En ny skärm för uttrycksregulatorer av det telomera proteinet TRF2 identifierade små molekyler som försämrar TRF2-beroende immunsuppression och tumörtillväxt
Oct 10, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Enkel sammanfattning:Det telomera proteinet TRF2 (Telomerisk upprepad bindande faktor 2) är uppreglerat i humana cancerformer och associerat med dålig prognos. TRF2 onkogena egenskaper förlitar sig på dess inneboende telomerskyddande roll, men också på cellextrinsiska effekter genom immunsuppressiva och angiogena aktiviteter. Därför verkar inriktning på TRF2 som en lovande terapeutisk anti-cancerstrategi. I denna studie utvecklade vi en cellbaserad metod för att screena för TRF2-hämmare, vilket gör att vi kan identifiera två föreningar som trubbar TRF2-pro-onkogena egenskaper in vivo.
Sammanfattning: Telomerisk upprepad bindande faktor 2 (TRIF2) är en subenhet av shelterinproteinkomplexet, som binder till och skyddar telomerer från oönskad DNA-skaderespons (DDR)aktivering. TRF2-uttryck spelar en avgörande roll i åldrande och cancer, nedregleras under cellulär senescens och överuttrycks under onkogenes. Cancer som överuttrycker TRF2 uppvisar ofta en dålig prognos. I cancerceller spelar TRF2 flera funktioner, inklusive telomerskydd och icke-cellautonoma roller, vilket främjar neo-angiogenes och immunsuppression.puritaner c-vitaminVi presenterar här en original screeningstrategi, som möjliggör identifiering av små molekyler som minskar eller ökar TRF2-uttryck. Genom att screena ett litet bibliotek med läkemedel som godkänts av Food and Drug Agency (FDA) identifierade vi två molekyler (AR-A014418 och alexidin-2HCl) som försämrade tumörtillväxt, neo-angiogenes och immunsuppression genom att nedreglera TRF2-uttrycket i en mus xenograft modell. Dessa resultat stöder den kemoterapeutiska strategin att nedreglera TRF2-uttryck för att behandla aggressiva mänskliga tumörer och validera denna cellbaserade analys som kan screena för potentiella anti-cancer- och anti-aging-molekyler genom att modulera TRF2-uttrycksnivåer.
Nyckelord:TRF2; cancer; åldrande; cellbaserad screeninganalys; neo-angiogenes; immunsuppression
1. Introduktion
Telomerer är specialiserade nukleoproteinstrukturer som finns i ändarna av linjära kromosomer som regleras av telomerassocierade faktorer som telomeras, shelterinproteinkomplex och icke-kodande telomeriskt repeterande RNA [1]. När de är korrekt reglerade skyddar telomerer kromosomerna mot instabilitet och åldrande. Telomerisk DNA-förkortning sker som en del av programmerad fysiologisk utveckling och åldrande [2]. Men överdriven förkortning av telomer-DNA driver sällsynta progeroidsyndrom, såsom dyseratosis congenita [3]. Dessutom är oreglerade telomertillstånd inblandade i många sjukdomar som är vanliga i den allmänna befolkningen, inklusive nästan alla typer av cancer och flera degenerativa sjukdomar [4]. Att utveckla farmakologiska behandlingar för att rikta in sig på specifika telomerkomponenter är således lovande för att förebygga och behandla sådana sjukdomar.
När det gäller telomer och cancer, misslyckas ibland kontrollpunkter för vital DNA damage response (DDR); detta kan leda till överdriven telomerisk DNA-förkortning och avvikande kromosomförändringar, vilket i sin tur kan bidra till onkogenes. Dessutom är uppregleringen av telomeras en nyckelhändelse i utvecklingen av cirka 90 procent av alla cancerformer, eftersom detta kan ge obegränsad tillväxt till cancerceller [5]. Av denna anledning har telomerasinhibering varit målet för flera studier för att utveckla cancerbehandlingar [6]. Trots de senaste framstegen finns det vissa begränsningar för den kliniska användningen av antitelomerasläkemedel. Till exempel, för att stoppa cancercellsproliferation, måste en kritiskt kort telomer DNA-längd nås, och de anti-onkogena effekterna av förkortade telomerer går förlorade i frånvaro av p53-tumörsuppressorgenen [7,8]. Denna fördröjningsperiod minskar terapeutisk effekt och ökar pro-aging biverkningar genom att begränsa cellförnyelsen och gynna aktiveringen av alternativa rekombinationsbaserade telomerförlängningsmekanismer [9,10].sistancheDärför kan anti-telomerasstrategier vara bättre lämpade för att rikta in sig på cancerceller som redan har kritiskt korta telomerer [11].
