Acteosid som ett potentiellt terapeutiskt alternativ för primärt hepatocellulärt karcinom: en preklinisk studie

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen och Zhiyong Wang

Abstrakt

Bakgrund: Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en vanlig malign tumör med egenskaper som dålig prognos, hög sjuklighet och dödlighet över hela världen. I synnerhet finns endast ett fåtal systemiska behandlingsalternativ tillgängliga för avancerade HCC-patienter och inkluderar sorafenib och den nyligen beskrivna behandlingen atezolizumab plus bevacizumab som möjliga förstahandsbehandlingar. Vi föreslår här akteosid, en fenyletanoidglykosid som är allmänt distribuerad i många medicinalväxter som en potentiell kandidat mot avancerad HCC.

Metoder: Cellproliferation, kolonibildning och migration analyserades i de tre humana HCC-cellinjerna BEL7404, HLF och JHH-7. Angiogenesanalys utfördes med användning av HUVES. Modellen BEL7404 eller JHH-7 xenograft nakna möss etablerades för att analysera de möjliga antitumöreffekterna av akteosid. qRT-PCR och western blotting användes för att avslöja de potentiella antitumörmekanismerna för acteosid.

Resultat:Acteosid från cistanchehämmade cellproliferation, kolonibildning och migration i alla de tre humana HCC-cellinjerna BEL7404, HLF och JHH-7. Akteosids förbud mot angiogenes avslöjades genom hämningen av rörbildning och cellmigration av HUVEC. Kombinationen av akteosid och sorafenib gav en starkare hämning av cellkolonibildning och migration av HCC-cellerna såväl som angiogenes av HUVEC. Akteosids antitumöreffektivitet in vivo demonstrerades ytterligare i BEL7404- eller JHH-7-xenotransplantatmodellen för nakna möss, med en förbättring när den kombineras med sorafenib för att hämma tillväxten av JHH-7-xenotransplantat. Ytterligare behandling av JHH-7-celler med akteosid avslöjade en ökning av nivån av tumörsuppressorprotein p53 såväl som en minskning av kallikreinrelaterat peptidas (KLK1, 2, 4, 9 och 10) gennivå utan signifikant förändringar av resten av KLK1–15-gener.

Slutsatser:Acteosid från cistancheutövar en antitumöreffekt möjligen genom dess uppreglering av p53-nivåer såväl som hämning av KLK-uttryck och angiogenes. Acteosid kan vara användbart som ett komplement vid behandling av avancerad HCC på kliniken.

Nyckelord: Acteosid, Hepatocellulärt karcinom, Sorafenib, Xenograft, p53, Kallikrein

Bakgrund

Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en vanlig malign tumör med egenskaper som dålig prognos och hög sjuklighet och dödlighet över hela världen [1, 2]. Olika faktorer har identifierats som bidrar till förekomsten och utvecklingen av HCC, inklusive infektion med hepatit B- eller C-virus, inaktivering av tumörsuppressorgener som p53, onormal aktivering av onkogener som K-ras och vissa signalmolekyler såsom PI3K, ERK/MAPK och Wnt/-catenin samt undvikandet av värdens immunsystem [3, 4]. För hantering av HCC är resektion, levertransplantation och radiofrekvensablation alternativ för HCC-patienter i tidigt stadium, men med höga frekvenser av återfall och metastaser [3, 5, 6]. Dessutom finns endast ett fåtal systemiska behandlingsalternativ tillgängliga för avancerade HCC-patienter och inkluderar sorafenib och den nyligen beskrivna behandlingen atezolizumab plus bevacizumab som möjliga förstahandsbehandlingar [7]. I detta sammanhang är det av vikt och intresse att antingen utveckla nya medel riktade mot flera molekylära mål eller sätta upp en ny strategi såsom tillämpning av kombinerad terapi vid behandling av avancerad HCC.

