Artidentifiering och kemisk sammansättningsanalys av vilda cistancheväxter från Kenya

Abstrakt:Denna studie använde växtmorfologi, histologi och DNA-streckkodningstekniker för att identifiera de vilda Cistanche-arterna i Kenya. Innehållet av de huvudsakliga aktiva komponenterna, inklusive fenyletanoidglykosider, sockeralkoholer och betain, i den vilda Cistanche från Kenya bestämdes med HPLC-metoden. Under tiden genomfördes fingeravtrycksanalysen. Resultaten visade att den vilda Cistanche-växten som samlats in från Kenya identifierades som Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Innehållet av aktiva ingredienser som t.exechinakosid,cistanosid A, akteosid, isoakteosid, och 2'-acetylakteosid i C. senegalensis från Kenya var lägre än de i den inhemska C. tubulosa, men högre än de i den inhemska C. deserticola. Innehållet av betain liknade det i den inhemska C. deserticola, men det innehåller inte glukos. Fingeravtryckets egenskaper liknar mer de hos inhemska C. tubulosa. Denna studie ger en grund för resursskydd, djupgående forskning och utveckling av Cistanche-resursen i Kenya.

Nyckelord: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenya; artidentifiering; DNA-streckkodning; innehållsbestämning

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

Cistanche, en uppskattad ört inom traditionell kinesisk medicin, syftar på torkade, fjällande, saftiga stjälkar av ökenväxter som t.ex.Cistanche deserticolaYC MaochCistanche tubulosa(Schenk) Wight, båda medlemmar av familjen Orobanchaceae. Känd för sin förmåga att tonifiera njurens yang, ge näring till essens och blod och fukta tarmarna för att lindra förstoppning, Cistanche har hyllats i kinesiska örttexter i århundraden. Dess tidigaste medicinska rekord visas i den antika klassikernShennongs klassiker av Materia Medica, där Cistanche klassificeras som en ört av "överlägsen kvalitet". Under historiens lopp har många traditionella medicinska texter dokumenterat de kraftfulla fördelarna med Cistanche, vilket ger den det uppskattade smeknamnet "Öknens ginseng".

De olika farmakologiska effekterna av Cistanche tillskrivs dess utbud av bioaktiva föreningar. Bland dem är fenyletanoidglykosider de primära aktiva ingredienserna som ansvarar för Cistanches njurförstärkande och märgvårdande effekter. Dessa föreningar - såsom echinakosid och akteosid - uppvisar neuroprotektiva, antidemens-, anti-aging- och leverskyddande aktiviteter. Noterbart är echinakosid och akteosid de två riktmärkeföreningarna som används för kvalitetskontroll av Cistanche enligt beskrivningen i 2020-upplagan av den kinesiska farmakopén. Dessutom beror den laxerande effekten av Cistanche främst på dess oligosackaridalkoholkomponenter, inklusive betain, mannitol, fruktos, glukos och sackaros. Dessa fem komponenter är allmänt erkända som indikatorer på Cistanches förmåga att fukta tarmarna och främja tarmrörelsen.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

I Kina inkluderar stora arter av CistancheCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G. ochCistanche sinensisG. Beck. Dessa arter är inhemska i regioner som Inre Mongoliet, Ningxia, Gansu och Xinjiang. Bortom nordvästra Kina är Cistanche-arter också fördelade över torra och ökenregioner i Eurasien och norra och östra Afrika, inklusive länder som Iran, Afghanistan, Kenya, Pakistan och Mongoliet.

Kenya, som ligger i Östafrika och grenslar över ekvatorn, består till största delen av högland med en genomsnittlig höjd på 1 500 meter, men dess norra områden är öken eller halvöken. Urbefolkningen i Kenya har en lång historia av att använda medicinalväxter för helande. Regionen har en mängd medicinsk flora, till exempel extrakt från barken och rötter från tandborstträdet (Salvadora persicaL.) är kända för sina antiinflammatoriska och antibakteriella egenskaper och används ofta för att behandla tandvärk och infektioner. Barken på sandelträträdet (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) används för att behandla diarré, medan avkok av massajnässla (Urtica massaicaMildbr.) blad används mot magsmärtor. Denna rika tradition har främjat en levande medicinalväxtkultur, men på grund av ekonomiska utvecklingsutmaningar har användningen av dessa medicinalväxter inte dokumenterats eller systematiskt studerats.