Förutom telomeras är förändringar i uttrycket och aktiviteterna hos shelterinkomplexsubenheter (TRF1,TRF2,RAP1,TIN2,TPP1 och POT1) involverade i tumörbildning, och i vissa fall oberoende av telomerlängden [12-16]. Därför kan inriktning på shelterin för cancerbehandling vara ett intressant alternativ till anti-telomerasinterventioner. Shel-terin-subenheten TRF2 representerar en intressant kandidat; TRF2 överuttrycks i flera mänskliga maligniteter, både i cancer och kärlceller och detta är vanligtvis associerat med en dålig prognos [17-20]. Särskilt kan överuttryck av TRF2 främja tumörbildning icke-cell autonomt, vilket leder till immunsuppression och neo-angiogenes[13,18-20]Särskilt skapar TRF2-uppreglering en potent immunsuppressiv mikromiljö. Genom att ändra uttrycket av heparansulfatproteoglykaner, rekryterar TRF2 direkt och aktiverar myeloid-härledda suppressiva celler (MDSC) genom TLR2-vägen [21]. Medan TRF2-överuttryck i cancerceller kraftigt hämmar rekrytering av NK-celler i tumörmikromiljön genom reglering av HSPG-syntes[13], leder TLR2-aktiveringen av MDSC inducerad av överuttrycket av TRF2 till en kraftfull hämning av NK-cellimmunövervakningen med en kraftig minskning av NK-cellers degranulering, IFNgamma-produktion och dödande [21].vad är cistancheSåledes avtrubbar TRF2-överuttryck starkt tidigt stadium av antitumörimmunövervakning genom att direkt hämma rekrytering av NK-celler och indirekt funktionaliteten hos NK-celler genom utformningen av en MDSC-beroende immunsuppressiv mikromiljö. Följaktligen kan inriktning på TRF2 i cancer vara en värdefull strategi för flera träffar via cellautonoma och icke-cellautonoma processer genom att främja senesce samt försämra neo-angiogenes och immunflykt.
cistanche kan anti-aging
Hittills har alla identifierade små föreningar som riktar sig mot TRF2 försämrat dess förmåga att skydda kromosomändar från DDR och därmed med potentiella pro-aging biverkningar [22]. Vårt tidigare arbete visade att en partiell minskning av TRF2-uttryck kan vända tumorigenicitet i musmodeller genom icke-cellautonoma effekter, utan att inducera DDR [13]. Vi resonerade därför att fokus på att minska överskott av TRF2 i cancer till följd av dess överuttryck kan vara en intressant strategi för att behandla cancer utan pro-aging biverkningar. I denna studie presenterar vi en original screeningplattform för att identifiera små föreningar som är inriktade på TRF2-stabilitet. Vi visar att två toppträffar hämmade den tumörframkallande aktiviteten av TRF2-överuttryck. Denna studie visade att TRF2-uttryck kan moduleras farmakologiskt och att vår screeninganalys är en pålitlig metod för val av läkemedel som kan modulera TRF2-uttrycksnivåer, med potentiella anti-cancer- och anti-aging egenskaper.
2. Material och metoder 2.1.Celler
Mänsklig embryonal njure (HEK)293-T-celler(ATCC CRL-1573) och BJ-HELTRAs-celler[13] odlades i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, Frankrike) kompletterat med 10 procent fetalt kalvserum (FCS), 100 IE/mL penicillin och 100 ug/mL streptomycin (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike).
2.2.SDS-PAGE och Western Blotting
Totala cellysat framställdes, separerades genom elektrofores och blottades som tidigare beskrivits [14]. I korthet skördades celler och lyserades i lysbuffert (8,76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7,2,0,1 procent SDS,0,1 procent Triton X -100,10 g/L natriumdeoxicholat, 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA),1{{50}} ug/mL leupeptin, 1 mM AEBSF och 19 ug/mL aprotinin). Prover titrerades sedan med användning av BCA-proteinanalyskit (Interchim, Monlucon, Frankrike). Prover (60 ug/bana) värmdes vid 95 grader under 5 minuter i laddningsbuffert (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, 2 procent SDS, 0,1 procent bromfenolblått, 10 procent glycerol pH 6,8). Därefter laddades prover på 10 procent polyakrylamidgeler och kördes i 45 minuter vid 160 V. Proteiner överfördes sedan till Immobilon-FL-membran (Millipore, Upstate New York, USA) med hjälp av Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio- Rad, Hercules, CA, USA). Membran blockerades i 1 timme i Intercept Blocking-buffert (LI COR, Lincoln, NE, USA) före inkubation över natten vid 4 grader med en blandning av primära antikroppar (mouselgGl anti-TRF2 utspädd vid 1: 250;och kanin-IgGanti-Beta-aktin utspädd vid 1:10,000) i Intercept Blocking-buffert innehållande 0,5 procent Tween20. Efter att ha tvättats i PBS 0,1 procent Tween20, inkuberades membran i 1 timme vid rumstemperatur i Intercept-blockerande buffert innehållande 0,25 procent Tween20 med en blandning av sekundära antikroppar: get-anti-mus IRDye 680 för anti-TRF2 antikropp och get anti-kanin IRDye 800CW för anti-Beta-aktin-antikropp (1:15,000 spädning).Anti-aging cistanchePrimära och IRDye sekundära antikroppar som användes listas nedan i antikroppstabellen (tabell 1). Slutligen visualiserades proteinband med hjälp av LiCor Odyssey 9120 avbildningssystem (LI-COR). TRF2-uttryck mättes genom att normalisera TRF2-bandintensiteten till intensiteten av aktinbandet och bakgrunden.
2.3.Klonningsstrategi
Den humana TRF2-cDNA-sekvensen klonades mellan BamHI/BclI-restriktionsställena i en lentiviral SFFV-GPR-plasmid som är ett HIV-SFFV-GFP-WPRE-derivat [23]. SFFV-GPR-plasmiden innehåller en mjältefokusbildande virus (SFV)-promotor som kontrollerar en GPR-polycistronisk gen innefattande cDNA-sekvenser för grönt fluorescerande protein (GFP), ett puromycinresistensprotein och Tag-rött fluorescerande protein (RFP)-T (S158T muterad tagg -RFP), var och en separerad av E2- och T2 Picornaviridae-sekvenser. hTRF2-cDNA sattes in i den C-terminala regionen av RFP-T för att möjliggöra uttrycket av ett RFP-TRF2-fusionsprotein.
2.4.Lentivirusproduktion
För lentivirusproduktion transfekterades 5 × 10* HEK 293-T-celler med 8,6 ug tom SFFV-GPR eller RFP-TRF2-uttryckande SFFV-GPR-vektor, 8,6 ug Lenti -Delta 8,91 och 2,8 ug VSV-g via kalciumfosfatmedierad transfektion. Transfekterade celler odlades i DMEM kompletterat med 10 procent FCS vid 37 grader med 5 procent CO2 i 10- cm skålar. Supernatanter som innehöll de nykonstruerade virusen samlades in efter 48 timmar och passerades sedan genom ett 0,45-μm Millipore-filter. Efter virustitrering användes ett 1∶1 (virus∶cell) förhållande för att infektera BJ-HELTRAs-cellinjen, vald för dess resistens mot TRF2-defekter[13].cistanche benefíciosEn klon som uttryckte GFP och det fusionerade RFP-TRF2-proteinet till måttliga nivåer isolerades sedan genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
2.5. Flödescytometriscreening
BJ-HELTRas klonlinjeceller innehållande SFFV-GPR-vektorn och uttryckande RFP-TRF2-fusionsproteinet odlades i 96-brunnsplattor i DMEM-medium kompletterat med 10 procent FCS och 1 procent penicillin/streptomycin. Efter 24 timmars läkemedelsbehandling trypsiniserades cellerna sedan och tvättades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 0,5 mM EDTA och 2 procent FCS innan de fixerades med 0,5 procent formaldehyd (FA). Fixerade celler utsattes sedan för till flödescytometri med en FacsCalibur-provtagare med hög genomströmning (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).
