Alzheimers sjukdom associerad SNP Rs708727 i SLC41A1 kan öka risken för Parkinsons sjukdom: rapport från utökad slovakisk studie del 2

2.2. Genetiska analyser

De genetiska analyserna utfördes på A1 SNPs rs11240569, rs708727 och rs823156i kohorten av 508 PD-patienter (mot 150 patienter i pilotstudien) och kohorten av 472 kontroller (mot 120 kontroller) [37] kontroller i pilotstudien. Således ökade antalet PD-patienter och kontrollproband i denna studie med 3,4- respektive 3,9 gånger jämfört med pilotstudien.

Många upplever minnesförlust när de åldras, men för personer med Parkinsons sjukdom kan minnesförändringar vara mer uttalade. Men vi bör inte tänka på personer med Parkinsons sjukdom som skyldiga att lida av minnesförsämring, eftersom det finns saker vi kan göra för att hjälpa dem att behålla sitt minne.

För det första kan konsekvent göra vissa hjärnträningsaktiviteter hjälpa personer med Parkinsons sjukdom att förbättra sitt minne. Dessa aktiviteter kan inkludera: göra Sudoku, spela brädspel, lösa pussel och mer. Genom dessa aktiviteter kan de träna sitt minne, förbättra sin hjärnfunktion och hjälpa dem att behålla sitt mentala tillstånd.

För det andra har kosten också en mycket viktig inverkan på minnet hos patienter med Parkinsons sjukdom. I kosten kan vi lägga till vissa livsmedel rika på protein och näringsämnen, som fisk, bönor, nötter etc. Dessa livsmedel kan hjälpa oss att hålla oss friska och förbättra vårt minne.

Slutligen kan regelbunden motion också hjälpa personer med Parkinsons sjukdom att förbättra sitt minne. Träning hjälper oss inte bara att hålla oss friska fysiskt utan ännu viktigare, förbättrar vår hjärnfunktion. Genom regelbunden träning kan de öka sin hjärt- och lungfunktion, förbättra elasticiteten i sina muskler och ben och förbättra sitt minne.

Allt som allt beror om personer med Parkinsons sjukdom upplever minnesförsämring på deras livsstil och matvanor, samt om de uppmärksammar saker som hjärnträning och träning. Så länge vi uppmärksammar dessa aspekter tror jag att minnet hos patienter med Parkinsons sjukdom effektivt kan förbättras. Det kan ses att vi behöver förbättra vårt minne. Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt eftersom Cistanche deserticola är ett traditionellt kinesiskt läkemedelsmaterial med många unika effekter, varav en är att förbättra minnet. Effekten av malet kött kommer från en mängd olika aktiva ingredienser som det innehåller, inklusive karboxylsyra, polysackarider, flavonoider, etc. Dessa ingredienser kan främja hjärnans hälsa genom olika kanaler.

Klicka på vet sätt att förbättra hjärnans funktion

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) i vår totala kohort (PD-fall + kontrollprober), ungefär jämförbar med den mindre allelens totala population fq-intervall (MATPFR) som rapporterats av gnomAD- och ExAC-databaserna, enligt följande: fqo (observerad) vs. för (rapporterad) {{1 }}% ​​kontra 29-30%.

Den mindre allelen fq för rs708727 (G > A) i vår totala kohort var högre än MATPFR i gnomAD- och ExAC-databaserna (fq, vs. för=40% vs. 29-30%) men var jämförbar med den rs708727 mindre allelen fq som rapporterats för den europeiska befolkningen i ALFA-databasen (41%). Den rs823156 (A > G) minor allelen fq i vår totala kohort var 17 % och var således lägre än MATPFR i gnomAD- och ExAC-databaserna (23–30 %) men var jämförbar med den rs823156 minor allelen fq som rapporterades för den europeiska befolkningen i ALFA-databasen (18%).

Frekvensen av den mindre allelen av rs9438393 (A > G) i den totala kohorten var 40 % och var därför avsevärt högre än MATPFR på 26–29 % som rapporterades i gnomAD- och TOPMED-databaserna, men var jämförbar med rs9438393 minor. allelfrekvens rapporterad i ALFA-databasen för den europeiska befolkningen (41%). Den mindre allelen av rs56152218 (T > C) i den totala kohorten var närvarande med en fq på 38 %, vilket är inom MATPFR på 32–46 % rapporterat av databaserna ALSPAC, TOPMED och ALFA (European population).

Intressant nog är att i den vietnamesiska, koreanska och qatariska befolkningen är den mindre allelen T och inte C, vilket observerats i den europeiska befolkningen [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, tillgänglig den 2 augusti 2021)]. Fq för den mindre allelen i rs61822602 (G > T) visade sig vara 12 %. Detta är jämförbart med T-allelfrekvenserna som rapporterats av ALSPAC- och TWINSUK-databaserna (12 % respektive 13 %) men är mycket högre än fq för T-allelen som rapporterats i den europeiska populationen i ALFA-databasen (6 %).