Intressant nog betraktas Cistanche-arter ofta som ogräs i Afrika och har inte fått mycket uppmärksamhet eller forskning. Det finns faktiskt nästan inga publicerade studier om African Cistanche. Som svar på en inbjudan från avdelningen för regional utveckling för torra och halvtorra länder i den östafrikanska gemenskapen genomförde vårt forskarteam en fältstudie i Kenya för att undersöka lokala Cistanche-resurser. Vi samlade vilda Cistanche-exemplar, utförde botanisk identifiering och analyserade deras primära bioaktiva föreningar. Syftet var att förstå arternas mångfald och utvecklingspotential i Cistanche i Kenya, och att ge en vetenskaplig grund för vidare forskning och utnyttjande av dessa värdefulla ökenväxter.

Cistanche tubulosa torkad helrot Försäljning i Kina

Whatsapp oss för mer information

 

 

Material och metoder

Växtmaterial

Vilda Cistanche-exemplar från Kenya samlades in i augusti 2023 av professorerna Pengfei Tu och Yong Jiang från School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, i Kajiado, Kenya (01 grad 50'01"S; 36 grad 47'00"E). Två vilda Cistanche-växter samlades in och märktes K1 och K2, tillsammans med rötterna av deras värdväxt (se figur 1). Värdväxten identifierades av Kennedy Matheka, en forskningsassistent vid East African Herbarium, National Museums of Kenya, somSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, tillhörande familjen Amaranthaceae. Prover avCistanche deserticolaochCistanche tubulosasamlades in från Turpan City och Yutian County i Xinjiang Uygurs autonoma region respektive och autentiserades av professor Pengfei Tu som färska saftiga stjälkar avCistanche deserticolaYC Ma ochCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Alla voucherprover bevaras i vårt laboratorium.

Instrument

Waters Arc HPLC-system

Quintix125D-1CN elektronisk våg (Sartorius, Peking)

Olympus BX-50 optiskt mikroskop (Olympus, Japan)

NanoZoomer-SQ panoramabildskanner (Hamamatsu Photonics, Japan)

KQ500DE digital ultraljudsrengörare (Kunshan Ultrasonic Instruments, Kina)

MM400 DNA-extraktionskvarn (Retsch, Tyskland)

PCR termisk cykler (Analytik Jena, Tyskland)

DYY-8C elektroforesapparat och tank (Liuyi Instrument Factory, Peking)

MINI Space 1000 gelbildsystem (Tanon, Shanghai)

Konstant temperaturinkubator (Yiheng, Shanghai)

Reagens

Echinakosid (parti: DST191008-038), acteosid (DSTDL006101), isoacteosid (DST210601-060), D-mannitol (DSTDG006201) köptes från Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulosid A (MUST-15040115), 2'-acetylacteosid (MUST-15071504), betain (MUST-23082505), vattenfri D-glukos (MUST-23030214), fruktos (MUST-23031403) och sackaros (MUST-23082505) erhölls från Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. OCEANPAK), myrsyra (HPLC-kvalitet, VOKA-reagens) var alla av kromatografisk renhet. Växtgenomiskt DNA-extraktionskit (DP305, Tiangen Biotech, Kina) och ultrarent vatten användes för molekylär analys.

Förberedelse, färgning och observation av suckulenta stamsektioner

Enligt metoden i referens [10] skars färska Cistanche-suckulenta stjälkar till lämpliga storlekar och konserverades i FAA-fixativ (70 % etanol: isättika: formaldehyd=90:5:5). Efter tvättning med rinnande vatten för att avlägsna kvarvarande fixeringsmedel, mjukades vävnaderna med fluorvätesyra, färgades med Safranin, dehydrerades, bäddades in i paraffin och snittades. Efter montering gräddades objektglasen, paraffinsmältes och sektioner färgades med 95 % etanol Fast Green-lösning och förseglades sedan med neutralt harts. Vävnadsmorfologin observerades under ett mikroskop och välformade sektioner skannades med en panoramaskanner för att erhålla högupplösta bilder.