2.6. Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR)
Totalt RNA isolerades med användning av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Nederländerna). Omvänd transkription utfördes med användning av Superscript II omvänt transkriptas (Invitrogen) med 1 ug totalt RNA. Uttrycket av varje gen normaliserades till det för GAPDH. Följande primrar användes: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDHATCCCA{{11}'hGAPDHATCCCA{AAGCCCA{AAGCCCCA 5' 14}}. 2.7.AlamarBlå
I en 96-brunn med platt botten såddes 5 × 103 celler per brunn i 200 uL DMEMsup kompletterat med 10 procent FCS. Vid 24 timmar efter läkemedelsbehandling tillsattes 10 uL AlamarBlue (Bio-Rad) och absorbansen mättes vid 570 nm och 600 nm under 36 timmar i en Spectrostar Nano-plattläsare (BMGLabtech, Ortenberg, Tyskland). Oxidationsreduktionsprocenten för AlamarBlue bestämdes enligt beskrivningen av tillverkaren.
2.8.Djur
Experiment utfördes på 8- med 12-veckogamla NMRI nakna honmöss från Janvier Labs (Frankrike). Alla musexperiment utfördes enligt lokala och internationella institutionella riktlinjer och godkändes av antingen Animal Care Committee i IRCAN och den regionala (CIEPAL Cote d'Azur #187 och #188) och nationella (franska forskningsministeriet #03482.01/02482.2 och #02973.01/02973.2) myndigheter.
2.9. Tumörtillväxtexperiment
Varje NMRI naken mus injicerades subkutant i ryggen med 1 x 106 BJ-HELTRAs-celler suspenderade i 100 μL PBS (n=8 möss per grupp). Mössen behandlades på dagarna 16, 18, 20 och 22 med intraperitoneala injektioner av 100 uL DMSO (45 procent), alexidin-2HCl (1 mg/kg) eller AR-A014418 (5 mg/kg), följdes sedan upp till dag 26. Tumörens utseende bedömdes genom palpation varje dag. Tumörstorleken mättes var 2-3 dag med hjälp av ett mätmått. Tumörvolymen bestämdes sedan med användning av hemi-ellipsoidformeln:π×(L×1×h)/6, där L motsvarar längden,I till bredden respektive h till tumörens höjd.
2.10. Matrigel-plugganalyser
BJ-HELTRAs-celler behandlades med DMSO (1 procent), alexidin-2HCl (1 uM) eller AR-A014418 (10 μM) i 2 dagar. Sedan inokulerades 100 μL 1 × 10 graders behandlade celler suspenderade i PBS tillsammans med 400 ul av tillväxtfaktorreducerad Matrigel (Corning, New York, USA) subkutant på baksidan av NMRI nakna möss under isofluranbedövning. På dag 5 efter inokulering skördades Matrigel-pluggarna och infiltrerande celler samlades upp genom enzymatisk dissociation via dispase (Corning), kollagenas A (Roche, Bale, Schweiz) och DNAseI (Roche) digestion under 30 minuter vid 37 grader [13] ]. Celler mättades i 15 minuter på is med Fe-Block anti-CD16/CD32-antikroppar (klon 2.4G2) före färgning med kopplade antikroppar i 30 minuter vid 4 grader. De använda konjugerade antikropparna är listade i antikroppstabellen. Celler tvättades i PBS med 0,5 mM EDTA, 2 procent FCS och fixerades med 0,5 procent FA. Färgade celler analyserades med en ARIA III-cytometer med DIVA6-mjukvara (BD Biosciences) och FlowJo 10(LLC).
