Alkoholspecifik transkriptionsdynamik för minneskonsolidering och återfall del 4

Förutom Arc fann vi att mRNA-nivåerna av Egr1, men inte Bdnf, ökade i DH och mPFC genom återhämtning av alkoholminne.

Allt eftersom tiden går får människor gradvis en ny förståelse av glömskans mysterium. I denna process har en ny teknik för minneshämtning gradvis blivit en forskningshotspot.

Så finns det ett samband mellan återhämtning av alkoholminne och minnesprestanda? Kom och titta nu! Först och främst måste vi vara tydliga: Hämtning av alkoholminne är inte en separat teknik. Det är en teknik som påverkar hjärnans nervceller genom alkohol. Denna process kan aktivera vissa "sovande" minnen i hjärnan, vilket gör att vi kan uppdatera dessa minnen.

För det andra måste vi veta att att förbättra minnet inte bara tillåter oss att "komma ihåg" fler saker utan är en process för att hämta och rekonstruera minnen på olika sätt. Denna process kan hjälpa oss att bättre konsolidera och förstå den kunskap vi har lärt oss, och därigenom förbättra vårt minne.

Därför kan vi dra slutsatsen att det finns ett samband mellan återhämtning av alkoholminne och minnesprestanda. När vi använder den här tekniken för att extrahera tidigare minnen efter att ha druckit alkohol, genomgår vi en process för att återkonsolidera dessa minnen, och därigenom förbättra vårt minne i viss utsträckning.

Naturligtvis måste vi också notera att hämtning av alkoholminne inte är en långvarig och pålitlig teknik för att förbättra minnet. Om vi ​​vill ha ett utmärkt minne under lång tid måste vi kontinuerligt befästa och förbättra vårt minne genom dagliga studier och liv, i kombination med andra minnesträningstekniker.

I denna process måste vi alltid upprätthålla en optimistisk attityd för att bättre stimulera vår inlärningsmotivation och minnespotential. Låt oss därför möta minnesträning aktivt, vara oss själva oförtrutet och modigt gå vidare på vägen mot att kontinuerligt förbättra minnet! Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt, eftersom Cistanche deserticola också kan reglera balansen av signalsubstanser, som att öka nivåerna av acetylkolin och tillväxtfaktorer. Dessa ämnen är mycket viktiga för minne och inlärning. Dessutom kan Kött också förbättra blodflödet och främja syretillförseln, vilket kan säkerställa att hjärnan får tillräckligt med näringsämnen och energi, och därigenom förbättra hjärnans vitalitet och uthållighet.

Klicka nu för att förbättra korttidsminnet

Ökat Egr1-mRNA-uttryck har tidigare varit inblandat i rekonsolidering av rädsla och drogminnen [19, 21, 48, 61], vilket ökar möjligheten att denna transkriptionsfaktor också spelar en roll i återkonsolidering av alkoholminnen.

Medan Bdnfs roll i minnesrekonsolidering fortfarande är kontroversiell [19, 49], är Bdnf-induktion känd för att vara avgörande för inlärning av minnesförvärv och extinktion [19, 62]. Således kan bristen på förändring i Bdnf-uttryck i vår studie tyda på att vår minneshämtningsprocedur inte initierade utsläckningsinlärning parallellt med minneshämtning.

Dessutom rapporterade vi nyligen att även om mRNA-nivåerna av Bdnf i DH inte ökas av alkoholminneshämtning i sig, var uttrycket av tillväxtfaktorn förhöjt när återhämtningen följs av aversiv motkonditionering som förhindrade återfall [44], vilket tyder på en komplex roll för Bdnf. i alkoholminnesdynamik.

Våra resultat tyder på att ökningarna i IEG-uttrycket inte är unika för rekonsolidering av alkoholrelaterade minnen.

Faktum är att ARC och EGR1 tidigare var inblandade i konsolideringen av flera typer av minnen, inklusive rädslaminnen [19, 46, 47, 62], igenkänningsminnen [21], och minnen associerade med olika droger [20, 22, 61].