DNA-extraktion, PCR-amplifiering och sekvensering

Totalt DNA från Cistanche-prover och värdväxtrötter extraherades med användning av ett växtgenomiskt DNA-extraktionskit (Tiangen), enligt tillverkarens protokoll. DNA-koncentrationer och OD260/OD280-förhållanden mättes med en mikrovolym UV-spektrofotometer för att bedöma kvaliteten innan man fortsatte.

PCR-amplifiering riktade sig mot den interna transkriberade spacer 2 (ITS2)-regionen av ribosomalt DNA och kloroplast-psbA-trnH-genen för molekylär identifiering [11]. Primersekvenser var följande:

ITS2 forward: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 omvänd: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH forward: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH omvänd: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

PCR-reaktioner (25 μL) inkluderade 12,5 μL 2x Taq Master Mix, 1 μL vardera framåt- och bakåtprimrar (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μL DNA-mall och 8,5 μL ddH₂O. ITS2-förstärkning: 94 grader 5 min; sedan 35–40 cykler på 94 grader 30 s, 56 grader 30 s, 72 grader 45 s; slutlig förlängning vid 72 grader 10 min. psbA-trnH amplifiering: 95 grader 4 min; 35 cykler på 94 grader 30 s, 55 grader 1 min, 72 grader 1 min; slutlig förlängning vid 72 grader 10 min. PCR-produkter analyserades med gelelektrofores och målbanden utsattes för Sanger dubbelriktad sekvensering. Sekvenskromatogram analyserades med hjälp av CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., USA) för att erhålla mål-DNA-sekvenser, som identifierades med hjälp av det kinesiska Materia Medica DNA-streckkodssystemet och BLAST-analys i GenBank-databasen. Filogenetiska träd konstruerades med MEGA X-mjukvara för artidentifiering.

Kvantitativ bestämning av fem fenyletanoidglykosider

Halten av fem fenyletanoidglykosider bestämdes enligt tidigare etablerade metoder [13]. Beredning av referenslösningar: väg noggrant echinakosid, tubulosid A, akteosid, isoakteosid och 2'-acetylakteosid och lös upp i 50 % metanol för att framställa en blandad standardlösning med förutbestämd koncentration. Kromatografiska förhållanden: Phenomenex Luna C18-kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fas A: acetonitril-metanol (6:1, v:v); mobil fas B: 0,1 % myrsyrabuffert; gradienteluering: 0–5 min, 10 %–18 % A; 5–15 min, 18 %–24 % A; 15–20 min, 24 %–26 % A; 20–28 min, 26 %–30 % A; 28–35 min, 30 %–35 % A. Flödeshastighet: 1,0 mL·min⁻¹; kolonntemperatur: 30 grader; detektionsvåglängd: 330 nm. Metod: injicera 10 μL vardera av standard- och provlösningar i HPLC för analys.

Kvantitativ bestämning av betain, mannitol, fruktos, glukos och sackaros

Dessa komponenter kvantifierades enligt tidigare metoder [14]. Referenslösningar: väg noggrant betain, mannitol, fruktos, glukos och sackaros, lös upp i vatten för att framställa en blandad standardlösning. Provlösningar: Späd Cistanche-provlösning (beredd enligt ovan) med 50 % metanol till 1/5 av den ursprungliga koncentrationen, blanda väl och filtrera genom ett 0,22 μm mikroporöst membran. Kromatografiska förhållanden: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E kolumn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fas: acetonitril-vatten (77:23); flödeshastighet: 0,7 ml·min-1; kolonntemperatur: 25 grader; detektering med evaporativ ljusspridningsdetektor (ELSD): driftrörstemperatur 100 grader, bärgasflöde 3 L·min⁻¹. Kvantifiering utfördes genom att injicera 5 μL och 10 μL standardlösningar och 5 μL provlösning och beräkna innehållet med hjälp av den externa tvåpunktslogaritmiska standardekvationen.

