram för att ingredienser från mat och/eller medicinalväxter kan modifiera en eller flera av de nämnda försvarsreaktionerna hos mänskliga neutrofiler. Dessa modifieringar inkluderar ökad fagocytotisk aktivitet[19] och ROS-generering,[20] förstärkt kemotaxi mot fMLF,[21] och bildning av neutrofila extracellulära fällor.[20] Den eller de aktiva föreningarna identifierades emellertid inte. Beståndsdelar från Ferula akitschkensis (𝛽-pinen, sabinen, 𝛾-terpinen, geranylaceton och isobornylacetat) desensibiliserade neutrofiler mot fMLF- och CXCL8- inducerade Ca2 plus influx och hämmade fMLF-inducerade geranton-geranton inducerade effekter medierades via TRPV1.[22]

Baserat på tillgängliga data antog vi att ligand-inducerad aktivering av TRPV1 av [6]-gingerol kan påverka allmänna neutrofila funktioner, antingen direkt eller genom att förbättra deras svar på aktiverande stimuli. Inom ramen för denna hypotes syftade vi särskilt till att klargöra om en verifierad näringsrelevant koncentration är tillräcklig för att modulera cellulära immunsvar i mänskliga primära neutrofiler som en del av leukocytpopulationen. '

Dessutom försökte vi jämföra RNA-uttrycksnivåerna för alla medlemmar av däggdjurs-TRP-superfamiljen i fem av de mest framträdande celltyperna i humant blod för att få en kvalitativ och kvantitativt omfattande översikt av TRP-kanaluttryck i humana leukocyter.

2. Resultat

2.1. Överflöd och relativa transkriptionsnivåer av TRP-kanaler i humana leukocyter

För att utvärdera TRP-kanal-RNA-uttryck i blodleukocyter, isolerades fem av de mest framträdande leukocytcelltyperna från blodet från friska donatorer, och RNA-uttrycket av TRP-kanaler analyserades via kvantitativ RT-PCR (Figur 1).

Specifika transkript av TRPV såväl som TRPM-familjen detekterades med höga frekvenser på 75–100 procent i alla analyserade celltyper. Den genomsnittliga totala frekvensen med tanke på alla celltyper var 96 procent för TRPV-familjen och 98 procent för TRPM-familjen. TRPC-specifika transkript var mycket mindre rikligt, från 0 procent i monocyter, NK-celler, T-celler och B-celler till 100 procent i NK-celler och T-celler med en total medelfrekvens på endast 53 procent (Figur 1A). Det TRPC5-specifika transkriptet detekterades endast i neutrofiler, med en frekvens på 70 procent.

Dessutom avslöjade det TRPA1-specifika transkriptet i allmänhet en ganska låg förekomst i celltyperna som analyserades med en frekvens på 100 procent i neutrofiler, 25 procent i monocyter, 80 procent i NK-celler, 100 procent i T-celler och 60 procent procent i B-celler. På samma sätt visade det TRPML3-specifika transkriptet en låg frekvens i neutrofiler (50 procent), monocyter (25 procent), NK-celler (40 procent) och B-celler (20 procent), men en frekvens på 100 procent i T-celler. Det TRPV1-specifika transkriptet detekterades i alla celltyper och visade en frekvens på 100 procent i monocyter, NK-celler och T-celler, och en frekvens på 90 procent i neutrofiler och 80 procent i B-celler.

När det gäller relativt RNA-uttryck, jämfört med respektive frekvenser, avslöjade TRP-kanalerna ett mer celltypsspecifikt uttrycksmönster, vilket framgår av jämförelsen av respektive Δct-värden i de olika celltyperna som analyserats (Figur 1B). Till exempel detekterades TRPP3 med en frekvens på 100 procent i alla celltyper men visade den högsta uttrycksnivån i monocyter.