2.11.Statistik
Alla grafer och statistiska analyser producerades med hjälp av GraphPad Prism-programvaran (San Diego, CA, USA). Alla resultat representeras som medelvärdet ± standardavvikelsen (sd) eller medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM). Signifikanta skillnader mellan medelvärdena bestämdes med användning av Mann-Whitneys tvåsidiga test. Log-rank-testet (Mantel-Cox) användes för att bestämma tumörupptagningen. För varje test, sid<0.05 was="" considered="" statistically="">
3. Resultat
3.1.Identifiering av TRF2-hämmande molekyler
För att screena för läkemedel som kan modulera TRF2-proteinnivåer använde vi ett lentiviralt system för att samtranskribera GFP-genen och RFP fusionerad till N-terminalen av TRF2. Efter en allmän strategi som beskrivs på annat håll [23] konstruerade vi ett GRT-lentivirus, där SFFV-promotorn kontrollerade uttrycket av en polycistronisk gen som kodar för GFP, ett puromycinresistensprotein och antingen RFP-TRF2 eller RFP endast som en kontroll (Figur 1A). Följaktligen uttryckte alla transducerade celler både GFP och RFP-TRF2. Detta system utformades för att identifiera läkemedel som modulerar TRF2-uttryck genom att mäta RFP-intensitet med flödescytometri, medan GFP-intensitet fungerar som en intern kontroll för transkriptionen av reporterkonstruktionen.
Vi transducerade GRT lentivirus till humana BJ-HELTRAs fibroblaster som odödliggjordes av SV40 och hTERT och gjordes onkogena av Ras v12 [13]. För att underlätta mätningar av både upp- och nedreglering av TRF2 isolerades en puromycinresistent klon som måttligt uttryckte både GFP- och RFP-TRF2-proteiner med hjälp av FACS-sortering och benämndes GRI-BJ-HELTRAs (Figur 1A). Som en positiv kontroll behandlade vi GRT-BJ-HELTRAs-celler med 10 uM gemcitabin, en tidigare beskriven modulator av TRF2-stabilitet [24], under 24 timmar. Även om ingen RFP-modulering detekterades i celler transducerade med tom vektor, observerades en signifikant minskning av RFP/GFP-medelfluorescensintensitetsförhållandet (MFI) i gemcitabinbehandlade GRT-BJ-HELTRAs-celler jämfört med den DMSO-behandlade kontrollen (82 procent) av kontrollen;s<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">
Med hjälp av flödescytometri screenade vi sedan 396 Food and Drug Administration (FDA) godkända farmakologiska föreningar som kan rikta in sig på sex huvudkategorier av biologiska processer: jonkanaler, fosfataser, kinaser, epigenetiska faktorer, nukleära receptorligander och Wnt-vägen (Figur S1C) ).GRT-BJ-HELTRAs-celler behandlades först med 10 uM av var och en av de 396 föreningarna eller DMSO under 24 timmar före flödescytometrianalys (Figur S1D). I det här fallet befanns 84 föreningar modulera TRF2-proteinnivåer (Figur S1D, höger panel; Tabell S1), och användes för en sekundär skärm (Figur S1E; Tabell S1). I denna sekundära screening, förutom att behandla GRT-BJ-HELTRAs-celler med 10 uM av de utvalda föreningarna, behandlades icke-transducerade BJ-HELTRas-celler eller BJ-HELTRas-celler transducerade med en tom vektor på liknande sätt för att kasta falska positiva utsändande rött eller grön autofluorescens eller påverkar RFP- eller GFP-proteiner. De 18 bästa föreningarna valdes sedan ut för att bestämma deras förmåga att modulera uttrycket av endogen TRF2 i icke-transducerade BJ-HELTRas-celler, baserat på Western blotting (Figur S2A, B Tabell S1). Vi definierade träffar som föreningar som modulerar med minst 20 procent av TRF2-dosen (antingen upp eller ner). Med hjälp av dessa kriterier, från de 18 läkemedel som utvärderades med Western blotting, minskade 9 av dem och en ökade endogena TRF2-proteinnivåer (Figur S2A, Tabell S1) Vi beslutade sedan att välja två föreningar bland dessa läkemedel för in vivo-experiment för att avgöra om de kunde motverka de pro-onkogena effekterna av TRF2-överuttryck. För att undvika DDR-aktivering och biverkningar i icke-tumörframkallande celler valde vi föreningar som varken reducerade till den högsta eller lägsta nivån av TRF2-dosen. Bland dem motsvarade AR och AD dessa kriterier. Båda föreningarna nedreglerade RFP-TRF2 i GRT-BJ-HELTRAs-celler som analyserades med flödescytometri (Figur 1C), endogena TRF2-proteinnivåer som visas av Western blotting-analys (Figur 1D; Figur S2A,B) och TERF2-mRNA-nivåer som bestämts via RT -qPCR (Figur 1E). Dessutom reducerade behandling med de respektive LD50-koncentrationerna av AR och AD TERF2-mRNA-uttryck i både BJ-HELTRAs-celler och i TRF2-överuttryckande BJ-HELTRAs-celler (Figur S3A-C).