Acteosid från cistancheär en fenyletanoidglykosid som är utbredd i många medicinalväxter, inklusive Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] och Ligustrum purpurascens [10]. Allt fler bevis har visat att akteosid kan utöva olika biologiska aktiviteter, inklusive dess antitumöraktivitet. Till exempel visade akteosid starka antiproliferativa effekter på prostatacancerceller [11]. Intraperitoneal leverans av acteosid undertryckt tumörtillväxt i en melanom musmodell möjligen genom att hämma proteinkinas C [12]. Dessutom potentierade akteosid sensibiliseringen av kolorektala cancerceller för 5- Fluorouracil via inriktning på PI3K/Akt-signalering [13]. Våra tidigare data har också visat hämning av melanogenes av akteosid i B16-melanomceller [14]. Trots det finns lite information tillgänglig om den möjliga effekten av akteosid vid behandling av HCC och de potentiella underliggande mekanismerna.

I denna studie har vi visat detActeosid från cistanchehämmar cellproliferation, kolonibildning och migration i alla tre humana HCC-cellinjerna BEL7404, HLF och JHH7. Angiogenesen hämmas också efter behandling med akteosid, vilket framgår av hämningen av rörbildning och cellmigration av HUVEC. Akteosids antitumöreffektivitet in vivo demonstreras ytterligare i BEL7404- eller JHH-7-xenograft-mössmodellen, med en förbättring när den kombineras med sorafenib för att hämma tillväxten av JHH-7-xenotransplantat. Antitumöreffekterna av akteosid kan tillskrivas dess uppreglering av p53 såväl som undertryckande av KLK och angiogenes.

Metoder

Cell kultur

De humana hepatocellulära karcinomcellinjerna (HCC) BEL7404, HLF och JHH7 erhölls från American Type Culture Collection och odlades rutinmässigt i DMEM-medium innehållande 10 procent fetalt bovint serum kompletterat med 100 enheter/ml penicillin G och 100 ug/ml streptomycin i en fuktad inkubator vid 37 grader med 5 procent koldioxid. Mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC) isolerades från de mänskliga navelsträngsvenerna (tillhandahålls av ScienCell Research Laboratories, San Diego, USA) och hölls i ett endotelcellsmedium som beskrivits tidigare [15].

ReagensActeosid från cistanche (A01) köptes från Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, Kina; partinummer 100581; renhet större än eller lika med 99 procent av HPLC). Sorafenib erhölls från Selleck Chemicals (Houston, USA). Vi löste upp akteosid i 0,9 procent saltlösning. Stamlösningen av sorafenib bereddes i dimetylsulfoxid (DMSO; 10 mM), alikvoterades och lagrades vid -20 grader.

Djur

BALB/c (Nu/Nu) hanmöss (18-20 g, 6–8 veckor vid tidpunkten för mottagandet) användes i studien (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Shanghai, Kina). Djur har hållits i individuellt ventilerade polysulfonburar i ett temperatur- och ljuskontrollerat rum (12 timmars ljus- 12 timmars mörkercykel, lamporna tänds klockan 7:00 på morgonen) med fri tillgång till mat och vatten . Alla experimentella protokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee och utfördes enligt riktlinjerna från International Association for the Study of Pain angående användning av försöksdjur.

Cellproliferationsanalys Den antiproliferativa aktiviteten utfördes med användning av MTT-analysen. Kortfattat ströks celler ut med en densitet av 4–5 × 103 celler per brunn i 96-brunnsplattor. Efter att ha fästs över natten, behandlades celler med en serie koncentrationer av akteosid. Efter läkemedelsbehandlingarna vid den angivna tidpunkten inkuberades celler med 3-(4,5- dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, USA. Slutkoncentration: 5 ug/ml) i 3–4 timmar vid 37 grader. Formazanprodukten löstes i DMSO för kvantifiering vid en våglängd av 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 celler räknades under ett ljusmikroskop (× 100 förstoring; Olympus, Tokyo, Japan).