Däremot upptäcktes TRPV2-kanalen i alla de undersökta celltyperna, med en jämförbar hög RNA-expressionsnivå såväl som en hög frekvens. På samma sätt var transkriptnivåer av TRPV1 liknande i alla undersökta celltyper (Figur 1B).

2.2. TRPV1 ytuttryck på neutrofiler

Den nuvarande kunskapen om funktionen av TRPV1 i mänskliga neutrofiler är fortfarande oklar. För att ytterligare utforska rollerna för TRPV1 i humana neutrofiler, undersökte vi nästa om TRPV1-kanalen uttrycks på ytan av primära humana neutrofiler med hjälp av levande cellflödescytometri (Figur 2).

De isolerade neutrofilerna färgades för CD15 som en ytmarkör för neutrofiler (Figur 2A, B) och färgades samtidigt antingen med en antikropp framkallad mot en epitop i den första extracellulära slingan av TRPV1-proteinet (Figur 2B) eller respektive isotypkontroll, sistnämnda tjänar som ett surrogat för att mäta ospecifik bindning (Figur 2A). Inom CD15 plus-populationen analyserades fluorescensintensiteten för FITC. Färgning av neutrofilerna med TRPV1-antikroppen ledde till en särskiljbar fluorescenssignal jämfört med isotypkontrollen, vilket bekräftade ytuttrycket av TRPV1 i primära humana neutrofiler (Figur 2C). Analys av neutrofiler från fyra individuella donatorer avslöjade ett jämförbart ytuttryck av TRPV1 (Figur 2D).

2.3. [6]-Gingerol-inducerad ökning av intracellulär Ca2 plus

Eftersom ligand-inducerad aktivering av TRPV1 kommer att resultera i ett inflöde av Ca2 plus, [23] bestämdes intracellulära Ca2 plus koncentrationer av neutrofiler via det Ca2 plus -känsliga färgämnet Fura-2. Baserat på våra tidigare fynd[9] valdes en koncentration på 50 nM av den välkända TRPV1-liganden [6]-gingerol och en inkubationstid på 2 timmar. Analyserna visade att inkubation av neutrofiler med 50 nM [6]-gingerol resulterade i ökade intracellulära Ca2 plus-koncentrationer som i genomsnitt var 18,4 procent ± 1,0 procent av maxvärdet, vilket bestämts genom att applicera 1 μM av jonoforen jonomycin. Ökningen inducerad av DMSO var 4,7 procent ± 1,2 procent (Figur 3).

2.4. Inverkan av [6]-Gingerol på TRPV1-uttryck

Därefter syftade vi till att analysera effekten av TRPV1-stimulering av [6]-gingerol på TRPV1-uttryck på transkriptnivån via q-RTPCR såväl som på ytproteinnivån via färgning av levande celler. För detta ändamål inkuberades humana neutrofiler med 50 nM [6]- gingerol i 2 timmar, och respektive uttrycksnivåer kvantifierades.

Denna 2 timmar långa inkubation påverkade varken TRPV1-transkript eller proteinnivåer (Figur 4) och förändrades inte heller, förutom IL6, IL17A, IL24, C5 och GDF5, RNA-uttrycket av vanliga cytokin- och kemokingener som undersöktes (Figur S1, Tabell). S2, Stödinformation).

2.5. Inverkan av [6]-Gingerol på uttryck av neutrofila ytmarkörer

I denna uppsättning experiment frågade vi om [6]-gingerol har en inverkan på uttrycket av vanliga ytmarkörer för neutrofiler. Vi fann att uttrycket av markörerna CD11b och CD66b ökade efter 2 timmars inkubationsperiod med [6]-gingerol jämfört med lösningsmedelskontrollen, medan CD62L var opåverkad (Figur 5). Ytuttrycket av fMLF-receptorn FPR1 var dessutom signifikant förhöjt efter behandling av cellerna med 50 nM [6]-gingerol jämfört med lösningsmedelskontrollen.

For more information:1950477648nn@gmail.com