Abstrakt

Denna studie etablerade en tunnskiktskromatografimetod (TLC) baserad på bilddigitalisering för snabb, enkel och billig detektering av fyra stora fenyletanoidglykosider (PhG) i Cistanche. De fyra PhG extraherades med 50 % metanol och separerades på en polyamidplatta med en mobil fas bestående av metanol-kloroform-isättika-vatten (3,5:1,5:1:7, V/V/V/V). Punktbilder togs under 365 nm UV-ljus och analyserades digitalt med hjälp av ImageJ-programvara, som genererade integrerade gråvärden för snabb kvantitativ analys. Metoden visade utmärkt linjäritet förechinakosid, tubulosid A, akteosid och isoakteosidmed korrelationskoefficienter (r) på 0,9974, 0,9931, 0,9923 respektive 0,9890. Återvinningarna varierade från 87,1 % till 96,5 %, 88,4 % till 109,7 %, 94,1 % till 105,1 % respektive 97,0 % till 115,1 %. De kvantitativa resultaten som erhölls med denna metod överensstämde med de från högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Denna studie ger en snabb och korrekt metod för kvantitativ analys av fyra viktiga PhGs i Cistanche.

Nyckelord:Cistanche tubulosa; fenyletanoidglykosider; tunnskiktskromatografi; ImageJ; snabb cistanche kvalitetsanalys

 

Cistancheextrakt med hög halt av echinakosid

 

 

 

 

1. Inledning

Cistanche är en flerårig parasitisk ört från familjen Orobanchaceae, som främst finns i regionerna Xinjiang, Inre Mongoliet och Ningxia i Kina. Som en växtresurs med både medicinskt och ätbart värde har dess torkade suckulenta stjälkar visat betydande ekonomisk potential inom flera industrier. Bland de olika Cistanche-arterna,Cistanche deserticolaochCistanche tubulosaär officiellt listade iKinesisk farmakopé, medan båda arterna, tillsammans medCistanche salsa, är erkända som den råa drogen "Nikujuyou" i den japanska farmakopén. Dessutom spelar Cistanche en avgörande roll för att förbättra den ekologiska miljön i torra regioner, eftersom dess samplantering med värdväxter ger betydande ekologiska och ekonomiska fördelar för öken- och halvökenområden.

 

Cistancheextrakt med ett specifikt innehåll av flavonoid

Inom traditionell kinesisk medicin (TCM) anses Cistanche vara en utmärkt tonic. År 2020 godkändes den som en ny livsmedelsingrediens i Kina, vilket avsevärt utökade sin marknad och produktutveckling. Cistanche används inte bara för att behandla njur-yang-brist, utarmning av blod och essens, impotens och infertilitet och förstoppning, utan visar också en lovande potential vid behandling av leverfibros. Studier av kemisk sammansättning har identifierat fenyletanoidglykosider (PhG) som en av de viktigaste aktiva komponenterna i Cistanche. Dessa föreningar – inklusive echinakosid, acteosid, tubulosid A och isoacteosid – uppvisar ett brett spektrum av farmakologiska effekter, inklusive anti-aging, antioxidant, anti-trötthet och laxerande egenskaper. Echinakosid och acteosid är de officiella markörkomponenterna för kvalitetskontroll av Cistanche i farmakopéstandarder. Tubulosid A uppvisar betydande antiinflammatoriska och antioxiderande aktiviteter, medan isoakteosid har associerats med kognitiv förbättring och cytoprotektiva effekter.

Traditionella analytiska metoder för PhGi Cistanche inkluderar högpresterande vätskekromatografi (HPLC), ultrahögpresterande vätskekromatografi (UPLC) och vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS). Dessa metoder är dock beroende av dyr instrumentering, kräver tidskrävande provberedning och kräver mycket skickliga operatörer. Även om nära-infraröd (NIR)-spektroskopi erbjuder ett snabbt och oförstörande alternativ, beror den fortfarande på stora NIR-instrument och är inte lätt att bära. Följaktligen finns det ett stort behov av en billig, lättanvänd och portabel metod som är lämplig för kvalitativ och kvantitativ analys på plats, särskilt för primära testapplikationer.

Under de senaste åren har framsteg inom datorseendeteknik möjliggjort bildigenkänning och bearbetning för att förbättra traditionella analytiska tekniker, vilket gör TLC till en effektiv kvantitativ metod. Detta tillvägagångssätt korrelerar det grå värdet av provfläckar med deras koncentration. ImageJ, en bildbehandlingsprogramvara med öppen källkod, utmärker sig för sin användarvänlighet och mångsidighet. Till exempel, Bai et al. utvecklat en TLC-ImageJ-metod för att kvantifiera aminosmörsyra (GABA) i ris, vilket validerar genomförbarheten av denna metod för bildbaserad kvantitativ analys.