Alla testade A1 SNPs i våra PD- och kontrollkohorter var i Hardy-Weinberg-jämvikt (HWE; Tabell 4).

Därefter beräknade vi oddskvoterna (OR) för den mindre allelen och genotyper som innehåller den mindre allelen för varje testad SNP. Dessa resultat sammanfattas i tabell 5. GA genotypen i rs708727 var associerad med PD (OR=1.42 (1.08–1.87), p=0.01) i vår population. Dessutom testade vi associeringen av särskilda genotypiska kombinationer för varje testad SNP med PD i recessiva, dominanta och helt överdominanta genetiska modeller (tabell 6). I enlighet med tidigare data identifierade vi en association av rs708727 minor allelen (A) med PD i dominanta (GG vs. GA + AA) och helt överdominanta (GG + AA vs. GA) genetiska modeller (ORD {{16} }.36 (1.05–1.77), p=0.02 respektive ORCOD=1.34 (1.04–1.72), p=0}.02). De återstående SNP:erna visade inget samband med PD i de testade genetiska modellerna (tabell 6).

Vi testade också jämlikheten mellan populationsproportioner för alla genotypiska kombinationer som består av dupletter, trillingar, fyrlingar, femlingar eller sextupletter av de testade SNP:erna i PD-kohorten (N {0}}) och kohorten av kontroller ( N=100) för att undersöka storleken på effekten av interaktionerna mellan de testade A1 SNP:erna mot känsligheten för att utveckla PD i vår befolkning. Sammanlagt 12 genotypkombinationer (två duplingar, sju trillingar och tre fyrlingar, tabell 7) med signifikant (p < 0.05, 10 genotyper; p < 0,06, två genotyper ) olika antal i PD- och kontrollkohorter identifierades (tabell 7). Enligt Cohens kriterier [39], som beskriver skillnaderna i proportioner, visade endast triplett GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) av de 12 genotyperna den "medelstora" storleksskillnaden definierad av Cohens h(2arcsin√ –2arcsin√ prp2) Större än eller lika med 0,5.

h-värdet för de återstående 11 genotyperna varierade mellan 0.32 och 0.46 och låg således inom h-intervallet från 0.2 till 0.5, vilket definierar små skillnader i proportioner (tabell 7) [39]. Därför kan triplett GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) vara kliniskt meningsfulla, och framtida undersökningar av denna genotyp om PD-känslighet bör utföras. För rs11240569, rs708727 och rs823156 utförde vi samma typ av analys med källdata från kohorten av 508 PD-patienter och kohorten av 472 kontroller. Fyra genotyper, två dupletter (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) och två trillingar (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + 232155rs19) + 232GG55rs19 + GG(rs708727) + AG(rs823156)), med signifikant (p < 0,05) olika antal i PD- och kontrollkohorter, identifierades. Cohens h beräknade för var och en av de fyra genotyperna låg under tröskeln på 0,2 [39], och således var skillnaden mellan populationsproportionerna mellan de testade grupperna, i alla fyra fallen, försumbar.

Åldrande, följt av det manliga könet, anses vara den mest framträdande riskfaktorn för uppkomsten av idiopatisk PD [37]. I vår pilotstudie korrelerades inte åldern för debut av idiopatisk PD i kohorten av 15 0 PD-patienter med närvaron av någon genotypisk kombination för SNP rs11240569, rs708727 och rs823156 [37]. Här har vi korrelerat åldern för debut av PD med (1) närvaron av varje genotypisk kombination för SNP rs11240569, rs708727 och rs823156 i gruppen av 508 PD-patienter (Figur 2) och (2) med närvaron av varje genotypkombination för SNP:er rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 och rs61822602, i subkohorten av PD-patienter, slumpmässigt utvalda från A1-koFirc-sekvensen (slumpmässigt vald från A1-koFirc-sekvensen). Ungefär vid debutåldern visade en enkelriktad ANOVA-analys att det inte fanns någon signifikant (p < 0,05) skillnad mellan de genotypiska subpopulationerna för var och en av de testade SNP i både den stora PD-kohorten och i subkohorten av PD patienter. Sålunda påverkar inte någon speciell genotyp i de testade SNP:erna åldern för debut av den idiopatiska formen av PD. Detta överensstämmer helt med slutsatsen i vår pilotstudie [37].

Vi har också utfört samma typ av analys för var och en av de testade SNP:erna i delpopulationer av kvinnor och män som härrörde från den stora kohorten (N=508) och subkohorten (N=96 ) av PD-patienter. Som visats i kompletterande figurer S1–S3, finns inget signifikant (p < 0.05) samband mellan debutåldern och närvaron av någon speciell genotypkombination i de testade SNP:erna rs11240569, rs708727, rs823156, rs94381563, 52rs och rs61822602 i de könsdelade undergrupperna härleddes antingen från den stora PD-kohorten (NM=306, NF=202) eller PD-underkohorten som valts för A1-promotorsekvensering (NM {{20} }, NF=42).