Sårläkningsanalys Cellerna såddes i {{0}}brunnsplattor (1 × 105 celler per brunn) och odlades till 90 procent konfluens. Cellskiktet skrapades med en steril 200 ul pipettspets för att producera ett sårgap. Cellmigrering in i det sårade området visualiserades vid angivna tidpunkter (0, 10 och 24 timmar) under ett inverterat ljusmikroskop med en förstoring av × 100. Varje experiment utfördes i tre exemplar.

Rörbildningsanalys HUVECs odlades som tidigare beskrivits [15]. I korthet belades 96-brunnsplattorna med Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) enligt tillverkarens instruktioner och återfördes sedan till inkubatorn för att polymerisera i 30–40 minuter. HUVEC:erna såddes sedan med en densitet av 2 × 105 celler/ml och behandlades med olika givna läkemedel i 8 timmar. Rörbildningen fotograferades med ett inverterat mikroskop vid de angivna tidpunkterna och analyserades med hjälp av ImageJ-mjukvara.

Western blotting-analys

Totala cellysat framställdes med radioimmunoutfällningsanalysbuffert (RIPA) (50 mM Tris HCl vid pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 procent NP40, 1 procent natriumdeoxicholat, 0,1 procent SDS, 10 ug/ml leupeptin, 10 ug/ml aprotinin och 2 mM PMSF). Proteinprover med lika mängder (20 ug/bana) separerades på SDS-PAGE-gel och överfördes till PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranen inkuberades över natten med p53-antikropp (Cell Signaling Technology, Boston, MA). För laddningskontroller sköljdes membranen med en strippningsbuffert och undersöktes på nytt med -aktin-antikroppen (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Proteiner detekterades med användning av ett ECL-detektionssystem (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA).

QRT-PCR

Totalt RNA extraherades från cellinjer med hjälp av Trizol-reagenset (Invitrogen, USA) och genomgick en omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) för att syntetisera cDNA med användning av ett kommersiellt tillgängligt kit. Realtids qRT-PCR med 2xSYBR grön qPCR Supermix utfördes på Stratagene Mx3000P PRC-maskin (Agilent Technologies, USA). Primersekvenserna visades nedan: sens 5'-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3' och antisens 5'-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3' för KLK1; sense 5'-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ och antisense 5'-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3' för KLK2; sense 5'- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ och antisense 5'-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3' för KLK3; sense 5'-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ och antisense 5'- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3' för KLK4; sense 5'-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ och antisense 5'- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3' för KLK5; sense 5′- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ och antisense 5'-TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ för KLK6; sense 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3' och antisense 5'- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ för KLK7; sense 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ och antisense 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ för KLK8; sense 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ och antisense 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ för KLK9; sense 5'-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3' och antisense 5'- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3' för KLK10; avkänna 5'-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3' och antisense 5'-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3' för KLK11; sense 5'-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ och antisense 5'-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3' för KLK12; sense 5'-CCTGAACCACGACCATGACA-3' och antisense 5'-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3' för KLK13; sense 5'-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3' och antisense 5'-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3' för KLK14; sense 5'-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ och antisense 5'-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ för KLK15; sense 5'-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ och antisense 5'- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3' för GAPDH. Cykeltröskelvärdena (Ct) för varje KLK-gen normaliserades till det för GAPDH och analyserades med MxPro-mjukvaran.

In vivo antitumöraktivitet av A01 enbart eller i kombination med sorafenib. BEL7404-cellsuspensionerna preparerades (3 × 106 celler) och injicerades subkutant i höger sida av atymiska nakna möss. Tio dagar efter inokuleringen screenades tumörbärande möss (kroppsvikt(g):22–26; medelvärde ± SEM:23,8 ± 0.14) och selekterades för randomisering i 7 behandlingsgrupper efter tumörvolym ({ {12}} mm3). Totalt 38 möss tilldelades olika behandlingsgrupper (n=5 per grupp förutom modellgruppen (n=8)). Djuren behandlades sedan via oral sondmatning med akteosid (A01; 12,5, 25 och 50 mg/kg), enbart sorafenib (50 mg/kg) eller i kombination med A01 (50 mg/kg) en gång dagligen i 14 dagar. Dessutom gavs en dos på 20 mg/kg A01 också intravenöst. Doser valdes baserat på tidigare studier och våra preliminära data [15]. Tumörtillväxten övervakades var 3:e eller 4:e dag med användning av en elektronisk bromsok, med volymen beräknad som 0,5 x längd x bredd (mm3). Dessutom inkluderades ett parallellt experiment med JHH-7-ympning. Sju dagar efter inokuleringen screenades tumörbärande möss (kroppsvikt(g):20–26; medelvärde ± SEM:24,0 ± 0,20) och selekterades för randomisering i behandlingsgrupper i enlighet med tumörvolymen (80-130 mm3 ). Totalt 23 möss tilldelades 4 behandlingsgrupper (n=5 per grupp förutom modellgruppen (n=8)). Djuren fick sedan A01 (20 mg/kg, iv), enbart sorafenib (50 mg/kg, ig) eller kombinerat med A01 (20 mg/kg, iv) en gång dagligen under 14 dagar i följd. Alla möss bedövades med kloralhydrat (350 mg/kg) och avlivades genom nackdislokation i slutet av observationsperioden. Och tumörmassan togs bort och avbildades med en digitalkamera.

Statistisk analys

Alla data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Om inget annat anges utfördes statistiska analyser med användning av variansanalys (ANOVA) följt av ett posthoc Tukey-test. Tumörvolymvärden visas som medelvärde ± standardfel av medelvärdet (SEM). Tvåvägs ANOVA följt av Tukey-tester användes för att analysera tumörvolymdata. Programvaran GraphPad Prism användes för statistiska analyser. Ett värde på p < 0.05="" ansågs="" vara="" statistiskt="">

Resultat

Effekter av A01 på proliferation och kolonibildning av HCCs in vitro

De tre HCC-cellinjerna (BEL7404, HLF och JHH7) användes för cellproliferationsanalysen. Såsom visas i Fig. 1 avslöjade MTT-analysen att A01 hämmade proliferationen av alla de tre HCC-cellerna. För att ytterligare fråga om den antiproliferativa aktiviteten av A01 berodde på dess förmåga att hämma cellklonogenicitet, utfördes kolonibildningsanalysen. A01 vid 100 μM visade stark hämning av kolonibildning i BEL7404-celler (Fig. 2a och b). I kombination med sorafenib (2 μM) var hämningsstyrkan starkare än för A01 eller enbart sorafenib. Liknande resultat sågs också i de andra två HCC-cellerna, HLF och JHH-7 (Fig. 2c och d).

Effekter av A01 ensamt eller i kombination med sorafenib på cellmigration av HCC in vitro

Vi utvärderade nästa cellmigrering med hjälp av repsåranalysen. Som visas i Fig. 3 förhindrade kombinationen av A01 (100 eller 500 μM) och sorafenib (10 μM) signifikant sårläkning i alla tre HCC-celler, jämfört med kontrollgruppen. För BEL7404-celler gav både A01 (100 eller 500 μM) och sorafenib (10 μM) endast en tendens att förhindra sårläkning utan statistisk signifikans (fig. 3a och d). För HLF-celler hämmade A01 vid 500 μM och sorafenib vid 10 μM sårläkning. I synnerhet producerade A01 (500 μM) i kombination med sorafenib (10 μM) en starkare hämning av sårläkning än enbart sorafenib (fig. 3b och e). För JHH-celler förhindrades sårläkning av A01 (500 μM) och sorafenib (10 μM). Kombinationen av A01 (100 μM) och sorafenib (10 μM) gav en starkare hämning av sårläkning än A01 (100 μM) eller sorafenib (10 μM) enbart. Dessutom visade A01 vid 500 μM i kombination med sorafenib (10 μM) en starkare hämning av sårläkning än A01 (500 μM) eller sorafenib (10 μM) enbart (fig. 3c och f).

Effekter av A01 ensamt eller i kombination med sorafenib på angiogenes in vitro

Angiogenes är nära associerad med tumörtillväxt, progression och metastaser [16], och anses därför vara ett av de mellanliggande målen för cancerbehandling. Vi utförde först en rörbildningsanalys för att analysera den potentiella angiogenesen in vitro. Som visas i Fig. 4 började behandling under 3 timmar med enbart sorafenib (10 μM) eller kombinationen av A01 (100 och 500 μM) och sorafenib (10 μM) visa hämmande effekter på bildandet av kärlliknande strukturer, dvs. förlängningen och inriktningen av HUVECs (fig. 4a och c). Efter behandling i 8 timmar hämmade A01 (100 och 500 μM), sorafenib (10 μM) såväl som kombinationen av A01 och sorafenib signifikant bildningen av kärlliknande strukturer, med starkare hämning av kombinationen av A01 och sorafenib än A01 eller sorafenib enbart (fig. 4a och c). Dessutom är cellmigreringen av HUVEC ett nyckelsteg för att bilda nya kärl under angiogenes och undersöks därmed. Som visas i Fig. 4b och d, A01 (500 μM), sorafenib (10 μM) såväl som kombinationen av A01 (100 och 500 μM) och sorafenib (10 μM) hämmade alla signifikant cellmigration av HUVEC. A01 (500 μM) kombinerat med sorafenib (10 μM) gav starkare hämning än A01 (500 μM) eller sorafenib (10 μM) enbart.

Effekter av A01 ensamt eller i kombination med sorafenib på in vivo tumörtillväxt av BEL7404 och JHH-7 HCC xenotransplantat

För att ytterligare utvärdera effektiviteten av A01 ensamt eller i kombination med sorafenib på in vivo-tumörtillväxten av HCC, etablerade vi en subkutan xenograftmodell nakenmus med BEL7404 eller JHH-7 celler. Som visas i fig. 5 minskade tumörvolymen kraftigt efter behandling med A01 (25 och 50 mg/kg, via oral sondmatning; 20 mg/kg, via svansvenen; alla p < 0,01="" vs="" modellgrupp)="" eller="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" via="" oral="" sondmatning;="" p="">< 0,01="" vs="" modellgrupp)="" enbart="" (fig.="" 5a="" och="" b).="" kombinationen="" av="" a01="" (50="" mg/kg)="" och="" sorafenib="" (50="" mg/kg)="" visade="" en="" starkare="" hämning="" av="" tumörtillväxt="" jämfört="" med="" enbart="" sorafenib="" (p="">< 0,01),="" men="" gav="" en="" liknande="" effekt="" som="" enbart="" a01="" (fig.="" 5a="" och="" c)="" ).="" vi="" använde="" sedan="" jhh="" -7="" xenograft="" nakna="" mössmodell="" för="" att="" ytterligare="" testa="" den="" möjliga="" antitumöreffekten="" av="" a01.="" som="" visas="" i="" fig.="" 6="" producerade="" behandling="" med="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" eller="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" ig)="" en="" signifikant="" hämning="" av="" tumörtillväxt="" av="" jhh-7="" xenotransplantat="" (p="">< 0,01="" jämfört="" med="" modellgruppen="" ),="" med="" större="" inhibering,="" när="" de="" kombineras="" tillsammans="" (fig.="" 6a="" och="" b;="" p="">< 0,01="" vs="" a01="" eller="" enbart="">

Möjlig modulering av kallikrein-relaterat peptidas och p53 avActeosid från cistanche

Kallikrein-relaterade peptidas (KLK) har föreslagits som en cancerbiomarkör vid diagnos och prognos av olika cancerformer, inklusive hepatocellulärt karcinom på grund av dess dysregulerade uttryck [17-19]. I det här scenariot upptäckte vi genuttryck av KLK1–15 i HCC JHH -7-cellinjen. Som visas i Fig. 7 producerade behandling med akteosid en signifikant hämning av KLK1, 2, 4, 9 och 10 mRNA-nivåer (Fig. 7a-e), utan några signifikanta förändringar av resten av KLK1-15 (data visas inte ). Dessutom upptäckte vi också nivån av tumörsuppressorprotein p53 och avslöjade en ökning av behandlingen med acteosid (Fig. 7f).

Diskussion

Hanteringen av avancerad HCC har länge varit svårbehandlad på grund av oförmågan att ställa diagnos i tidigare skeden och tumörens kemoresistens [5, 6]. Sorafenib, multikinashämmaren som rapporterats hämma cellproliferation och angiogenes, har tillsammans med en annan oral multikinashämmare lenvatinib blivit standardbehandling av avancerad HCC [3, 5, 20, 21]. Den totala överlevnaden är dock blygsam i ljuset av de låga svarsfrekvenserna och olämpligheten i de kliniska miljöerna [3, 22]. En nyligen genomförd studie visade att atezolizumab plus bevacizumab gav bättre kliniska resultat än sorafenib hos patienter med inoperabel HCC, vilket gör denna kombination till ett möjligt nytt förstahandsbehandlingsalternativ för avancerad HCC [7]. I detta sammanhang har vi identifierat att fenyletanoidglykosiden,Acteosid från cistanchehämmade cellproliferation, kolonibildning och migration i de tre humana HCC-cellinjerna BEL7404, HLF och JHH-7 samt förbjuden angiogenes av HUVEC. Kombinationen av akteosid och sorafenib gav en starkare hämning av cellkolonibildning och migration av HCC-cellerna såväl som angiogenes av HUVEC. Acteosid presenterade antitumöreffekten i BEL7404 eller JHH-7 xenograft nakna mössmodell, med en förbättring när den kombinerades med sorafenib för att hämma tillväxten av JHH-7 xenograft. Ytterligare analyser avslöjade en ökning av p53 såväl som en minskning av vissa KLK-gener. Följaktligen bör eventuell användning av akteosid som tillägg vid behandling av avancerad HCC på kliniken övervägas.

Monterande bevis har visat antitumöreffekterna avActeosid från cistanchei olika tumörceller såsom B16 melanomceller, glioblastomceller, kolorektala cancerceller, orala skivepitelcancerceller, prostatacancerceller och humana bröstadenokarcinomceller [11–13, 23–25] eller hos djur som bär tumörer [12]. Trots det har få studier fokuserat på effekterna av akteosid på HCC in vitro eller in vivo förutom en studie som använder dietylnitrosamin som cancerframkallande för att inducera hepatokarcinogenes hos råttor och avslöjar kemoprevention med akteosid [26]. I den aktuella studien visade vi hämningen av akteosid av cellproliferation, kolonibildning och migration i HCC-cellinjer såväl som tumörtillväxt hos möss som bär HCC-cellinjexenotransplantat, vilket direkt visar antitumöreffekterna av akteosid i HCC. Dessutom gav kombinationen av akteosid och sorafenib ännu starkare antitumöreffekter. I kombination med bevis för att akteosid är skyddande mot leverskador [27–29] utan toxiska effekter på djur och ingen mutagenicitet [30], verkar det vara möjligt för den framtida tillämpningen av kombinationsbehandlingen av akteosid och sorafenib hos patienter med avancerad HCC på kliniken.

Den humana kallikreinfamiljen omfattar 15 homologa, enkelkedjiga, utsöndrade trypsin- eller kymotrypsinliknande serinproteaser (KLK1-15) och har varit inblandad i regleringen av tumörtillväxt, neoplastisk progression, angiogenes och metastaser [18, 31]. I synnerhet har KLK föreslagits som en cancerbiomarkör vid diagnos och prognos av olika cancerformer, inklusive hepatocellulärt karcinom på grund av dess dysregulerade uttryck [17-19]. Till exempel föreslås KLK1 som biomarkör för magcancer på grund av höjningen av KLK1-nivåer i magsäcksneoplasma och förhindrande av tumörtillväxt i magcancer genom hämning av KLK1-aktivitet med kallikreinbindande protein (KBP) [32]. I detta scenario observerade vi en signifikant hämning av KLK-mRNA-nivåer av akteosid (KLK1, 2, 4, 9 och 10). Applicering av KBP, som specifikt binder till vävnadskallikrein och hämmar kallikreinaktivitet, rapporterades undertrycka tillväxten av HCC hos möss, möjligen via dess anti-angiogene aktivitet [33], vilket tyder på den möjliga involveringen av KLK i utvecklingen av HCC. Dessutom kan tumörsuppressorproteinet p53 inducera senescens, apoptos såväl som cellcykelstopp. Ökat p53-uttryck ger ökad kemosensitivitet i cancerceller [34]. I detta avseende visade våra västerländska resultat en ökning av p53-nivåer efter behandling med akteosid. Sammantaget är det rimligt att dra slutsatsen att akteosid utövar antitumöreffekterna på HCC möjligen genom dess uppreglering av p53 såväl som hämning av KLK och angiogenes.

Det bör noteras att det direkta molekylära målet till vilketActeosid från cistanchekan direkt binda är fortfarande oklart. Våra preliminära data med användning av molekylär dockning avslöjade direkt bindning av akteosid med kallikrein (data visas inte). Ytterligare experiment skulle behövas för att klargöra denna presumtion. Dessutom, när det gäller doserna av akteosid som används för cellanalys i studien 10–50 gånger högre än den för sorafenib (10 μM), valde vi först dessa doser av akteosid i enlighet med dos-responssamband i MTT-analysen. För det andra var doserna vi använde (100, 500 μM) jämförbara med tidigare studier [35], där acteosid (100 μM) hämmade cellproliferation av kolorektala cancerceller. Sist, trots den högre dosen i cellanalysen, producerade acteosid en uttalad hämning av tumörtillväxt i HCC xenograft nakna mössmodell i vår studie (25 och 50 mg/kg), effekterna liknar sorafenib (50 mg/kg). För sorafenib användes det i vår studie i dosen 10 μM på cellnivå. Denna dos är jämförbar med tidigare studier där sorafenib visade sig hämma cellviabiliteten med en IC50 på 4,0–6,5 μM i HCC-cellinjerna i PLC/PRF/5- och HepG2-celler. Däremot var dosen av sorafenib som användes för att undertrycka tillväxten av HCC-xenotransplantat i SCID-honmöss 30 mg/kg (po genom sondmatning) [36]. På kliniken är den rekommenderade dosen sorafenib för patienten 400 mg per gång (2*0,2 g), två gånger om dagen (totalt 800 mg per dag). Denna dos för sorafenib som används på kliniken är i motsats till den som används i cellanalys (IC50-värde i μM-nivå), möjligen på grund av dess dåliga absorberbarhet under in vivo-förhållanden. För akteosid, baserat på dess dosering till möss (50 mg/kg, ig), är dess ekvivalenta dos för människor (60 kg kroppsvikt) cirka 250 mg. Denna dos är jämförbar med den för sorafenib som används på kliniken och bör vara acceptabel för patienterna.

Slutsatser Sammanfattningsvis,Acteosid från cistancheär kapabel att utöva en antitumöreffekt i HCC-cellinjer och i nakna möss som bär HCC-cellinjexenotransplantat, effekter möjligen via ökande p53-nivåer samt förbjuda KLK och angiogenes. Acteosid kan vara användbart som ett komplement vid behandling av avancerad HCC på kliniken.

