En ny Netrin-1-härledd peptid förbättrar skyddet mot neuronal död och mildrar intracerebral blödning hos möss del 2

Dessutom fann vi att peptid El specifikt aktiverade FAK- och SFK-signalvägarna. Därför kan peptid El ha mycket specifika effekter och vara effektiv i återhämtningsprocessen efter ICH.

Det finns ett samband mellan hög specificitet och minne. Hög specificitet hänvisar till den starkare aktiviteten i specifika delar av hjärnan när människor utför en uppgift. Minne avser människors förmåga att lära sig och komma ihåg information. När vi lär oss att använda hög specificitet för att utföra en uppgift kommer vårt minne också att öka.

Forskning visar att när vi har specialiserad kompetens och erfarenhet av en uppgift kommer hjärnan gradvis att bygga specialiserade neurala kretsar och minnesmönster. Dessa kretsar och mönster kommer att ha en specifik effekt på svaret på uppgiften, och därigenom förbättra uppgiftens effektivitet. Samtidigt, när du utför liknande uppgifter i framtiden, kommer dessa kretsar och mönster också att aktiveras för att hjälpa oss att bättre komma ihåg och utföra uppgiften.

Uppgifter med hög specificitet inkluderar musik, språk, sport, etc., och att lära sig dessa färdigheter kan förbättra vårt minne. Till exempel, när en pianist övar på att spela, kommer hjärnan att lära sig de specifika färdigheterna hos pianot och fortsätta att stärka dessa kretsar under övningsprocessen. Etableringen och förstärkningen av dessa kretsar kommer också att förbättra pianistens förståelse och minne av musiken.

Därför finns det ett positivt samband mellan hög specificitet och minne. Att lära sig specifika färdigheter och erfarenheter kan inte bara förbättra vår exekveringseffektivitet utan också stärka vårt minne, vilket hjälper oss att bättre lära oss och komma ihåg olika information. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom det har antioxidant-, antiinflammatoriska och anti-aging-effekter, vilket kan hjälpa till att minska oxidation och inflammatoriska reaktioner i hjärnan och därigenom skydda hälsan hos hjärnan. nervsystemet. Dessutom kan Cistanche också främja tillväxt och reparation av nervceller, och därigenom förbättra anslutningen och funktionen hos neurala nätverk. Dessa effekter kan bidra till att förbättra minnet, inlärningsförmågan och tankehastigheten, och kan också förhindra uppkomsten av kognitiv dysfunktion och neurodegenerativa sjukdomar.

Klicka på vet kosttillskott för att öka minnet

Till skillnad från peptid E1 kan peptid E2 aktivera ERK-signalering, vilket främjar neuronal död. Detta kan orsakas av en Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G-motifin E2 som kan aktivera ERK-signalvägen [28].

Detta indikerar att olika Netrin-1-härledda peptider har olika funktioner. Huvudreceptorerna för Netrin-1 är DCC och medlemmar av UNC5-familjen [50]. Rollen av DCC och UNC5H2 i ICH är fortfarande kontroversiell [51,52].

Sekvensen av Netrin-1vi identifierade är avgörande för interaktionen mellan Netrin-1 och DCC [19]. Dessa resultat tyder på att DCC kan delta i Netrin-1-inducerad funktionell återhämtning efter ICH.

Ytterligare studier behövs för att undersöka de underliggande mekanismerna för dessa processer och deras relaterade signalvägar. I framtida experiment kommer vi att bedöma de biologiska egenskaperna hos peptid E1 för att utforska dess toxicitet och halveringstid för klinisk tillämpning.

4. Material och metoder

4.1. Djur

Laboratoriet var ett specifikt patogenfritt (SPF) laboratorium. Alla möss hölls under en 12-h ljus-mörkercykel med lampor på från 06:00 till 18:00 och gav tillgång till mat ad libitum. DCC + / - möss genererades som tidigare beskrivits [53].

Embryon av DCC+/− möss användes för kortikal neuronal kultur. Genotypning utfördes genom polymeraskedjereaktion (PCR) som beskrivits tidigare [53]. C57BL/6J möss köptes från Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (Beijing, Kina).

4.2. Konstruerar

Uttryckskonstruktioner som kodar för humant DCC (HGNC: 2701), humant Netrin-1 (HGNC:8029) och humant UNC5A (HGNC:12567) genererades i vårt laboratorium [14,32,45].