3.2.AR-A014418 och Alexidin-2HCl vände den tumörframkallande förmågan till följd av höga TRF2-uttrycksnivåer
Vi utvärderade sedan effekten av AR och AD på tumörtillväxt. För att kontrollera deras förmåga att inrikta sig på TRF2-överuttryckande cancer, analyserade vi de potentiella antitumörogena effekterna av AR och AD på både standard BJ-HELTRas-celler och TRF2-överuttryckande BJ-HELTRas-celler. BJ-HELTRAs-celler transducerades med TRF2lentiviral vektor eller tom vektor, injicerades sedan subkutant i nakna möss. Mössen behandlades sedan med DMSO, 1 mg/kg AD eller 5 mg/kg AR dag 16, 18, 20 och 22 efter injektion [26, 27] (Figur 2A). Som tidigare rapporterats [13,21], främjade TRF2-överuttryck tumörini. bildning och tillväxt in vivo (Figur 2B-D; sid<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>
3.3.AR-A014418 och Alexidin-2HCI-motverkade TRF2-beroende immunsuppression och neo-angiogenes
För att avgöra om antitumöreffekterna av AR och AD kunde rikta in sig på de icke-cellsautonoma onkogena egenskaperna hos TRF2, undersökte vi immuncellsinfiltration och -aktivering samt angiogenes i behandlade tumörer. Vi behandlade standard- och TRF2--överuttryckande BJ-HELTRAs-celler (Figur S3A) med 1 uM AD, 10 uM AR eller DMSO i 48 timmar innan deras subkutana injektion med Matrigel i nakna möss. Matrigelpluggar samlades sedan in 5 dagar efter injektion för att analysera tumörmikromiljön genom flödescytometri (Figur 3A). Som väntat [13,21] förändrade överuttryck av TRF2 inte global immuncells (CD45 plus cell) infiltration (Figur 3B; Figur S4A), men hämmade rekrytering av naturliga mördarceller (NK) (Figur 3C; Figur S4B) och NK-funktion -ality (Figur 3C-E; Figur S4C), och öka MDSC-infiltrationen (Figur 3F). I TRF2- som specifikt överuttrycker BJ-HELTRas-celler, ökade behandling med båda läkemedlen global immuninfiltration (Figur 3B; Figur S4A), såväl som kvantiteten och funktionaliteten hos intratumorala NK-celler (Figur 3C-E; Figur S4B, C). Noterbart räddade båda läkemedlen helt hämningen av NK-cellmedierad immunövervakning (CD107a plus och CD69 plus NK-cell) inducerad av TRF2-överuttryck (Figur 3C). Detta var förknippat med en dramatisk minskning av MDSC-rekrytering (Figur 3F; Figur S4D) och med ökad rekrytering av monocyter och makrofager (Figur 3G).