2.3. RandomForest Machine Learning (RF-ML)

Alla A1 SNP: er testades för deras förmåga att skilja mellan PD-patienter och kontroller med RF-ML. RF-ML-algoritmen tränades med hjälp av våra data, och den diskriminerande betydelsen av individuella SNPs av en teknisk konstruktion, känd som grafdjup, utvärderades [37,40]. Liksom i vår pilotstudie [37] visualiserades och kvantifierades den prediktiva förmågan hos de testade SNP:erna av ROC-kurvor (receiver operating characteristic) respektive AUC (area under ROC-kurva). Den särskiljande förmågan hos prediktorer ges inom intervallet för AUC från 100 % (maximal särskiljningsförmåga) ner till 50 % (minimal särskiljningsförmåga); AUC < 50 % motsvarar ingen särskiljningsförmåga.

RF-algoritmen tränades i följande lägen: (1) med tre eller sex (tabell 8) särskilda A1 SNP:er (varje SNP, tre genotyper (AMAM/AMAm/AmAm, där AM står för major allel och Am för minor allel), som en prediktor (tre eller sex RF-modeller, en för varje SNP), (2) med genotypiska dupletter av de parade SNP:erna som prediktorer (tre RF-modeller (tre SNP) eller 15 RF-modeller (sex SNP), en för varje par av SNP:er; Tabell 8), (3) med genotypiska tripletter av de tre SNP:er som prediktorer (en RF-modell (tre SNP) eller 20 RF-modeller (sex SNP), en för varje triplett av SNP:er; Tabell 8), (4) med genotypiska fyrlingar av de sex SNP:erna som prediktorer (15 RF-modeller, en för varje fyrling; Tabell 8), (5) med genotypiska femlingar av de sex SNP:erna som prediktorer (sex RF-modeller, en för varje kvintuplett; Tabell 8), och ( 6) med en genotypisk sextuplett (en RF-modell, tabell 8).

Sålunda, när singlar, dupletter, trillingar, fyrlingar, femlingar och sextupletten av A1 SNP användes som prediktorer, hade de ingen förmåga att skilja mellan PD-patienterna och kontrollerna (tabell 8). Därför, enligt RF-ML-analys, och i överensstämmelse med pilotstudien [37], har A1 SNP:erna ingen potential att tjäna som diskriminatorer mellan kontroller och PD-patienter och har, när det gäller PD, inget prediktivt eller diagnostiskt värde i den slovakiska befolkningen .

3. Diskussion

PARK16-lokuset har fått uppmärksamhet i det vetenskapliga samfundet på grund av dess koppling till PD och dess diskuterade roll i att definiera känsligheten för denna komplexa sjukdom. Under 2019 rapporterade vi en pilotstudie där vi analyserade sambandet mellan de tre A1 SNP, nämligen rs11240569, rs708727 och rs823156, med den idiopatiska formen av PD i den slovakiska (västslaviska) befolkningen. Det rapporterade sambandet mellan rs11240569 och rs823156 med mottaglighet för PD främst i asiatiska/orientaliska populationer hittades inte i vår studie [37]. Inget samband kunde bekräftas med hjälp av frekventistisk statistik (konservativa genetiska analyser) eller genom RF-ML-analys [37].

Den största begränsningen i vår pilotstudie var dock det relativt låga antalet patienter/probandes i PD- och kontrollkohorter (150 respektive 120). Vi betonade att uppgifterna ur statistisk synvinkel måste tolkas försiktigt på grund av den lilla urvalsstorleken i båda kohorterna och på grund av den låga statistiska styrkan hos de utförda analyserna [37]. Ändå, genom att använda ML-metoden, som kräver betydligt mindre urvalsstorlekar än konventionell frekventistisk statistik eller ungefärlig Bayesiansk beräkning, kunde vi med tillförsikt undersöka förmågan hos särskilda A1 SNP: er att skilja mellan PD-patienter och kontroller. I alla fall avslöjade ML-metoden i huvudsak noll diagnostisk och prediktiv relevans av SNP rs11240569, rs708727 och rs823156 i den slovakiska befolkningen [37].

I denna studie har vi undersökt inte bara de tre ovannämnda SNP:erna, utan också de tre SNP:erna (rs9438393, rs56152218 och rs61822602) lokaliserade inom promotorregionen av A1. Dessa SNP har identifierats genom sekvensering av 96 PD-prover följt av RFLP-analys av kontrollproverna och RFLP-verifiering av de sekvenserade PD-proverna. Våra genetiska analyser har i princip inte visat något samband mellan någon av de tre nyligen studerade SNP med PD. Detsamma gäller för rs11240569 och rs823156, som har analyserats i PD- och kontrollsubkohorterna (96/100) och även i kohorterna av 508 PD-patienter och 472 kontroller. Dessa resultat överensstämmer helt med resultatet av pilotstudien [37]. Men i de stora kohorterna är rs708727 associerat med en ökad risk för PD i den slovakiska befolkningen.