I den här studien tog vi TLC-fläckbilder av fyra stora PhGs i Cistanche, etablerade ett linjärt samband mellan PhG-innehåll och integrerade gråvärden och uppnådde kvantitativ analys av alla fyra föreningarna. Detta tillvägagångssätt erbjuder en ny lösning för snabb detektering till låg kostnad på plats och har en bred applikationspotential.

Om Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.- världens största Cistanche-bearbetningsföretag, med en Cistanche-odlingsbas på 200 000 hektar, en GMP-fabrik som kan bearbeta 20 000 ton färsk Cistanche årligen och över 14 patent relaterade till Cistanche-extraktionsteknologier inklusive avancerad membranseparationsteknologi. Vi är specialiserade på Cistanche-extrakt som kommer från Hotan, Xinjiang, och våra produkter uppfyller internationella kvalitetsstandarder i USA och EU. Viktigt är att vi fokuserar påCistanche tubulosaextrakt, som naturligt innehåller ett högre innehåll av fenyletanoidglykosider, inklusive echinakosid, akteosid, tubulosid A och isoakteosid, vilket gör det till det överlägsna valet för nutraceutiska och funktionella livsmedelstillämpningar.

 

Cistancheextrakt med ett specifikt innehåll av akteosid

2. Material och metoder

2.1 Instrument och reagenser

Utrustning:1000T multifunktionell kvarn (MinYe Industry and Trade Co., Yongkang, Kina); AB135‑S analytisk balans (Mettler-Toledo, Schweiz); GAMAG LINOMAT 5 halvautomatisk spotter (CAMAG, Schweiz); UV-lampa (CAMAG, Schweiz); 1200-seriens HPLC-system (Agilent, USA); Avancerat-III-18W ultrarent vattensystem (Tang's Kangning Technology, Chengdu, Kina); polyamid TLC-plattor (10 cm × 10 cm, 10 cm × 20 cm; Sijia Biochemical Plastics, Taizhou, Kina); framkallningskammare med dubbla tråg (200 mm × 200 mm).

Reagenser:Metanol (analytisk kvalitet, Beilian Fine Chemicals, Tianjin, Kina); metanol och acetonitril (kromatografikvalitet, Sigma-Aldrich, Shanghai, Kina); isättika (analytisk kvalitet, Zhiyuan Chemical Reagents, Tianjin, Kina); myrsyra och kloroform (analytisk kvalitet, Damao Chemical Reagents, Tianjin, Kina); ultrarent vatten. Echinakosid, tubulosid A, akteosid och isoakteosid referensstandarder (renhet Större än eller lika med 98 %, Yinglai Technology, Peking, Kina).

Exempel:Färska Cistanche-prover hämtades från Xinjiang, Kina, och bearbetades av Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd. Totalt 51 partier avCistanche tubulosaoch 8 partier avCistanche deserticolauppsamlades, skivades, torkades, maldes till pulver och förseglades för lagring.

Bildförvärv:iPhone 15 Pro (12MP upplösning, F2.2 bländare, 2× optisk zoom).Programvara för bilddigitalisering:F Color Picker (Deweibo) och ImageJ (version 1.54p, National Institutes of Health, USA).

2.2 Experimentella metoder

2.2.1 Beredning av referensstandardlösningar

Echinakosid, tubulosid A, akteosid och isoakteosid referensstandarder vägdes noggrant, löstes i 50 % (V/V) metanol och späddes till volym i 10 ml kolvar för att erhålla stamlösningar i koncentrationer av 1,003, 1,007, 1,004, respektive 1,004, 5 mg/l.

Alikvoter av varje stamlösning (echinakosid 2 mL, tubulosid A 0,5 mL, akteosid 1 mL, isoakteosid 0,5 mL) överfördes till en 10 mL kolv, späddes till volym med 50% metanol och filtrerades genom en 0,22 μm blandning innehållande ett 20 standardmembran, 20 μm referenslösning, 20 membran. 52,40, 101,12 respektive 51,14 ug/ml.

2.2.2 Beredning av testprovlösningar

Cistanche-prover skivades, torkades och maldes för att passera genom en 0,425 mm sikt. C. tubulosa-pulver (0,5 g) eller C. deserticola-pulver (1,0 g) vägdes noggrant, blandades med 30 ml 50 % metanol, sonikerades i 40 minuter och vägdes på nytt för att kompensera för eventuell viktminskning. Lösningen filtrerades genom ett 0,22 μm membran för att erhålla testprovlösningen.