Som tidigare rapporterats [14,20] var tumörangiogenes högre i TRF2-överuttryckande tumörer jämfört med kontrolltumörer. Medan TRF2-överuttryck ökade mängden CD31 plus CD45-endotelceller i tumörbädden (Figur 3H; Figur S4E), upptäcktes ingen skillnad mellan tom vektor eller TRF2-överuttryckande tumörer efter behandling med något av läkemedlen. ing TRF2 (TRF2 vektor) eller tom vektor behandlades med 1 uM alexidin-2 HCl eller 10 μM AR-A014418 eller DMSO 2 dagar före subkutan injektion med Matrigel (1 × 10 graders celler) i NMRI nakenmöss( n=8). Immun- och endotelcellsinfiltration utvärderades sedan 5 dagar efter injektion med flödescytometri. (BH). Flödescytometrianalys av immuninfiltrationen av Matrigel-pluggen. Antalet immunceller som infiltrerar Matrigel-pluggarna bland levande celler visas. Total immuncellsinfiltration (CD45 plus celler) visas i (B); naturlig mördarcell (NKp46 plus celler) infiltration visas i (C); aktiverad NK-cell (CD107a plus och CD69 plus NK-celler) inffiltration visas i (D,E); myeloid-härledd suppressorcell (MDSC;CD11b plus GR1 plus ))infiltration visas i (F); monocyt-makrofaginfiltration visas i (G) och endotelcellsinfiltration visas i (H).p Värden bestämdes med hjälp av Mann- Whitney test(*s<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">
4. Diskussion
Här rapporterar vi utvecklingen av en cellbaserad analys för att screena för föreningar som modulerar uttrycket av det telomera proteinet TRF2. Genom att screena ett litet bibliotek av FDA-godkända molekyler identifierade vi föreningar som antingen kunde öka eller minska TRF2-uttrycksnivåerna. Vi upptäckte att AD och AR nedreglerade TRF2 och uppvisade antitumörgen aktivitet specifik för tumörceller som överuttrycker TRF2. För att ytterligare demonstrera deras TRF2-specifika aktivitet, räddade AR- och AD-behandling immunsuppression och neo-angiogenes orsakad av TRF2-överuttryck. Påfallande nog, det faktum att den globala immuninfiltrationen ökar för TRF2-överuttryckande tumörer efter AR- eller AD-behandling tyder på att dessa läkemedel är mer potenta för att förbättra immunsvaret när TRF2 är överuttryckt. Dessa läkemedel hämmar den immunsuppressiva effekten av TRF2-överuttryck genom att återställa NK-cellfunktionalitet (CD107a och CD69 plus NK-celler) och kraftigt minska MDSC-infiltration. Detta tyder på att dessa läkemedel gör det TRF2-beroende specifika programmet trubbigt som utlöser immunflykt och immunsuppression och kan öka frisättningen av Danger Associated Molecules (DAMP) som förbättrar immunsvaret specifikt när TRF2 överuttrycks. Notera att vi observerar att AR och AD räddade de immunsuppressiva och pro-angiogena funktionerna hos TRF2-överuttryck, två egenskaper hos TRF2-överuttryck som vi tidigare visade som DDR-oberoende. Således antog vi att AR- och AD-effekterna på tumörtillväxt är DDR-oberoende, en mekanism som återstår att beskriva fullt ut i ytterligare studier. Den nuvarande proof-of-concept-studien ger bevis för att farmakologisk minskning av TRF2-uttryck kan vara en värdefull anti-cancerstrategi
Även om screeningsmetoden ansåg TRF2-proteinnivåer oberoende av transkriptnivåer, minskade båda läkemedlen endogena TERF2-mRNA-nivåer, vilket antyder att AR och AD riktar in sig på flera nivåer av TRF2-reglering. Som stöd för detta är AR en hämmare av Wnt-signalering [28], som är en aktivator av TERF2-transkription [29]. Mer generellt berikades läkemedlen som riktade sig mot Wnt-signalvägen under screeningsstegen (Figur S1B-D). Hur AD, ett ämne som riktar sig mot mitokondrier, påverkar TRF2-uttrycket återstår att fastställa. Eftersom cancer som uppvisar höga TRF2-nivåer har en dålig prognos och uppvisar ökad resistens mot kemoterapi [21], är AR och AD terapeutiska medel av intresse för sådana tumörer. Potentialen att koppla loss de telomera och pro-onkogena aktiviteterna hos TRF2[13] ökar möjligheten att farmakologiskt nedreglera TRF2 och därmed ge multi-hit anti-cancerfördelar utan skadliga pro-aging biverkningar. Därför är framtida studier berättigade för att fastställa de synergistiska effekterna av dessa läkemedel på TRF2-uttrycksnivåer i kliniska studier.
Även om TRF2 är uppreglerad i olika humana cancerformer [13,21], nedregleras dess uttryck under både normalt och patologiskt åldrande av många vävnader [30,31] Dessutom betonar flera rapporter som involverar musmodeller av TRF2-dysreglering vikten av TRF2 vid vägskälet mellan åldrande och cancer [31-35]. Därför är de molekyler som identifieras av screeningproceduren som beskrivs här intressanta läkemedelskandidater, både som anti-cancermedel för TRF2-nedreglering som bekräftats i denna studie, och potentiellt som anti-aging-medel genom att uppreglera TRF2.
Den här artikeln är extraherad från Cancers 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers