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His genererades med ett Seamless AssemblyCloning Kit (Clone Smarter, C5891, USA). cDNA-sekvensen för hNetrin-1 (∆407–443) sågs i tilläggstabell S2.

cDNA-sekvenser som motsvarar FN5-domänen av DCC och aminosyrorna 407–443 av Netrin-1 konstruerades genom ligering in i pGEX-5x-1-vektorn för att producera GST-fusionsproteiner.

4.3. Samling av Netrin-1 konditionerat medium

Det netrin-1-konditionerade mediet samlades in och validerades enligt beskrivningen i vår tidigare rapport [13,14]. Kortfattat uttrycktes Myc-His-märkt humant Netrin-1 i HEK293T-celler.

Efter 24 timmar tvättades cellerna 3 gånger med Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, USA) och inkuberades sedan i tre dagar i serumfritt Opti-MEM.

Mediet berikades genom centrifugalfiltrering (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, USA) och lagrades vid -80 ◦C. Anrikat Netrin-1 immunoblottedes med anti-His och kvantifierades genom jämförelse med BSA som laddningskontroll.

Effekten av Netrin{{0}} bedömdes sedan genom fosforylering av FAK. Normalt inducerade 0,1 mg/ml Netrin-1 effektivt FAK-fosforylering, och denna koncentration användes i våra studier. Varaktigheten av Netrin-1stimuleringen var 20 minuter i alla experiment om inte annat anges.

4.4. Western blot-analys

Western blotting utfördes som tidigare beskrivits [54]. Proverna lyserades i lysbuffert (1 % Nonidet P-40, 0,5 % natriumdeoxicholat, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 % Triton X-100, 100 mM NaF, 1 mM vanadat och proteashämmare) för att lysera celler och ny hjärnvävnad.

De primära antikropparna som användes var: mus anti-DCC (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, USA), mus anti-His (1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Peking, Kina ), mus anti-myc (1:1000, 22E8, Sungene Biotech, Tianjin, Kina), mus anti-Netrin-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, USA), mus anti-flagga (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), kanin anti-fosfo-FAK(pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), kanin anti-FAK (1:200, sc-557, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), kanin anti-phosphoSRC (Tyr418)(1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , kanin-anti-SRC-familj (1:1000,#2123, CST, Danvers, MA, USA), mus-anti-GAPDH (1:5000, TransGene Biotech, Peking, Kina), mus-anti-beta-aktin (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), kanin anti-fosfo-ERK(Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, USA), rabbitanti-ERK (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, USA), HRP-konjugerad sekundär antikropp mot mus, get eller kanin köptes från Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA).

4.5. Cell Ytbindning

HEK293-celler pläterade på täckglas transfekterades med Flag-DCC-plasmider med användning av kalciumfosfatmetoden som beskrivits tidigare [55]. Ungefär 40 timmar efter transfektion inkuberades cellerna med 100 µg/mL myc-Netrin-1 eller myc-Netrin-1 (∆407–443) i 30 min innan den tvättades i 5 min med HBHA (20 mM HEPES, pH 7,0 och 0,5 mg/mLBSA i HBSS), sköljdes med 1 x PBS och fixerades sekventiellt med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min. De primära antikropparna som användes var anti-myc-antikroppar från kanin (1:200, Abcam, ab9106, Cambridge, MA, USA) och mus-anti-flagga (1:100, Sigma Aldrich, F3165).

De sekundära antikropparna som användes var Alexa Fluor 488-konjugerade åsnaanti-kanin (1:1000; Invitrogen, A21206) och Alexa Fluor 546-konjugerade get-anti-mus(1:1000; Invitrogen, A10036) antikroppar . Kärnorna färgades med 40,6-diamino-2-fenylindol (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Alla bilder togs med ett Zeiss LSM 880 konfokalmikroskop.

4.6. GST rullgardinsmeny

GST-DCC-fusionsproteinet renades med glutation-SepharoseTM 4B-kulor (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Storbritannien) enligt tillverkarens protokoll.