Såvitt vi vet har ingen studie ännu direkt associerat A1 SNP rs708727 med en förändrad risk för att utveckla PD [19,37]. I vår förstorade studie (jämfört med pilotstudien [37]) är den mindre allelen A i rs708727 associerad med en ökad risk för PD-debut när den testas i dominant [40] (ORD=1.36 (1.05– 1.77), p=0.02) eller helt överdominanta [41] (ORCOD=1.34 (1.04–1.72), p=0.02) modeller (tabell 5). Således kan närvaron av den mindre allelen (A) i rs708727 vara associerad med en ökad risk att utveckla PD. Medan Sanchez-Mut et al. [27] och Wang et al. [42] har tydligt visat att närvaron av den mindre allelen A i rs708727 förändrar metyleringen av PM20D1-promotom (och därmed dess uttryck) på ett dosberoende (kvantitativt) sätt, de bäst passande genetiska modellerna i vår studie indikerar att närvaron av en rs708727 A-allel är tillräcklig för att ändra känsligheten för uppkomsten av PD. PD-känslighet (fenotyp), om huruvida en eller två kopior av den mindre allelen finns i rs708727 (genotyp), återstår att belysa ytterligare i detalj.
Sanchez-Mut et al. har identifierat PM20D1 (lokaliserat inom PARK16-lokuset och kodar för peptidas M20--domänen innehållande protein ett enzym med både hydrolas- och peptidasaktiviteter; N-fettacylaminosyrasyntas/hydrolas) som en kvantitativ egenskap för metylering och uttryck locus (mQTL) kopplat till en AD-riskassocierad haplotyp, som visar förstärkarliknande egenskaper och kontaktar PM20D1-promotom via en haplotypberoende, CTCF (CCCTC-bindande) transkriptionsfaktormedierad kromatinloop [27]. Genom att jämföra prover från friska kontroller och patienter med avancerad AD, har de funnit att PM20D1 konsekvent visar promotorhypermetylering hos patienter med AD [27]. A1 SNP rs708727 korrelerar med nivåerna av PM20D1 DNA-metylering i den mänskliga frontala cortex och hippocampus [27], liksom SNP rs960603 [27]. Wang och kollegor, i sitt arbete med perifert blod, har skaffat data som bekräftar att PM20D1 är en mQTL medierad främst av den AD-riskassocierade A1 SNP rs708727 [42].

Dessutom visar deras longitudinella data att hypometylering inträffar före den symtomatiska början av AD, möjligen för att underlätta det ökande uttrycket av PM20D1 för att aktivera dess skyddande funktion [42]. AD-framsteg kännetecknas av en ökande nivå av metylering i CpG-öarna i DMR (differentiellt metylerad region) av PM20D1-promotorn hos AD-patienter, vilket i slutändan leder till hämning av gentranskription och uttryck [27,42,43]. PM20D1 har också associerats med diabetes [44], fetma [45] och multipel skleros [46], och eftersom det är lokaliserat inom PARK16-lokuset antas dess möjliga inblandning/association med PD [47].

Trots bristen på molekylärmekanistiska analyser spekulerar vi, i ljuset av våra nuvarande data, att AD och PD (och andra mindre frekventa neurodegenerativa sjukdomar) inte bara delar "välkända" patofysiologiska mekanismer (t.ex. störd mitofagi, retromer och proteasom). funktioner), men också epigenetiska mekanismer, såsom A1 rs708727-beroende reglering av PM20D1-uttryck [27,42]. Vårt arbete bidrar indirekt till behovet av en detaljerad belysning av rollen för endogena N-acylaminosyror (NAA) som metaboliseras av PM20D1 i patobiologin för PD och andra neurodegenerativa störningar. NAAs och N-acylkonjugat av neurotransmittorer (NAANs) är nu kända för att spela en viktig roll i neuromodulering [48,49]. Bevis som länkar PM20D1-uttryck med N-acyldopamin (NADA) har tillhandahållits av det senaste arbetet av Song et al. Dessa författare har visat att deletionen av kir6.2 (en porbildande subenhet av de ATP-känsliga K+-kanalerna) leder till ett minskat antal mitokondrier och sänkt ATP-produktion via en ökning av nivåerna av PM20D1 och av medel som kopplar bort mitokondriell andning , inklusive NADA, i den murina mellanhjärnan [49].

NADA är en potent hämmare av 5-lipoxygenas (5-LOX) och har en fördelning begränsad till hjärnan med nivåerna som är de högsta i striatum och mycket låga på andra ställen [48,50,51]. 5-LOX katalyserar syntesen av leukotrien eller 5-HpETE (5-hydroperoxieikosatetraensyra) från arakidonsyra och har associerats med neurodegeneration (AD och PD) via dess inblandning i neuroinflammation [51, 52]. Vi föreslår därför att det minskade PM20D1-uttrycket, det efterföljande lägre förekomsten av NADA och den ökade aktiviteten av 5-LOX avsevärt bidrar till patologin för PD (och andra neurodegenerativa sjukdomar).