Utvärdering av fingeravtryckslikhet

Provlösningar framställdes såsom beskrivits ovan, och HPLC-betingelser och metoder var desamma som för kvantifiering av fenyletanoidglykosid. Kromatografiska data importerades till "Traditional Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System (2012 Edition)". Kromatogrammet för prov K1 användes som referens, med fem fenyletanoidglykosidtoppar markerade för flerpunktskorrigering, generering av överlagrings- och referenskromatogram och beräkning av fingeravtryckslikhet.

 

 

Resultat och analys

1. Morfologisk identifiering av Cistanche

De vilda Cistanche-exemplaren som samlats i Kenya uppvisar distinkta morfologiska egenskaper. Blomställningen är en spik, med ett högblad som är lång-äggrundt-lansettlikt till formen, och två små brakteoler, vars båda sidor är kala. Blomkålen är rörformig, med fem trubbiga flikar i spetsen. Kronkronan är tubulär-kampanulerad, mäter 3–4 cm i längd, cirka 2,5 gånger längden av blomkålen, med fem lober i spetsen och tillbakaböjda kanter. Kronkronan är gul till färgen (Figur 1A, B), blir brun när den torkas. Filamenten är cirka 3 cm långa, med några fina hårstrån vid basen. Stilen är något längre än ståndarna, och stigmatiseringen är nästan sfärisk, slät och glabrös. Det finns fyra ståndare, med långa äggrunda ståndarknappar som är tätt täckta med långa ullhår; ståndarknapparnas bas är plötsligt spetsig. Denna funktion överensstämmer med beskrivningarna avCistanche deserticolaochCistanche salsai "Kinas flora"; däremot ståndarknappsbasen avCistanche tubulosaär trubbig och rundad, vilket tydligt skiljer den från andra arter i samma släkte [7].

Dessutom, värdväxten,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, är en mycket grenad buske. Dess unga grenar är tätt täckta med ljusgula eller vita ulliga hårstrån. Bladen är brett spatelliknande ovala med en smal bas (Figur 1D, E). Blomställningarna är tätt samlade längs skaftet, som tillsammans med blomställningsaxeln är täckt av gråvita eller blekgråa eller vita ulliga hårstrån.

Den saftiga stjälken av den vilda Cistanchen är tillplattad-cylindrisk, med en blekgul eller brunaktig yta tätt täckt med nålliknande, köttiga fjäll ordnade i rader. Texturen är fast, men ändå något flexibel (Figur 2A). Tvärsnittet av den suckulenta stjälken är blekgul eller brunaktig, med spridda blekbruna kärlknippen synliga för blotta ögat (Figur 2B). Under mikroskopet verkar kärlknippena äggformade eller fusiforma, sammansatta av xylem och floem, ofta närvarande som ensamma spridda buntar eller grupperade i par eller trios, med floem orienterade i olika riktningar (Figur 2C, D). Enligt 2025 års upplaga av den kinesiska farmakopén är tvärsnittet avCistanche deserticolaär brunaktig, med blekbruna prickliknande kärlknippen anordnade i en vågig ring, ofta bildande ett inre vikt ringformigt knippe; däremotCistanche tubulosavisar spridda prickliknande vaskulära buntar, en viktig särskiljande egenskap för att identifiera dessa två typer av Cistanche-skivor [1]. Den vilda Cistanchen från Kenya visar också spridda prickliknande kärlknippen i tvärsnittet, i överensstämmelse med egenskaperna hosCistanche tubulosa.

 

 

Figur 2 Utseende och tvärsnittsegenskaper hos vild Cistanche-växt (K2) i Kenya. A: Skaftets utseende; B: Tvärsnittet av den köttiga stammen; C: Paraffinsnitt av den köttiga stjälken (safranin-snabb grön färgning); D: Förstorad bild av kärlknippet i paraffinsektionen