2.2.3 TLC utvecklar val av lösningsmedel

Baserat på lösningsmedelspolaritet, elueringsstyrka och preliminära experimentella resultat, utvärderades tre utvecklande lösningsmedelssystem:

System 1: Metanol-isättika-vatten (2:1:7, V/V)

System 2: Metanol-kloroform-isättika-vatten (2:1,5:1:7, V/V)

System 3: Metanol-kloroform-isättika-vatten (3,5:1,5:1:7, V/V)

Alikvoter (5 μL vardera) av den blandade referensstandardlösningen och testprovlösningen applicerades som band på polyamid-TLC-plattor. Efter framkallning torkades plattorna och retardationsfaktorerna (Rf-värden) beräknades.

2.2.4 Bildinsamling och bearbetning

TLC-plattor fixerades och undersöktes under 365 nm UV-ljus. En iPhone 15 Pro monterad på ett stativ användes för att ta bilder från en enhetlig vinkel och höjd. F Color Picker och ImageJ programvara användes för digital kvantitativ analys, omvandling av TLC-bilder till RGB-värden, toppområden och integrerade gråvärden. Bakgrundssubtraktion och bildinversion utfördes med hjälp av ImageJ. Bilderna konverterades sedan till 8-bitars gråskala, återinverterades och kontrastjusterades för visualisering. Målband valdes ut för integrationsanalys med användning av gråvärden för kvantifiering.

 

Specifikationslista för Cistanche-extrakt

Besök Cistanche World Shop

 

 

 

 

3. Resultat och diskussion

3.1 Val av framkallande lösningsmedel

Rf-värdena för de fyra PhG:erna jämfördes systematiskt över de tre testade utvecklingslösningsmedlen. Lösningsmedelssystem 1 och 2 visade otillräcklig polaritet, vilket resulterade i fläckar som inte vandrade över halva plattans höjd och dålig separation. Lösningsmedelssystem 3 (metanol-kloroform-isättika-vatten, 3,5:1,5:1:7, V/V/V/V) gav skarpa och tydligt separerade fläckar med Rf-värden på 0,67 (echinacosid), 0,38 (tubulosid A), 0,28 (acteoside), (acteoside), (acteosid). Därför valdes System 3 för alla efterföljande TLC-analyser.

3.2 Metodvalidering

3.2.1 Val av kalibreringskurva och bildbehandlingsmetod

Blandade referensstandardlösningar vid fem koncentrationsnivåer bereddes och 5 μL av varje analyserades med TLC. Bilder bearbetades med hjälp av ImageJ, och kalibreringskurvor konstruerades genom att plotta koncentration (x, ug/ml) mot integrerat gråvärde (y). De linjära intervallen var 21–210 ug/ml för echinakosid, 5,2–52 ug/ml för tubulosid A, 10,1–101 ug/mL för akteosid och 5,2–52 ug/ml för isoakteosid.

Tre bilddigitaliseringsmetoder jämfördes:

Integrerat gråvärde– med hjälp av ImageJ för att mäta genomsnittligt punktgråvärde × pixelarea (Ctrl + M).

Toppområde– generera konturplottar och mäta punktens topparea med hjälp av stavverktyget.

RGB-värden– med F Color Picker för att erhålla R-, G-, B-kanalintensiteter vid punktcentrum, med optimerade kombinationer (2G+B för echinacosid, R för tubulosid A, 2R+G för acteosid och isoacteosid).

Bland dessa metoder gav den integrerade gråvärdesmetoden de högsta korrelationskoefficienterna (r Större än eller lika med 0,9890), vilket indikerar överlägsen noggrannhet för TLC-bilddigitalisering.

3.2.2 Gränser för detektion och kvantifiering

LOD och LOQ beräknades som LOD=3.3σ/S och LOQ=10σ/S (där σ=standardavvikelse för skärningen och S=lutning för kalibreringskurvan). LOD-värdena var 0,041 ug/band (echinakosid), 0,005 ug/band (tubulosid A), 0,008 ug/band (akteosid) och 0,011 ug/band (isoakteosid). Motsvarande LOQ-värden var 0,138, 0,017, 0,026 respektive 0,037 ug/band.

3.2.3 Precision, stabilitet och repeterbarhet

Den relativa standardavvikelsen (RSD) för integrerade gråvärden för de fyra PhG varierade från 0,56 % till 2,4 % för precision, 0,76 % till 2,2 % för stabilitet och 0,61 % till 1,9 % för repeterbarhet, vilket allt tyder på god metodprestanda.

3.2.4 Återställning

Genomsnittlig återhämtning varierade från 87,1 % till 96,5 % (echinakosid), 88,4 % till 109,7 % (tubulosid A), 94,1 % till 105,1 % (akteosid) och 96,9 % till 115,1 % (isoakteosid), vilket visar tillfredsställande noggrannhet.