Referenser

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancerstatistik 2018: GLOBOCAN uppskattningar av incidens och dödlighet över hela världen för 36 cancerformer i 185 länder. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Hepatocellulärt karcinom. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Hepatocellulärt karcinom i immunterapins era. Curr Probl Cancer. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Hepatocellulärt karcinom: mekanismer för progression och immunterapi. World J Gastroenterol. 2019;25(25):3151–67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Kontroverser i hanteringen av hepatocellulärt karcinom. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Diagnosen och behandlingen av hepatocellulärt karcinom. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO, et al. Atezolizumab plus Bevacizumab vid inoperabelt hepatocellulärt karcinom. N Engl J Med. 2020;382(20):1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Monoterpenoid- och fenyletanoidglykosider från Ligustrum peduncular. Fytokemi. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. HPLC bestämning avakteosidi Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Antioxidativa aktiviteter av fenyletanoidglykosider från Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. En allmän syntetisk strategi och anti-spridningsegenskaperna på prostatacancercellinjer för naturliga fenyletanoidglykosider. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I, et al. Selektiv cytotoxicitet av örtsubstansen acteosid mot tumörceller och dess mekanistiska insikter. Redox Biol. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascoside: identifiering, kvantifiering och potentiell sensibilisering av kolorektala cancerceller för 5-FU genom inriktning på PI3K/AKT-väg. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Osmanthus fragrans blommaextrakt och dess berikade akteosid hämmar melanogenes och ultraviolett-inducerad pigmentering. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Den nya PI3K-hämmaren S1 samverkar med sorafenib i icke-småcelliga lungcancerceller som involverar Akt-S6-signalering. Undersök nya droger. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Kännetecknande för cancer: nästa generation. Cell. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Användbarhet av kallikrein-relaterade peptidaser (KLK) som cancerbiomarkörer. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Diagnostisk och prognostisk biomarkörspotential för kallikreinfamiljens gener i olika cancertyper. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikrein-relaterade peptidaser (KLKs) i gastrointestinal cancer: mekanistiska och kliniska aspekter. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, et al. Effekt och säkerhet av sorafenib hos patienter i Asien-Stillahavsområdet med avancerat hepatocellulärt karcinom: en randomiserad fas III, dubbelblind, placebokontrollerad studie. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib vid avancerat hepatocellulärt karcinom. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Låten MJ. Kemoterapi för infusion av leverartärer för avancerat hepatocellulärt karcinom. World J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Vattenhaltigt extrakt av Anisomeles India och dess renade förening utövar antimetastatisk aktivitet genom hämning av NF kappaB/AP-1-beroende MMP-9-aktivering i humana bröstcancer MCF-7-celler. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B, et al. Effekt av verbascoside på apoptos och metastaser i humant oralt skivepitelcancer. Int J Cancer. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Synergistisk anticancereffekt av akteosid- och temozolomidbaserad glioblastomkemoterapi. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Akteosid förmedlar kemoprevention av experimentell leverkarcinogenes genom STAT-3-reglerad oxidativ stress och apoptos. Environ Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metaboliter av dietary Acteoside: profiler, isolering, identifiering och leverskyddande kapacitet. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Acteosid hämmar apoptos vid D-galaktosamin och lipopolysackarid-inducerad leverskada. Life Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Skyddande effekt av akteosid på immunologisk leverskada inducerad av Bacillus Calmette Guerin plus lipopolysackarid. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Den Osmanthus doftande blomman fenylethanoid glykosid-rikt extrakt: akuta och subkroniska toxicitetsstudier. J Etnopharmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Mänsklig vävnad kallikreins: en familj av nya cancerbiomarkörer. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Jämförelse av vävnadskallikrein och kininreceptoruttryck i magsår och neoplasmer. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbindande protein undertrycker tillväxten av hepatocellulärt karcinom genom antiangiogen aktivitet. Cancer Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. Ökning av p53-protein sensibiliserar icke-småcellig lungcancer mot paklitaxel och cisplatin in vitro. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbascoside främjar apoptos genom att reglera HIPK2-p53-signalering hos människa kolorektal cancer. BMC Cancer. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib blockerar RAF/MEK/ERK-vägen, hämmar tumörangiogenes och inducerar tumörcellapoptos i hepatocellulär karcinommodell PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66:11851–8.