Sanchez-Mut och medarbetare har visat att överuttrycket av PM20D1 i den murina AD hippocampus resulterar i inlärningsförbättring, medan dess nedbrytning ökar amyloidplackbelastningen [27]. Både Lewy-typ och Alzheimer-typ patologier är viktiga vid PD-relaterad demens [53]. En betydande pool av PD-patienter lider av förvärrad demens under sjukdomen [54]. Med hänsyn till dessa observationer spekulerar vi i huruvida den rs708727-länkade aktiviteten som tystar PM20D1 bidrar till debuten av PD-demens och om övervakningen av PM20D1-aktiviteten kan fungera som en prognostisk parameter för uppkomsten av PD-demens.

Tidigare publicerade arbeten har föreslagit inblandning av Mg2+-transportörer i patobiologin av PD [18–22,55]. A1, som är nyckelspelaren i Mg-homeostasen av somatiska celler, har kopplats till PD direkt [20-22]. Punktmutationer i A1 som leder till substitutioner p.A350V, p.R244H och p.R285Q har förmodat associerats med PD, och både bristen på funktion och förlusten av funktionsmutationer i A1 antas ha skadliga konsekvenser i neuroner, och därigenom bidrar till PD-fenotypen [20–22]. Detta arbete pekar indirekt på en möjlighet att inte bara störningar av A1-kärnfunktion (Na+/Mg2+-utbyte) utan även A1-länkad (rs708727) epigenetisk reglering av PM20D1-uttryck (och aktivitet), bidrar till PD:s patobiologi.

I denna studie har vi identifierat genotypisk triplett GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) som potentiellt kliniskt meningsfulla (h Större än eller lika med 0,5). Intressant nog är rs708727 med genotyp GG en del av tripletten. Men mot bakgrund av tidigare forskning skulle genotypen som innehåller den mindre allelen A i rs708727 förväntas vara kopplad till en potentiell PD-risk förknippad med denna triplett. För närvarande kan vi inte kommentera några molekylära/genetiska/epigenetiska interaktioner som involverar SNP i tripletten GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602), och därmed om eventuella förmodade bidrag från denna triplett till en summa av risken för PD-debut.

I vår pilotstudie använde vi RF-ML för att utvärdera och tolka våra data [37]. Den stora fördelen med RF-ML-dataanalys är tvåfaldig, enligt följande: (1) den tillåter att SNP:s särskiljningsförmåga mellan PD-patienter och kontroller kan kvantifieras [37], och (2) den kräver lägre provstorlekar för utvärdering av den diskriminerande betydelsen av individuella SNP eller deras kombinationer [37]. Dessutom går RF-ML förbi p-värdesproblemet som ofta förknippas med större prover, även när de är tillgängliga [56]. Som i vår tidigare rapport har ingen av de testade A1 SNP:erna visat sig ha makten att skilja mellan PD-patienter och icke-PD-probandes i vår kohort (tabell 8). Således kan vi anta att ingen av de testade A1 SNP:erna är lämpliga för att fungera som en PD/icke-PD-diskriminator i den slovakiska befolkningen.

När det gäller associeringen av A1 rs708727 med förändrad risk för PD, verkar resultatet av vår RF-ML-analys vid första anblicken vara motsägelsefullt (tabell 5 och 6 jämfört med tabell 8). Jakobsdottir et al. i sin logistiska regressions- och ROC-kurvanalys visade att även starka genetiska associationer inte automatiskt garanterar effektiv diskriminering mellan fall och kontroller [57]. Trots att de är dåliga klassificerare kan SNP med signifikant OR vara mycket värdefulla för att fastställa etiologiska hypoteser [57]. I vårt fall har A1 SNP rs708727 ingen klassificeringsförmåga när det gäller PD, så det har ingen klinisk betydelse. Men dess svaga, men signifikanta samband med den förändrade risken för PD tillät oss att spekulera om involveringen av rs708727 i patobiologin för PD på ett liknande eller samma sätt som det är involverat i AD [27].

4. Material och metoder

4.1. Studiedeltagare (grundläggande egenskaper)

Totalt inkluderades 980 proband i studien (508 PD-patienter och 472 kontroller, som uppfyller inkluderande kriterier). Den idiopatiska formen av PD diagnostiserades av neurologer i fem PD-diagnostiska centra (i Martin, Bratislava, Trencin, Zvolen och Kosice) enligt PD-diagnoskriterierna för MDS (Movement Disorder Society). Alla patienter behandlades med standard anti-PD-terapi. Medelåldern för PD-patienterna var 68,4 ± 9,6 år. Medelåldern för sjukdomsdebut var 61,7 ± 10,7 år. Det yngsta fallet diagnostiserades vid 34 års ålder och det äldsta fallet vid 89 år. PD-gruppen bestod av 202 kvinnliga (F) och 306 manliga (M) patienter, och således var F:M-förhållandet 1:1,5.

Kontrollkohorten av proband bestod av utåtgående och inåtgående patienter från kliniken för arbetsmedicin och toxikologi (Universitetssjukhuset Martin (UHM)) och Neurologiska kliniken (UHM). Endast de patienter som inte tidigare hade diagnostiserats med någon neurodegenerativ och neuropsykiatrisk sjukdom, såsom diabetes mellitus eller osteoporos (alla sjukdomar som förmodas förknippas med förändrat A1-uttryck och avreglering av A1-funktion), inkluderades i kontrollgruppen. Medelåldern för kontrollproberna var 68,3 ± 11,6 år. Kontrollgruppen bestod av 208 kvinnliga och 264 manliga individer, och således var F:M-förhållandet 1:1,3 i kontrollgruppen.

Subkohorten av PD-patienter, i vilken A1-promotorregionen sekvenserades, bestod av 96 slumpmässigt utvalda försökspersoner. F:M-förhållandet var 1:1,3 (42 kvinnor och 54 män). Medelåldern för patienterna i PD-subkohorten var 67.{{10}} ± 9,5 år. Kontrollsubkohorten bestod av 41 kvinnor och 59 män, så F:M-förhållandet var 1:1,4. Medelåldern för probands i kontrollsubkohorten var 59,8 ± 5,0 år.

Denna studie godkändes av den etiska kommittén vid Jessenius medicinska fakultet, Comenius University (JFM CU). Godkännande antecknades under ID: EK 66/2019. Alla studiedeltagare undertecknade formulär för informerat samtycke.

4.2. Provbearbetning

Blodprover samlades in i EDTA-behandlade BD Vacutainer®-rör (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA). Genomiskt DNA isolerades från färska (UHM) eller frysta blodprover (andra PD-centra) med hjälp av Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Maddison, WI, USA) enligt tillverkarens protokoll. Isolerade DNA-prover lagrades vid -80 ◦C.

4.3. Genotypning

Genotypning utfördes på 358 PD-prover och 352 kontrollprover. Resultat från dessa experiment analyserades tillsammans med de resultat som tidigare rapporterats av Cibulka et al. [37]. SNP:erna rs11240569, rs708727 och rs823156 analyserades med TaqMan® genotypningsprober C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 och C_9238453_10/rscientific, The708, Fisherham, Fisherham, MA USA) på samma sätt som rapporterats tidigare [37].

4.4. Sanger Sequencing

Promotorregionen delades upp i fyra överlappande fragment/amplikoner, eftersom den var för lång för en enda sekvenseringskörning. Innan de sekvenserades amplifierades målregionerna. Primers designades med hjälp av onlineverktyget Primer3Plus [https:// primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (tillträde den 3 maj 2018)]. Varje par primrar kontrollerades med avseende på närvaron av flera amplifieringsprodukter av PCR-onlineverktyget UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (tillgänglig den 3 maj 2018)].

Primers och PCR-program som används för amplifiering av de fyra fragmenten är sammanfattade i kompletterande tabeller S1 och S2. Sammansättningar av masterblandningar för varje fragment sammanfattas i SA3. Fragment 3 och 4 har en hög halt av G- och C-nukleotider (67,4 % respektive 71,9 %). Reaktionsutbytet ökades genom tillsats av 10x GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Estland). PCR-produkten renades genom att använda NucleoSpinTM Gel och ett PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Tyskland). I nästa steg späddes den renade PCR-produkten till en lämplig koncentration för försekvensering av PCR (SA4, SA5). Endast framåtriktade (fw) primrar användes i försekvenserings-PCR. Reaktionsblandningen inkluderade även BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) och dideoxinukleotider.

Som ett resultat erhöll vi en blandning av produkter av olika storlekar som avslutades med fluorescensmärkta dideoxinukleotider. Produkterna renades därefter genom att använda SigmaSpin Sequencing Reaction Clean-Up-kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) enligt tillverkarens protokoll. En volym på 3 µL renad produkt överfördes till en 96-brunnsplatta tillsammans med 12 µL avjoniserad formamid av hög kvalitet (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Blandningen denaturerades under 5 minuter vid 95 ◦C i en termocykler. Fragment separerades på den 8-mikrokapillära enheten ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Sekvenser exporterades och visualiserades av Chromas programvara (Technelysium Pty Ltd., South Brisbane, Australien). FASTA-filer laddades upp till BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) och anpassades till det mänskliga referensgenomet (version GRCh38.p12).

Förutsägelse av transkriptionsfaktorbindningsställen och deras förändringar utfördes av onlineverktyget ConSite [tillgängligt på: http://consite.genereg.net/ (tillgänglig den 3 september 2020)] [38]. Sekvenser med den stora allelen och den mindre allelen laddades upp och spektra för transkriptionsfaktorerna (TF) genererades. Analysen kördes utan förinställd minimispecificitet. Förändringar i TF-bindande profiler baserade på närvaron av varianter sammanfattas i tabell 2.

4.5. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) analys

Reaktionsblandningskomponenterna och PCR-betingelserna för den amplifierade PCR:n är sammanfattade i SA6 och SA7. Online-in silico-verktyget NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (tillgängligt den 14 februari 2020)] användes för att designa begränsningar för amplikonerna. Följande restriktionsenzymer valdes för RFLP-analys: Hpy166II (detektion av rs9438393), NIaIII (detektion av rs56152218) och BmrI (detektion av rs61822602). Alla enzymer köptes från New England Biolabs. För variant rs144056491 kunde vi inte designa ett RFLP-experiment, eftersom inget lämpligt enzym fanns tillgängligt. Efter restriktion förväntade vi oss att fragmenten sammanfattade i SA8 skulle bilda utbytet. Efter restriktion separerades produkterna genom agarosgelelektrofores (NIaIII och Hpy166II 1% gel; BmrI 2% gel) och visualiserades sedan på ett PharosFX-instrument (Bio-Rad Laboratories). Genotyper för varje SNV bestämdes.

4.6. Dataanalys

Data undersöktes och analyserades med hjälp av R [R Core Team (2021); R: ett språk och en miljö för statistisk beräkning. R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österrike. URL https://www.R-project.org/, ver. 4.0.5 (2021-03-31)]. En genetisk associationsstudie (GAS) och effektanalys utfördes med användning av R-bibliotek HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Utforska Diallelic Genetic Markers: The HardyWeinberg Package. Journal of Statistical Software, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: Verktyg för beskrivande statistik. R-paketversion 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Epidemiology Tools. R-paketversion 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: Grundläggande funktioner för effektanalys. R-paketversion 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] och en egenutvecklad kod. RandomForest prediktiv modellering utfördes med R-biblioteket randomForestSRC [Ishwaran H. och Kogalur UB (2021); Fast Unified RandomForests for Survival, Regression, and Classification (RF-SRC), R-paketversion 2.11.0.]. Data visualiserades av R-bibliotekets beeswarm [Aron Eklund (2021); beeswarm: The Bee Swarm Plot, ett alternativ till Stripchart. R-paketversion 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Envägs-ANOVA användes för att testa nollhypotesen om jämlikhet för befolkningens medelålder för debut för de tre genotypsubpopulationerna för varje SNP. Fynd med ett p-värde under 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.

5. Slutsatser

Sammanfattningsvis tyder våra data på en svag men signifikant association av A1 SNP rs708727 med PD i dominanta och överdominanta genetiska modeller i en slovakisk befolkning. Ingen av de andra testade A1 SNP:erna (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 och rs61822602) var associerade med sjukdomen i någon av de testade genetiska modellerna. RF-ML-analyser identifierade alla testade A1 SNPs som dåliga klassificerare/prediktorer för PD, så deras användning i klinisk praxis som diagnostiska eller prognostiska markörer förblir försumbar. Associationen av rs708727 med PD gjorde det dock möjligt för oss att spekulera i att PD-riskassocierad mindre allel (G > A) i rs708727 bidrar till sjukdomsdebut och progression via störningen av epigenetisk reglering av PM20D1-uttryck, mekanismen som är känd för att spela en roll i patobiologi av AD. Denna hypotes bör undersökas ytterligare för att göra ett avgörande uttalande. Vidare bör ett möjligt samband mellan PD-associerad demens och rs708727 belysas.

Författarbidrag:

Konceptualisering, MK; metodik, MK, MC, MG (Marian Grendar) och MB; programvara, MG (Marian Grendar); validering, MC, MB och MK; formell analys, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS och MG (Milan Grofik); utredning, MC och MB; datakurering, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN och EK; skrift—original utkast beredning, MK; skrivande—recension och redigering, MC, MG (Marian Grendar) och ZP; visualisering, MK, MC och MG (Marian Grendar); tillsyn, MK; projektadministration, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS och BV; finansieringsförvärv, MK Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering:

Detta arbete stöddes av Slovakiska forsknings- och utvecklingsbyrån, anslagsnummer APVV-19-0222, och Scientific Grant Agency vid Slovakiens ministerium för utbildning, vetenskap, forskning och idrott och Slovakiska vetenskapsakademin, anslagsnummer VEGA 1/0554/19, båda till MK

Uttalande från institutionell granskningsnämnd:

Studien godkändes av den etiska kommittén vid Jessenius medicinska fakultet, Comenius University (JFM CU). Godkännandet antecknades under ID: EK 66/2019.

Informerat samtycke:

Informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner som var involverade i studien.

Datatillgänglighetsförklaring:

Den fullständiga datamängden finns i artikeln. Arten och omfattningen av de inkluderade data möjliggör ytterligare metaanalys. All information om studien är tillgänglig på begäran från motsvarande författare.

Erkännanden:

Vi tackar alla studiedeltagare och deras familjemedlemmar. Vi tackar också Martin Marak (JFM CU) för hans kompetenta tekniska stöd för projektet, till Jan Radvanszky och Rastislav Hekel (båda GENETON sro) för användbara råd om A1-promotoranalyser och till Theresa Jones för språkredigering av manuskript.