Ungefär 500 µg cellysat från HEK293T-celler transfekterade med de angivna plasmiderna inkuberades med 2–5 µg GST-DCC-FN5-fusionsprotein i RIPA-buffert vid 4 ◦C över natten. Glutathi-one-SepharoseTM 4B-pärlor användes för att fånga GST-DCC-FN5-fusionsproteinet och dess interagerande proteiner. De bundna proteinerna frisattes i proteinladdningsbufferten genom värmedenaturering.

4.7. Primär kortikal neuronkultur

Primära kortikala neuroner odlades som tidigare beskrivits [56]. Kortfattat togs embryon (E17) bort från sövda gravida möss. Hjärnbarken separerades och skars i små bitar.

Efter inkubation i {{0}}.125 % Trypsin Plus med 0,05 % DNas i HBSS vid 37 ◦C under 20 minuter triturerades cellerna med eldpolerade glaspasteurpipetter och filtrerades med ett 40 µm filter.

Dissocierade celler suspenderades i DMEM med 10 % FBS och ströks ut på poly-D-lysinbelagda skålar eller täckglas vid 37 ◦C i en 5 % CO2-atmosfär. Efter 4 timmar ersattes mediet med ett neurobasalt medium kompletterat med B27 och GlutaMAX.

4.8. NLT-cellkultur och behandlingsprotokoll

Mus GnRH-uttryckande neuronala celler (NLT) upprätthölls av vårt laboratorium. NLT-celler odlades i DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) innehållande 10 % FBS (BiologicalIndustries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) och 1 % penicillin/streptomycin (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) vid 37 ◦C under en fuktad atmosfär av 95 % luft och 5 % CO2.

För att bestämma neurotoxiciteten hos hemin sattes olika koncentrationer (0, 10, 30, 60, 90 och 120 µM) hemin (Sigma-Aldrich) till NLT-celler och behandlades i 6 timmar. Av dessa koncentrationer valdes 60 µM (LD50) ut och användes i de efterföljande experimenten.

Kontrollgrupper behandlades endast med vehikel (DMSO). Cellviabilitet och Live/Deadstaining utfördes 6 timmar efter behandling. Tre brunnar användes för varje grupp. Experimenten upprepades minst 3 gånger.

4.9. In vitro-modell av hemin-inducerad celldöd

Celldöd inducerades i primära kortikala neuroner och NLT-celler genom behandling med 5 0 µM respektive 60 µM hemin, som tidigare beskrivits [57,58]. Hemin löstes i 0,1 M NaOH för att generera en stamlösning. För neuroprotektionsstudierna behandlades celler med hemin 6 timmar i närvaro av angivna medel eller natriumselenit löst indubbeldestillerat vatten.

4.10. CCK-8-analys

Cellviabiliteten mättes med CCK-8-analysen (CK04, Dojindo, Kumamoto, Japan) som tidigare beskrivits [59]. I korthet såddes Neuronal i 96-brunnsplattor med en densitet av 6000 celler/brunn i 100 µL odlingsmedium och matades i inkubatorn över natten.

Celler behandlades med hemin i 6 timmar. De neuronala cellerna tvättades i förvärmd PBS (37 ◦C) och CCK-8-reagens (10 µL per 100 µL medium) i varje brunn.

Efter det inkuberade vi plattorna i 2 timmar i en 5% CO2-atmosfär, och absorbansen vid 450 nm mättes med hjälp av amikroplatläsare. Cellviabilitet representerades som en procentandel av kontrollen (obehandlade celler).

4.11. Levande/död färgning

CCK-8-analysens förmåga att mäta livsduglighet verifierades genom färgning med calceinAM/PI i PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, Kina) enligt tillverkarens instruktioner.

Färgningslösningen bestod av 2 µM kalcein AM-reagens och 8 µM PI-reagens blandat i PBS. Prover inkuberades i 30 minuter och avbildades med en 20xobjektiv lins av ett fluorescensmikroskop (Olympus FSX100, Tokyo, Japan). Ett minimum av 3 oberoende cellkulturer användes för in vitro-modellen av hemin-inducerad celldöd.

4.12. Peptidsyntes och administration

Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2),TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC-märkt TE1 (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2),{{FITC-märkt ( PFT3) 25 HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2) och flagga märkt Pep E2 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2)-peptider med 99 % renhet köptes av företaget Shanghai GL Biochem (Shanghai, Kina) och företaget Wuhan Bioyeargene Biosciences (Wuhan, Kina).

For more information:1950477648nn@gmail.com