Men det finns också växande bevis för att vissa av de mekanismer som ligger bakom alkoholsökande kan skilja sig från de som kontrollerar naturlig belöningssökning [5, 27, 28, 63]. Det finns också bevis för att minnen för olika belöningar (och för olika droger, i synnerhet) behandlas differentiellt [29–32]. Våra RNAseq-analysfynd avslöjade verkligen den unika transkriptomiska signaturen inducerad av alkoholminneshämtning.

Specifikt hittade vi 44 gener i DH och en annan uppsättning av 9 gener i dem PFC, som visade betydande förändringar efter återhämtning av alkoholminne. Efter ytterligare datavalidering fokuserade vi på en gen i mPFC (Fkbp5) och tre gener i DH (Adcy8, Scl8a3 och Neto1) och fann att deras uttryck inte påverkades av hämtning av sackarosassocierade minnen.

Detta tyder på att, till skillnad från Arc och Egr1, spelar dessa fyra specifika gener sannolikt inte generella roller i bearbetningen av belöningsminnen, men de kan snarare spela selektiva roller i bearbetningen av alkoholminnen.

Intressant nog var dessa fyra gener tidigare inblandade i alkoholmissbruk, inlärning och minne. Således kodar Fkbp5 för FK506 Binding Protein 5, en regulator av det neuroendokrina stresssystemet [64].

FKBP5-varianter modulerar svårighetsgraden av alkoholabstinenssyndrom [65] och förutsäger benägenheten för tungt drickande hos människor [66-68]. Borttagning av Fkbp5 visades öka svårighetsgraden av alkoholabstinens [65] och alkoholdrickande [67] hos möss, medan farmakologisk hämning av proteinet minskade måttlig alkoholkonsumtion och återinförande av CPP hos möss [69] och minskat alkoholdrickande hos stressade hanråttor [70].

Nivåerna av Adcy8 mRNA, som kodar för adenylatcyklas 8 (AC8) som katalyserar cAMP-bildning som svar på kalciuminflöde och nyligen markerats som en möjlig regulator av alkoholintag [28, 71], minskade i blodkroppar från långtidsavhållsamma alkoholister [72].

Borttagning av Adcy8 har tidigare visat sig minska alkoholdrickandet och öka känsligheten för dessa datativa effekter av alkohol hos möss [73]. Dessutom uppreglerade kronisk alkoholexponering hos råttor hjärnuttrycket av lösta bärarfamilj 8 (natrium/kalciumbytare), medlem 3 (NCX3), proteinet som kodas av Scl8a3 [74, 75].

Alkoholkonsumtion hos råttor var också associerad med minskat uttryck i hjärnstammen av Neto1 [76], som kodar för neuropilin tolloid-like 1 (NRP1), en komponent i NMDA-receptorkomplexet [77].

Detta protein är involverat i synaptisk omorganisation och överföring i hippocampus [78] och krävs för rumslig inlärning och minne [77].

Sålunda visar våra resultat att blotta hämtningen av alkoholminnen, även utan några farmakologiska effekter av alkohol, påverkar uttrycket av dessa gener. Men deras specifika roll i återkonsolidering av alkoholminne och återfall återstår att testa.

En begränsning av den föreliggande studien är att RNA-seq-analysen utfördes på bulk-mPFC- och DH-vävnaderna, snarare än på individuella celler aktiverade genom minneshämtning. Specifikt har nyare studier föreslagit att minnen i allmänhet [79, 80], och specifikt alkoholrelaterade minnen [32, 81, 82], kodas via aktivering av neuronala ensembler som består av ett litet antal neuroner, som kan identifieras via neuronalaktiveringsmarkörer ( t.ex. cFOS) [80].

Faktum är att liknande IEG (cFOS)-aktiveringsmönster genom hämtning av operantkonditionerad alkohol och söta belöningsminnen hittades i mPFC och ytterligare mesolimbiska regioner i råtthjärnan [32, 81]. Sålunda är det möjligt att selektivt utföra RNA-seq-analysen på neuronalensemblen aktiverad genom minneshämtning skulle ha gett mer exakta resultat.

Sammanfattningsvis tyder våra resultat på att alkoholminnesåtervinning inducerar två parallella transkriptionsprogram. Ett program, som förmedlas via vanliga molekylära mekanismer för inlärning och minne, inklusive IEG:erna Arc och Egr1, är engagerad i konsolidering av minnen i allmänhet.

Det andra transkriptionsprogrammet, som lanserats av alkoholminneshämtning, styrs av gener som specifikt främjar alkoholrelaterade beteenden. Denna dubbelbearbetningsmodell för alkoholminnen väcker möjligheten att minneskonsolidering för olika minnen kan ha liknande molekylära mekanismer för dubbelbearbetning, med vissa komponenter som delas av flera minnen och andra unika för varje minnestyp.

Denna hypotetiska modell återstår att bedöma genom att testa om manipulering av dessa gener påverkar rekonsolidering av alkohol- och sackaros-minne differentiellt. Om så är fallet, skulle det antyda att det kan vara möjligt att sikta på belöningsspecifika molekylära mål för att behandla störningar relaterade till patogena minnen, såsom beroende, snarare än att störa stora molekylära mekanismer som är nödvändiga för många funktioner bortom återkonsolidering av alkoholminne.

MATERIAL OCH METODER

Se tilläggsinformation för detaljer om apparaten, läkemedel och medel, design och beredning av oligodeoxinukleotider (ODN), westernblot- och qRT-PCR-analyser och RNA-seq-biblioteksberedning.

Djur

Han- och honmöss C57BL/JRccHsd (25–30 g), inhysta 3–4/bur uppföddes vid Tel-Aviv University Animal Facility (Israel) och hölls under en 12 timmars ljus-mörkercykel (ljus tänds kl. 07.00), med mat och vatten tillgängligt adlibitum.

I experiment som involverade platskonditionering av sackaros begränsades tillgången till mat i 6 timmar före träningspass för att öka mössens motivation att samla sackarospellets. Denna korta varaktighet av matbrist är baserad på fynd att en 2–6 timmars fasta på dagtid inte påverkar matningsbeteendet [83] och inte utlöser en signifikant förändring av metabola markörer [84], vilket minimerar effekterna av matrestriktionen i sig. .

Möss vägdes två gånger i veckan för att kontrollera viktminskningen. Alla experimentella protokoll godkändes av och överensstämde med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee vid Tel Aviv University och NIHs riktlinjer (djurskyddsförsäkringsnummer A5010-01). Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet använda djur.

Beteendeförfaranden

Platskonditionering

Alkoholkonditionerad platspreferens (CPP): Alla möss vände sig vid dagliga ip saltlösningsinjektioner under 3 dagar.

Baslinjetest (dag 1): Den första dagen drogs skjutdörren in och möss fick fritt utforska hela apparaten i 30 min. Alkoholplatskonditionering (dagarna 2–9): Träningen startade 24 timmar efter baslinjetestet med en session administreras per dag under 8 dagar, med skjutdörren stängd. På dagarna 3, 5, 7 och 9 fick mössen alkohol (1,8 g/kg, 20% v/v; ip) och instängdes omedelbart i det parade facket i 5 min.

Denna dos och konditioneringslängd har tidigare visat sig producera alkoholinducerad CPP [42, 85]. De omväxlande dagarna (dvs dag 2, 4, 6 och 8) fick mössen en saltlösning och var instängda i den oparade avdelningen under samma varaktighet som på alkoholkonditioneringsdagen.

Parade fack balanserades. Platspreferenstest 1 (dag 10): Platspreferenstestning var som beskrivits för baslinjetestet och tjänade till att indexera alkohol-CPP [41]. Preferens definierades som en ökning av den procentuella tiden som spenderades i det alkoholparade facket under platspreferenstest 1, jämfört med baslinjetestet.

Minnesåtervinning (dag 11): Före detta skede tilldelades mössen olika experimentella förhållanden (matchade för CPP-poäng och kön). Under en minneshämtningssession var mössen instängda i det alkoholparade facket i 3 minuter och återvände sedan till sina hemburar. Kontrollmöss hanterades kort. Platspreferenstest 2 (dag 12): Mössen utsattes för ett platspreferenstest identiskt med platspreferenstest 1.

Sackaros CPP: Sackaros förträning (dag 1–6): Dag 1–3 vande mössen att samla 5–6 sackarospellets (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA) i hemmaburar . Dag 4–6 tränades möss i att samla 3 pellets i en tom plexiglaslåda under 30-minuterspass. Möss som samlade färre än sex pellets (av totalt nio pellets under de 3 dagarna) under sackarosträning uteslöts från experimentet (2 möss av 32).

Baslinjetest (dag 7): På den sjunde dagen drogs skjutdörren i en CPP-kammare tillbaka och mössen fick utforska hela apparaten i 30 minuter. En opartisk apparat/opartisk tilldelningsmetod, som beskrivs i alkohol-CPP-proceduren, antogs också här. Sackaros platskonditionering (dagarna 8–15): Träning startade 24 timmar efter baslinjetestet med en session per dag under 8 dagar, med glidningen dörren stängd. På dagarna 9, 11, 13 och 15 placerades mössen i det parade facket, och en minut senare spreds tre sackarospellets på golvet.
Möss återfördes till sina hemburar 15 minuter senare. På de alternativa dagarna (dvs dag 8, 10, 12 och 14) placerades mössen i den oparade avdelningen under 15 minuter utan störningar.

Parade fack balanserades. Platspreferenstest 1 (dag 16): Platspreferenstestning var som beskrivits för baslinjetestet och tjänade till att indexera sackaros-CPP. Preferensen definierades som en ökning av den procentuella tiden som spenderades i det sackarosparade facket under platspreferenstest 1, jämfört med baslinjetestet. Minnesåterhämtning (dagar 17): Proceduren för sackarosminnesåtervinning var identisk med proceduren för återhämtning av alkoholminne (se ovan) ).

Validering av oligodeoxinukleotid (ODN).

Arc antisense ODN (AS-ODN) och scrambled ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) design följde de riktlinjer som beskrivits tidigare [56, 86].

Arc AS-ODN funktionsvalidering. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl, 0,25 µl/min) infunderades i DH i en halvklot, och SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}}.5 µl, 0.25 µl/min) infunderades i den andra halvklotet (sidorna var motbalanserade). Två eller fyra timmar senare undersökte behandlade möss ett okänt sammanhang (CPP-fack, se apparatbeskrivning ovan) i 5 minuter för att inducera nyhetsberoende ARC-uttryck. Möss avlivades en timme senare (dvs. 3 eller 5 timmar efter ODN-infusion), hjärnvävnad samlades in och ARC-proteinnivåer bedömdes med Western blotanalys (Figur S4).

Kirurgi och intra-hippocampal mikroinfusion Kirurgi och mikroinfusioner utfördes som beskrivits tidigare [42, 87].

Kirurgi. Stereotaxiska operationer utfördes under isofluranestesi. Möss placerades i en stereotaktisk ram (RWD Life Science, Shenzhen, Kina), och bilaterala styrkanyler (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) riktades mot DH vid följande koordinater (−2 mm posteriort till bregma, ±1,3 mm mediolateralt, −1,45 mm ventralt mot skallytan). Kanyler säkrades med dental akryl. Matchande dummycannulae (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) sattes in i guidekanylerna och toppades med dammkoppar för att hålla injektionsstället täckt och fritt från skräp. Mössen fick återhämta sig i 7–10 dagar före alkohol-CPP-träning.

Intra-hippocampala infusioner. Actinomycin D (4 µg/µl, 0,5 µl per sida,0,25 µl/min, i DMSO) [19] eller en motsvarande volym av vehikel mikroinjicerades i DH omedelbart efter minneshämtning . Infusion av aktinomycin D i hippocampus vid en liknande koncentration visade sig störa minneskonsolidering [19]. Arc AS-ODN eller kontroll SCR-ODN (2nmol/µl, 0,5 µl/sida, 0,25 µl/min; i PBS) mikroinjicerades i DH 4 timmar 2 timmar före eller 4 timmar efter minneshämtning.

Efter avlägsnande av dammkoppen och attrappkanylen genomfördes mikroinfusion under 2 minuter till vakna och återhållna möss med användning av injektionskanyler (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) som sträckte sig 0,5 mm utanför guiden kanylspets. Injektionskanyler lämnades på plats i ytterligare 2 min. Efter infusionen sattes dummykanyler in i styrkanylerna, säkrade med dammkoppen, och djuren återvände till sina hemburar. Kanyllokaliseringar verifierades i 30 μm tjocka koronala sektioner av paraformaldehydfixerad vävnad färgad med kresylviolett.

Dataanalys

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75 % av tiden i någon av avdelningarna under baslinjetestet exkluderades från studien (9 av 267). CPP-etablering bekräftades genom att jämföra CPP-poäng mellan baslinjen och CPP-test 1 och analyserades med ett parat t-test. Eftersom uttrycket av CPP (dvs. minnesbildning) krävs för minneshämtning uteslöts data från möss som inte visade CPP (minst 5 % ökning i preferens mellan baslinje och test 1) från experimentet (48 av 258).

Alkohol-CPP efter interferens med minnesrekonsolidering analyserades av en blandad modell ANOVA med en behandlingsfaktor mellan patienter (Actinomycin D eller ODN) och en inom försökspersoners faktor för test (CPP-test 1, CPP-test 2). Signifikanta interaktioner analyserades med aStudent-Newman-Keuls post hoc-test. Tätheterna för Western blotimmunoreaktivt ARC-proteinnivåer normaliserades till de GAPDH och analyserades med en enkelriktad ANOVA med en behandlingsfaktor mellan individer, följt av Dunnetts post hoc-test. qRT-PCR mRNA-expressionsdata normaliserades till Gapdh och uttrycktes som en procentandel av uttrycket av en kontrollgrupp.

Data från alla gener för varje hjärnregion analyserades med en enkelriktad ANOVA med en behandlingsfaktor mellan individer, följt av Dunnetts test för varje gen, för jämförelse med data som erhållits från en kontrollgrupp (Ingen hämtning). För RNA-sekv. vi slog samman vävnader från 3 djur för varje replikat och förberedde följande antal replikat: 3 för den dorsala hippocampus (DH) - ingen återhämtning, 2 för DH-återvinning, 3 för den prefrontala cortex (PFC) - ingen återhämtning och 2 för ( PFC)-hämtning. Efter total RNA-isolering med Trizol genererades sekvenseringsbibliotek med den metod vi utvecklade [88].

Biblioteken utsattes för 50 bp single-end-sekvensering med IlluminaHiseq 2000. Efter att ha bekräftat kvaliteten på sekvenseringsdata med FastQC, kartlades läsningar till mm9-referensgenomet med Bowtie2 [89] och kommenterades med Tophat2 [90].

Läsningar mappade till gener kvantifierades av FeatureCounts [91]. Vi uteslöt Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a och temitokondriella kromosomer för att undvika räkningar av överförstärkta gener som kan skeva biblioteksnormalisering som tidigare beskrivits [92]. DESeq2 [58] användes för att identifiera differentiellt uttryckta gener (DEG) i Retrievalgruppen, jämfört med No Retrieval-kontrollgruppen, med ett signifikanscutoff-justerat p-värde (p(adj) < 0.05).

DATA TILLGÄNGLIGHETRNA-seq-data finns tillgängliga på NCBI Gene Expression Omnibus på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) med en granskartoken: knyfwwiorbutvuv.

REFERENSER

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, et al. Stora utmaningar för den globala mentala hälsan. Natur. 2011;475:27–30.

2. Heilig M, Egli M. Farmakologisk behandling av alkoholberoende: målsymtom och målmekanismer. Pharmacol Therap. 2006;111:855–76.

3. Sinha R. Nya rön om biologiska faktorer som förutsäger sårbarhet för återfall av beroende. Curr Psychiatry Rep. 2011;13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Reaktivitet mot alkoholrelaterade stimuli i laboratoriet och på fältet: prediktorer för begär hos behandlade alkoholister. Beroende.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V, et al. Störning av alkoholrelaterade minnen av mTORC1-hämning förhindrar återfall. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Dryck, droger och störningar: minnesmanipulation för behandling av missbruk. Curr Opin Neurobiol. 2013;23:706–12.

7. Nader K, Hardt O. En enda standard för minne: fallet för rekonsolidering. NatRev Neurosci. 2009;10:224–34.

8. Dudai Y. Rekonsolidering: fördelen med att bli omfokuserad. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174–8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Återkonsolidering av minne efter återaktivering. Behav.Brain Res. 1997;84:241–6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Rädsla minnen kräver proteinsyntes i theamygdala för rekonsolidering efter hämtning. Natur. 2000;406:722–6.

For more information:1950477648nn@gmail.com