3.3 Real Sample Analysis: TLC-ImageJ vs. HPLC

TLC-ImageJ-metoden användes för att kvantifiera de fyra PhGs i 51 partier avCistanche tubulosaoch 8 partier avCistanche deserticola. Kvantitativa resultat validerades mot HPLC-analys med hjälp av parade t-tester, som inte visade några statistiskt signifikanta skillnader mellan de två metoderna för alla fyra PhGs i C. tubulosa och för echinacoside och acteosid i C. deserticola (P > 0,05).

Resultaten bekräftade att TLC-ImageJ korrekt kan kvantifiera inte bara farmakopémarkörkomponenterna (echinakosid och acteosid) utan även tubulosid A och isoacteosid, som vanligtvis inte ingår i rutinmässig kvalitetskontroll. Den goda överensstämmelsen mellan TLC-ImageJ och HPLC validerar genomförbarheten av denna snabba analytiska metod för Cistanche-kvalitetsanalys.

3.4 Fördelar med TLC-ImageJ-metoden för Cistanche-kvalitetsanalys

TLC-ImageJ-metoden erbjuder flera viktiga fördelar:

Inget ytterligare färgningssteg– fläckar är direkt synliga under 365 nm UV-ljus som blå fluorescens.

Hög genomströmning– 8–10 prover kan analyseras samtidigt på en enda TLC-platta.

Snabb analys– slutföra kvantitativ analys inom 30 minuter.

Bärbar och låg kostnad– kräver endast grundläggande TLC-utrustning och en smartphone, vilket eliminerar beroendet av fasta laboratoriefaciliteter.

Mångsidig– tillämplig på flera PhG utöver farmakopémarkörer, vilket möjliggör omfattande kvalitetsanalys.

FörCistanche tubulosaextraktleverantörer som Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., ger den här metoden ett praktiskt verktyg för snabb analys av processkvalitet och slutlig produktkvalitet, vilket säkerställer konsekvent PhG-innehåll över batcher för att möta de höga standarder som förväntas av närings-, funktionell livsmedels- och läkemedelsindustrin på de amerikanska och europeiska marknaderna.

 

 

4. Slutsats

Denna studie etablerade en digitaliseringsmetod för TLC-bild för snabb kvantitativ analys av fyra stora fenyletanoidglykosider i Cistanche: echinakosid, tubulosid A, acteosid och isoakteosid. Metoden överensstämmer med de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos målföreningarna, kräver ingen ytterligare färgning och möjliggör samtidig analys av 8–10 prover på en enda TLC-platta inom 30 minuter. De kvantitativa resultaten som erhålls med denna metod överensstämmer med de från HPLC, vilket validerar dess noggrannhet och tillförlitlighet.

Metoden är särskilt väl lämpad för primära testapplikationer och fältbaserad kvalitetsanalys, eftersom den förlitar sig på portabel, billig utrustning och minskar beroendet av laboratorieinfrastruktur. Den har redan implementerats i Cistanche-odlings-, bearbetnings- och forskningsanläggningar i Xinjiang, Kina, vilket visar dess praktiska användbarhet.

 

Wecistanche Factory för odling och bearbetning av cistanche

 

Supportive Service Of Wecistanche-För mer information om samarbete
E-post:wallence.suen@wecistanche.com

 

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., världens största Cistanche-bearbetningsföretag, är stolta över att tillämpa och marknadsföra denna avancerade men ändå lättillgängliga kvalitetsanalysmetod. Med vår 200 000 hektar stora Cistanche-bas, GMP-certifierade produktionsanläggningar och toppmoderna membranseparationsteknologier levererar vi förstklassigaCistanche tubulosaextrakt med naturligt högre nivåer av fenyletanoidglykosider upp till branschledande specifikationer. Våra produkter uppfyller amerikanska och EU:s internationella kvalitetsstandarder och är lämpliga för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive TCM-avkok, funktionell mat, hälsovårdsprodukter, kosttillskott, läkemedel och kosmetika.

När den globala efterfrågan på Cistanche-tillskott fortsätter att växa - med marknaden som beräknas nå 1,13 miljarder dollar år 2033, drivet av ett ökat konsumentintresse för naturliga produkter mot åldrande, kognitiv hälsa och vitalitet - blir vikten av pålitliga, snabba kvalitetsanalysmetoder av största vikt. TLC-ImageJ-metoden som presenteras här ger en praktisk lösning för tillverkare, leverantörer och tillsynsorgan för att säkerställa konsekvent produktkvalitet, och därigenom stödja den fortsatta expansionen av Cistanche-industrin i USA, Europa och utanför.

 

 

Referenser

[Originalreferenserna har bevarats och anpassats för den engelska översättningen.]

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.

Webbplats: www.xjcistanche.com

Specialiserad på hög-fenyletanoid-glykosidCistanche tubulosaextrakt

Certifierad med SC, HACCP, SOCA, NOP (US Organic Program) och International Organic Crop Improvement Association (OCIA) certifieringar

Amerikanska och EU-marknadskompatibla