Intressekonflikt:

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Referenser

1. Tatarkova, Z.; de Baaij, JHF; Grendar, M.; Aschenbach, JR; Racay, P.; Bos, C.; Sponder, G.; Hoenderop, JGJ; Röntgen, M.; Turcanova Koprusakova, M.; et al. Dietary Mg2+ Intake and the Na+/Mg2+ Exchanger SLC41A1 Influence Components of Mitokondrial Energetics in Murina Cardiomyocytes. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Yamanaka, R.; Tabata, S.; Shindo, Y.; Hotta, K.; Suzuki, K.; Soga, T.; Oka, K. Mitochondrial Mg2+ homeostas avgör cellulär energimetabolism och sårbarhet för stress. Sci. Rep. 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Dudev, T.; Grauffel, C.; Lim, C. Hur infödda och främmande metallkatjoner binder ATP: Implikationer för litium som terapeutiskt medel. Sci. Rep. 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Kolisek, M.; Zsurka, G.; Samaj, J.; Weghuber, J.; Schweyen, RJ; Schweigel, M. Mrs2p är en viktig komponent i det stora elektroforetiska Mg2+-inflödessystemet i mitokondrier. EMBO J. 2003, 22, 1235–1244. [CrossRef] [PubMed]

5. Schindl, R.; Weghuber, J.; Romanin, C.; Schweyen, RJ Mrs2p bildar en högkonduktans Mg2+ selektiv kanal i mitokondrier. Biophys. J. 2007, 93, 3872–3883. [CrossRef] [PubMed]

6. Kolisek, M.; Sponder, G.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Tatarkova, Z.; Werner, T.; Racay, P. Magnesium Extravaganza: A Critical Compendium of Current Research into Cellular Mg2+ Transporters Other than TRPM6/7. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2019, 176, 65–105. [CrossRef]

7. Kubota, T.; Shindo, Y.; Tokuno, K.; Komatsu, H.; Ogawa, H.; Kudo, S.; Kitamura, Y.; Suzuki, K.; Oka, K. Mitokondrier är intracellulära magnesiumförråd: Undersökning genom samtidig fluorescerande avbildning i PC12-celler. Biochim. Biophys. Acta 2005, 1744, 19–28. [CrossRef]

8. Sponder, G.; Abdulhanan, N.; Fröhlich, N.; Mastrototaro, L.; Aschenbach, JR; Röntgen, M.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Racay, P.; Kolisek, M. Överuttryck av Na+/Mg2+-växlare SLC41A1 dämpar pro-överlevnadssignalering. Oncotarget 2017, 9, 5084–5104. [CrossRef] [PubMed]

9. Yamaguchi, H.; Wang, HG Proteinkinaset PKB/Akt reglerar cellöverlevnad och apoptos genom att hämma Bax konformationsförändring. Oncogene 2001, 20, 7779–7786. [CrossRef]

10. Vauzour, D.; Vafeiadou, K.; Rice-Evans, C.; Williams, RJ; Spencer, JP Aktivering av pro-survival Akt och ERK1/2 signalvägar ligger till grund för de anti-apoptotiska effekterna av flavanoner i kortikala neuroner. J. Neurochem. 2007, 103, 1355–1367. [CrossRef]

11. Muddapu, VR; Dharshini, SAP; Chakravarthy, VS; Gromiha, MM Neurodegenerativa sjukdomar - är metabolisk brist grundorsaken? Främre. Neurosci. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Pathak, D.; Berthet, A.; Nakamura, K. Energifel: Bidrar det till neurodegeneration? Ann. Neurol. 2013, 74, 506–516. [CrossRef] [PubMed]

13. Dharshini, SAP; Taguchi, YH; Gromiha, MM Undersöker energikrisen i Alzheimers sjukdom med hjälp av transkriptomstudie. Sci. Rep. 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Kvist, G.; Shirihai, OS Samspelet mellan mitokondriell dynamik och mitofagi. Antioxid. Redoxsignal. 2011, 14, 1939–1951. [CrossRef] [PubMed]

15. Zhao, W.; Zhang, W.; Ma, H.; Yang, M. NIPA2 reglerar osteoblastfunktionen genom att modulera mitofagi vid typ 2-diabetes osteoporos. Sci. Rep. 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Nadler, MJ; Hermosura, MC; Inabe, K.; Perraud, AL; Zhu, Q.; Stokes, AJ; Kurosaki, T.; Kinet, JP; Penner, R.; Scharenberg, AM; et al. LTRPC7 är en Mg. ATP-reglerad divalent katjonkanal som krävs för cellviabilitet. Nature 2001, 411, 590–595. [CrossRef]

17. Kolisek, M.; Nestler, A.; Vormann, J.; Schweigel-Röntgen, M. Human gen SLC41A1 kodar för Na+/Mg2+-växlaren. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2012, 302, C318–C326. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com