Aktivitetsguidad isolering av fenoliska kompositioner från Anneslea Fragrans vägg. Och deras cytoskyddande effekt mot väteperoxidinducerad oxidativ stress i HepG2-celler Del 1

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

Abstrakt: Anneslea fragrans Wall., commonly known as"Pangpo Tea", is traditionally used as folk medicine and healthy tea for the treatment of liver and intestine diseases. The aim of this study was to purify the antioxidative and cytoprotective polyphenols from A.fragrans leaves. After fractionation with polar and nonpolar organic solvents, the fractions of aqueous ethanol extract were evaluated for their total phenolic (TPC) and flavonoid contents(TFC) and antioxidant activities(DPPH, ABTS, and FRAPassays). The n-butanol fraction (BF)showed the highest TPC and TFC with the strongest antioxidant activity. The bio-guided chromatography of BF led to the purification of six flavonoids (1-6) and one benzoquinone lanthanoid (7). The structures of these compounds were determined by NMR and MS techniques. Compound 6 had the strongest antioxidant capacity, which was followed by 5 and 2. The protective effect of the isolated compounds on hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress in HepG2 cells revealed that the compounds 5 and 6exhibited better protective effects by inhibiting ROS productions, having no significant difference with vitamin C(p>0.05), medan 6 visade den bästa anti-apoptosaktiviteten. Resultaten tyder på att A.fragrans skulle kunna fungera som en värdefull fytokemisk källa för antioxidanter för att utveckla funktionell mat och hälsonäringsprodukter.

Nyckelord:Anneslea doftämnen; antioxidant; guidad isolering; oxidativ stress; flavonoidglykosider

Klicka här för att veta mer

1. Introduktion

Reactive oxygen species (ROS) produceras som biprodukter genom oxidativ andning i normala fysiologiska och biokemiska processer [1]. Som endogena fria radikaler spelar ROS en viktig roll i cellsignalering och upprätthållande av kroppsbeständighet inom ett normalt intervall [2]. Om ROS inte kunde rensas effektivt, kan överdriven ROS leda till förekomsten av oxidativ stress, vilket kan påverka cellproliferation och apoptos [3]. Oxidativ stress är nära relaterat till en mängd olika sjukdomar, inklusive diabetes, hyperlipemi, fetma, cancer och hjärt- och kärlsjukdomar och neurodegenerativa sjukdomar [4]. Nyligen har många studier visat att en diet berikad med antioxidanter har en rad gynnsamma effekter på grund av deras rensande förmåga på överdriven ROS [5,6].

Naturliga antioxidanter innehåller en mängd olika molekyler såsom polyfenoler[], karotenoider [8], vitaminer [9], kväveinnehållande föreningar [10] och kumariner [9]. Polyfenoler är spridda över hela växtriket och främjar hälsofördelar på grund av deras antioxidantegenskaper [11]. Många av dem, såsom resveratrol och vissa derivat [12], antocyanidiner [13, isoflavoner [14l, katekin [15l och quercetin] är välkända för sin skyddande effekt genom att rensa ROS [1]. Under de senaste åren har polyfenoler uppmärksammats för att förebygga cancer[17], kardiovaskulär dysfunktion[18], neurodegenerativa sjukdomar [19] och åldrande [20]. Att leta efter effektiva antioxidanter är därför ett akut behov för att främja människors hälsa.

Cistanche kan förbättra immuniteten

Anneslea doftvägg. är en vintergrön växt, som huvudsakligen finns i södra Kina [21]. Förutom dess prydnadsändamål används bladen av A.fragrans också som en folkmedicin för att behandla feber, leverskydd, uppfriskande mage och tarmar Kina och Kambodja [22], vilket hade registrerats i "Yunnan Simao Chinese Herbal Medicine" .Dessutom har bladen också bearbetats som en tedryck, som är känd som "Pangpo Tea". I tidigare rapporter [23] har extraktet av A.fragrans visat antioxidant- och antimalariaaktiviteter. Men hittills har dess antioxidantfenolföreningar från A.-dofter inte rapporterats.

Därför var syftet med denna forskning att isolera och identifiera de antioxidantföreningar från A. fragrans blad som är ansvariga för deras traditionella användning för behandling av leversjukdomar. De fyra fraktionerna, diklormetanfraktion (DF), etylacetatfraktion (EAF), en n-butanolfraktion (BF) och restvattenfraktion (RWF) av vattenhaltigt etanolextrakt bedömdes för deras totala fenolhalt (TPC) och totala flavonoidhalter (TFC) och för deras antioxidantkapacitet. N-butanolfraktionen (BF) hade den högsta TPC och TFC med den starkaste antioxidantaktiviteten. Den biostyrda fraktioneringen av BF möjliggjorde rening av föreningar. Dessutom utfördes den cytoskyddande effekten av de isolerade föreningarna på väteperoxid (H, O,)-inducerad oxidativ stress i humana levercancer HepG2-celler. Den intracellulära ROS-produktionen och cellapoptos bestämdes med användning av flödescytometri. Således gav denna forskning en värdefull antioxidant fytokemisk ingrediens för utveckling och användning av A.fragrans-blad som ett funktionellt komplement (hälsosamt te) i livsmedels- och hälsoindustrin.

2. Resultat och diskussion

2.1. Avkastningseffektivitet för fraktioner och subfraktioner

Vätske-vätskefördelningen med organiska lösningsmedel och kolonnfraktionering är viktiga tekniker för att berika de bioaktiva föreningarna från råextrakt [24]. Med användning av vätske-vätskefördelning fraktionerades etanolextrakt (CE) från A. fragrans blad successivt med diklormetan, etylacetat och n-butanol för att ge fyra fraktioner (DF, EAF, BF respektive RWF). Avkastningsprocenten för fraktioner visade sig variera från 11 till 27 procent. Den kvarvarande vattenfraktionen (RWF, 27 procent) hade det högsta utbytet, och utbytena av övriga fraktioner var i ordningen enligt följande: n-butanolfraktion (BF, 24 procent), etylacetatfraktion (EAF, 21 procent), diklormetan fraktion (DF, 11 procent).

Utbytesprocenten av subfraktioner (BF-A till E) visade sig variera från 3,82 till 48,4 procent. BF-E visade den högsta avkastningen på 48,4 procent följt av BF-D (24,96 procent), som har betydligt högre avkastning än de andra fraktionerna.

2.2.HPLC-analys

Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) detektion har visat sig vara en kraftfull teknik för kvantitativ bestämning. HPLC-analys visade att BF hade flest föreningar med den starkaste antioxidantaktiviteten. Under ledning av antioxidantanalyser och HPLC-analys, kromatograferades den antioxidativa fraktionen ytterligare för isolering av subfraktioner. BF utsattes för en hydratiserad harts D101-kolonn för att ge fem subfraktioner (BF-A till E). HPLC-analys visade att BF-Cto E hade flest antioxidantföreningar. Biostyrd fraktionering av dessa fraktioner (BF-C till E) möjliggjorde rening av sju rena föreningar.

Såsom visas i figur 1 profilerades BF och sju rena föreningar genom HPLC-analys. Baserat på jämförelse med retentionstiderna och UV-absorptionskurvorna bekräftades dessa sju föreningar genom retentionstider vid 7,51 min (frätande, 7), 7,92 min ((epi)-katekin, 6), 9,38 min (confusosid, 1), 9,57 min. min((S)-naringenin-7-O- -D-glukopyranosid, 4), 10,32 min (vaccinii folin, 2), 12,64 min (2',3,4,4'-tetrahydroxydi-dihydrochalcone, 5), och 13,95 min (1-[4-(-D-glukopyranosyloxi)-2-hydroxifenyl]-3-(4-hydroxi-3-metoxifenyl) -1-propanon,3)(Figur 1A). Bland dem tillhör föreningarna 1-6 flavonoider, och förening 7 är bensokinoletanoid.

2.3.Totalt fenolinnehåll (TPC) och totalt flavonoidinnehåll (TFC)

A.fragrans-löven används traditionellt som bearbetat hälsote och har visat sig vara en bra resurs för fenoler och flavonoider [25]. Enligt spektrofotometriska analyser testades TPC och TFC i olika fraktioner och subfraktioner från A. fragrans blad. Som visas i tabell 1 hade BF det högsta TPC-värdet med 238,12±12.05 mg GAE/g extrakt följt av EAF. DF visade det lägsta TPC-värdet som 66,52±0,57 mg GAE/g extrakt. På liknande sätt hittades de högsta TFC-koncentrationerna också i BF med TFC-värde på 165,19±5,21 mg RE/extrakt. När det gäller RWF och EAF (66,92±1,38 respektive 116,12±2,89mg GAE/extrakt) hade de också lägre TFC-koncentrationer än BF (165,19±5,21 mg RE/g extrakt), medan DF hade den lägsta TFC-koncentrationen som 47,94±2,84 mg RE/g extrakt. Halten av TPC och TFCin BF var ungefär fyra gånger högre än i DF.

Uppgifterna visade närvaron av högsta TPC och TFC i BF-E med värden som 262,03±1,72 mg GAE/g extrakt; 180,52± 6,30 mg RE/g extrakt, respektive, följt av BF-D (219,84±4,01 respektive 157,01±2,50 mg RE/g extrakt), BF-C (210,69±6,31 och 151,01±4,33 mg RE/g, extrakt) respektive), medan BF-B och BF-A hade de lägsta TPC- och TFC-värdena (tabell 1).

2.4.Antioxidantverkan

De flesta av polyfenolerna, särskilt flavonoider och fenolsyror, utnyttjas till populära antioxidantmat (näringsämnen) och har en rad mänskliga fördelar [17]. I vår tidigare studie har A.fragrans-löven visat sig vara en bra resurs för polyfenoler[26]. Antioxidantaktiviteten hos extraktet från A. fragrans-blad och dess fytokemikalier har dock inte undersökts ännu. På grund av olika antioxidativa reaktionsmekanismer kombinerades tre analyser av ABTS, DPPH och FRAP för att utvärdera antioxidantaktiviteten hos fraktionerna och subfraktionerna från A. fragrans blad.

Among the fractions, BF showed the most potent antioxidant activity in ABTS, DPPH, and FRAP radical-scavenging activities with 1808.46±96.52,951.42±87.75, and 1822.96± 29.24 μmol TE/g extract （Table 1）.PDF showed the lowest antioxidative activity in ABTS and FRAP assays（139.23±8.62 μmol TE/g extract and 180.05± 9.46 μmol TE/g extract, respectively)(Table 1). Whereas the radical scavenging activities of four fractions (DF, EAE, BF, and RWF) in the DPPH radical-scavenging assay were found to vary from 613.38± 45.35 to 951.42±87.75 μmol TE/g extract, respectively, having no significant difference (p>0.05). These results suggested that the phytochemicals from A. fragrans leaves might be insensitive to DPPH. To further obtain the active metabolites, BF was selected for further fractionation. The BF was subjected to D101 macroporous adsorbing resin column chromatography eluting by a gradient of the methanol-aqueous system to yield five subfractions(BF-A to E). Hence, the ABTS radical-scavenging activity of these subfractions can be ranked as BF-E> BF-C>BF-D. Den reducerande aktiviteten i FRAP-analysen avslöjade att BF-D hade den starkaste antioxidativa aktiviteten, vilken följdes av BF-C och BF-E. Det är anmärkningsvärt att tre subfraktioner (BF-C till E) uppvisade högre antioxidativ aktivitet än moderfraktionen (BF). Sammantaget underkastades BF-C till E kolonnkromatografi för isolering och identifiering av de antioxidativa fytokemikalierna.

2.5. Antioxidantverkan hos de isolerade föreningarna

Alla de isolerade föreningarna (föreningarna 1-7) utvärderades med avseende på antioxidantkapacitet genom ABTS, DPPH-radikalavlägsnande aktivitet och FRAP-antioxidantaktivitet. Alla data beskrivs i tabell 2. Föreningar 6 och 2 visade den högsta antioxidantaktiviteten, följt av 5. Förening 4 uppvisade måttlig antioxidantaktivitet och föreningarna 1, 3 och 7 ansågs inaktiva med ABTS och DPPH radikalfångande aktiviteter mindre än 200 μmol TE/g extrakt. Genom att använda Vc (de radikalfångande aktiviteterna med 2932,91 ±93,63 respektive 1873,56±121,68 umol TE/g extrakt) som positiv kontroll, hade förening 6 den starkaste antioxidantaktiviteten i ABTS- och DPPH-radikalfångande analyser med 15819,30 mol och ± 3,915,3 mol och ± 3,915,3 mol TE/g extrakt (sid<0.05）, respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract,="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover,="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">

Dessutom diskuteras antioxidantstruktur-aktivitetsförhållandet för flavonoiderna (1-6) genom olika grader av hämmande effekter. Förening 2 uppvisade mer anti-tioxidantaktivitet än föreningarna 1, 3 och 5, vilket antydde att 3,4-dihydroxigrupperna i dihydrochalkoner i 2 kan spela en avgörande roll mot ABTS, DPPH-radikalfångande aktivitet och FRAP-antioxidant aktivitet, och glukosdelen substituerad vid C-4'i 2 kan spela en viktig roll för dess antioxidantkapacitet [4]. Dessutom uppvisade förening 6 den högsta antioxidantaktiviteten jämfört med andra föreningar, vilket antydde att flavan-3-oler (katekin) förmodligen uppvisar en bättre radikalfångande aktivitet än dihydrochalkoner och flavanoner [27]. Sammanfattningsvis valdes föreningarna 2, 5 och 6 med god antioxidantaktivitet ut ytterligare för cytoprotektiva effekter mot oxidativ stress av H2O2 i nästa studie.

2.6. Förhållandet mellan antioxidantaktivitet och TPC/TFC-innehåll

Koncentrationerna av TPC och TFC var starkt korrelerade med antioxidantaktivitet från värdena för FRAP (r{{0}}.982 och 0.977) och ABTS (r=0.959 och 0,965), respektive. Korrelationsmatrisen visade också stark korrelation mellan ABTS- och FRAP-värdena (r =0.992). Vidare utfördes en multivariat analys (PCA), som extraherades från data i Tabell 1. Som visas i figur 2 förklarade PCA 94,44 procent av den totala variationen, där PC1 stod för 84,73 procent av variansen och PC2 stod för 9,71 procent. FRAP-, ABTS- och DPPH-analyserna med EAF och RWF placeras i de övre högra kvadranterna, och TPC- och TFC-koncentrationerna med BF och BF-Cto E är placerade i de nedre högra kvadranterna i PC1-positiva poäng, respektive. Under tiden är DF och BF-A till B med låga TPC- och TFC-koncentrationer belägna längs axeln för PC1-negativa poäng. Dessa fynd visade att TPC- och/eller TFC-koncentrationerna är nära förknippade med antioxidantkapacitet, och ju högre TPCor TFC-koncentrationer är i fraktionerna och underfraktionerna, desto högre är deras antioxidantkapacitetsvärden. Dessa resultat avslöjade att de höga fenol- och flavonoidhalterna i olika fraktioner och subfraktioner från A. fragrans blad kan bidra till antioxidantaktivitet.

Figur 2. PCA-analys av totala fenoler, flavonoider och antioxidantaktivitet. Medel med olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader (s<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">

Den här artikeln är extraherad från Molecules 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules