En medfödd patogenavkänningsstrategi som involverar ubiquitinering av bakteriella ytproteiner del 2

DISKUSSION

Metazoer använder ubiquitination som en mångsidig mekanism för att upprätthålla cytosolisk homeostas, förhindra ackumulering av skadade proteiner/organeller och försvara sig mot invaderande patogener (40, 41). Med tanke på mångfalden av patogener och olika uppsättningar av skadade proteiner som man stöter på, representerar identifieringen av gemensamma motiv för substratigenkänning och efterföljande ubiquitinering en smart strategi för resursoptimering. Proteiner i eukaryota celler som är avsedda för proteolys identifieras vanligtvis av ett tredelat degron-motiv (24).

Immunitet är kroppens förmåga att bekämpa sjukdomar, inklusive reaktioner på bakterier, virus och andra skadliga ämnen. Om kroppens immunförsvar äventyras kommer det inte att vara tillräckligt starkt för att hantera sjukdomens angrepp. Studier har visat att undernäring har en inverkan på immunsystemets funktion, vilket gör kroppen mer mottaglig för infektioner och sjukdomar. Protein är ett av de viktiga ämnena för att upprätthålla immunitet.

Proteiner är gjorda av aminosyror, av vilka några kallas essentiella aminosyror eftersom de måste tillhandahållas av maten och inte kan syntetiseras av kroppen. Dessa essentiella aminosyror inkluderar tryptofan, leucin, fenylalanin, lysin, isoleucin, metionin, valin och histidin. Om kroppen inte får i sig tillräckligt med essentiella aminosyror kan det leda till försämrad proteinomsättning, vilket kan påverka immunförsvarets funktion.

Dessutom bidrar ett högkvalitativt proteinintag till att upprätthålla ett normalt immunförsvar och kroppsfunktioner. När kroppen saknar protein kan det leda till ett nedsatt immunförsvar och kroppen är mer mottaglig för sjukdomar. Om människokroppen saknar protein under en längre tid kan det orsaka långvariga skador på immunsystemet, vilket gör människor mottagliga för olika sjukdomar.

Därför är en balanserad kost och rätt träning nyckeln till att upprätthålla proteinintaget. Människor kan tillgodose kroppens proteinbehov genom att äta mer proteinrik mat som kött, fågel, fisk, bönor, ägg, mejeriprodukter, spannmål, nötter och frön. Dessutom kan måttlig träning också öka kroppens krav på protein och absorptionseffektivitet. En balanserad och varierad kost och en hälsosam livsstil är nycklarna till att upprätthålla immunitet, hålla kroppen frisk och stabil och motstå invasion av sjukdomar. Ur denna synvinkel måste vi förbättra vår immunitet. Cistanche kan avsevärt förbättra immuniteten eftersom polysackariderna i kött kan reglera immunsvaret hos det mänskliga immunsystemet, förbättra immuncellers stressförmåga och förbättra immuncellernas immunitet. Baktericid effekt.

Klicka cistanche deserticola tillägg

Detta fick oss att undersöka om liknande motiv kunde hittas på patogenytor, där de kan fungera som en proxy för substratigenkänning. Här visar vi att värd ubiquitinligaser använder liknande molekylära signaturer för att känna av fylogenetiskt distinkta patogener. Patogenigenkänning via vanliga molekylära mönster/motiv (PAMP) är ett välkarakteriserat kännetecken för medfödd immunitet (42). Våra resultat tyder på att degronliknande sekvenser inom bakteriella ytproteiner verkar på ett sätt som motsvarar PAMPs, för att ge intracellulär patogenövervakning. Denna modus operand skulle kunna utnyttjas ytterligare av värden för presentation av mikrobiella proteinantigener på huvudhistokompatibilitetskomplex I för att inducera ett starkt CD8-svar riktat mot intracellulära patogener.

Den potentiella betydelsen av ubiquitin-medierad detektion av patogener för värdförsvaret framhävs ytterligare av den betydande återstående ubiquitinering som detekteras i mutant SPN som saknar både BgaA och PspA. Detta indikerar att det finns ytterligare, oidentifierade substrat för ubiquitinmaskineriet, med den resulterande redundansen som säkerställer robust patogenavlyssning. Noterbart är att några omedelbara frågor om degron-motivet och dess betydelse för bakterierna (förutom att vara en igenkännbar enhet) ger en intressant evolutionär vinkel.

Degronmotivet är dispenserbart in vivo, och om något, mutation eller borttagning av motivet förbättrade intracellulär uthållighet vilket resulterade i ökad virulens. Detta underbyggs av våra resultat att mutation i degron-motivet skulle kunna användas av patogener för att undkomma ubiquitin-medierad igenkänning som ses för SPN serotyp 19F. Emellertid kan den konserverade naturen hos degron-motivet i BgaA över majoriteten av SPN-serotyperna tyda på en motstrategi som antagits av bakterier för att vara mindre dödlig för värden.

Detta skulle kunna ge en möjlighet för patogenen att öka sina ockuperade livsmiljöer. Samtidigt kan ubiquitinering av bakterieytan eller utsöndrade proteiner vid degron-motivet modulera dem funktionellt för att dämpa eller koppla om värdsvaret för eventuell nytta (43). Därför kan närvaron eller frånvaron av eukaryotliknande funktionella domäner eller motiv (såsom degroner) vara beroende av en patogen nisch och anpassad för att undvika eller modulera värdens immunsvar.

En liknande patogenavkänningsmekanism som involverar guanylatbindande proteiner har också varit inblandad i bakteriell clearance; dock, till skillnad från ubiquitination, rapporteras deras roll vara begränsad till gramnegativa patogener (44–47). Ubiquitination riktar sig mot patogenen oavsett Gram-ursprung, till exempel har RNF213 dokumenterats rikta sig mot Listeria spp. oberoende av frånvaron av LPS (48). Vi eliminerar därför inte möjligheten av dess antimikrobiella verkan mot SPN också.

En patogen yta kan ubiquitineras med flera kedjetyper av olika E3-ligaser med interkedjeinteraktioner (41). Speciellt när det gäller Mtb, har Smurf1 och Parkin visat sig bilda K48- och K63-kedjetyper som fungerar synergistiskt för att bryta ned patogenen (12). Att förstå den mekanistiska rollen av K48 ubiquitination och E3-ligaserna involverade under infektionsscenarier är fortfarande understuderad. I fallet med STm har ett enda E3-ligas ARIH1 avbildats för att rikta in sig på cytosolisk STm med K48 ubiquitin-kedjor som leder till att de elimineras från systemet (15). Baserat på våra och andras upptäckter bryts K48-Ub-märkta patogener till sist ned samtidigt som de förknippas med proteasomala maskiner.

Den här studien visar dock K48-Ub-dekoration av specifika bakteriella ytproteiner. Vissa patogener är kända för att aktivt modifiera sina ytproteiner, skydda dem från ubiquitination och efterföljande dödande, vilket understryker betydelsen av ytlokalisering av ubiquitinsubstratet (10). Dessutom har flera obligata intracellulära patogener utvecklat strategier för att de-ubiquitinera sig själva, eller värdreglerande komponenter, för att undvika ubiquitin-medierad clearance (5). Tillsammans understryker dessa fynd vikten av ubiquitin-medierad larmupphetsning som en grundläggande intracellulär patogenavkänningsmekanism som är central för värdens försvar.

Vår studie visade vidare den centrala rollen för SCF E3-ligas, särskilt med FBXW7, i bakteriell ubiquitination som förstärker patogennedbrytning. Heterozygota mutationer i FBXW7, särskilt R505C (en kritisk rest i substratigenkänningsfickan), utlöser multipla karcinom och lymfatisk leukemi hos människor (49, 50). En nyligen genomförd kohortbaserad studie visade att nästan 43 procent av patienterna med kronisk lymfatisk leukemi (KLL) ger efter för bakteriell lunginflammation och sepsis, följt av svampinfektioner (51).

Detta bekräftar vår observation av den upphävda förmågan hos värdceller som bär FBXW7-mutation att känna av och eliminera patogener. Våra fynd ger därför en oväntad molekylär förklaring av den ökade risken för infektioner hos patienter med KLL. Kopplingen mellan genetisk polymorfism i E3-ligasgener och mottaglighet för bakteriella infektioner bekräftas också av patienter med Parkinsons sjukdom, som är sårbara för tyfoidfeber eller spetälska (14), vilket tyder på det anmärkningsvärda bidraget från E3-ligaser i värdens immunitet mot bakteriella infektioner och underhåll. av cellulärt steady state.

Sammanfattningsvis dechiffrerade vi ett universellt språk för att känna av cytosol-boende patogener som effektivt kunde tillämpas av värden för att känna igen mikroorganismer för efterföljande eliminering. Tillsammans kastar dessa fynd ljus över förståelsen av de rudimentära cellulära immunprocesserna, som kan utnyttjas för att intensifiera antibakteriell immunitet.

MATERIAL OCH METODER

Cell kultur

Både den humana lungalveolära karcinom (typ II pneumocyt) cellinjen A549 [American Type Culture Collection (ATCC) nr. CCL185)] och den cervikala adenocarcinomcellinjen HeLa (ATCC nr. CRM-CCL-2) odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM; HiMedia) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (Gibco) vid 37 grader och 5 procent CO2.

Bakteriestammar och tillväxtförhållanden

SPN (R6, serotyp 2, gåva från Tim J. Mitchell, University of Birmingham, Storbritannien) odlades i Todd-Hewitt-buljong kompletterad med 1,5 procent jästextrakt vid 37 grader i 5 procent CO2. Följande antibiotika användes för att odla SPN-kulturer vid behov: kanamycin (200 ug/ml), spektinomycin (100 ug/ml) och kloramfenikol (4,5 ug/ml). Niohundra mikroliter av 0,4 OD600 (optisk densitet vid 600 nm) odlad SPN-kultur blandades med 600 ul 80 procent steril glycerol (32 procent slutlig glycerolkoncentration) och förvarades i en -80 graders djupfrys. Dessa glycerolförråd användes som utgångsymmp för alla experiment.

Escherichia coli DH5 och STm (ATCC 14028)-kulturer odlades i Luria-Bertani-buljong (LB) vid 37 grader under skakförhållanden (200 rpm), och vid behov användes följande antibiotika: kanamycin (50 ug/ml), spektinomycin (100 ug/ml), kloramfenikol (20 ug/ml) och ampicillin (100 ug/ml). För alla infektionsanalyser odlades bakterier till OD600 ~0,4, följt av resuspension i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en liknande densitet innan värdcellerna infekterades.

Screening av förmodade ubiquitin-målproteiner

Alla ytproteiner närvarande i STm- och SPN-proteomet identifierades först från publicerad litteratur. Kompletta proteinsekvenser av ytproteinerna erhölls från UniProt, som sedan användes för att identifiera närvaron av degron-motiv. En uppsättning av 29 förmodade degron-motiv sammanställdes från publicerad litteratur (24, 52, 53) och databasen Eukaryotic Linear Motiv. Pythons regexmodul användes för att identifiera platsen för alla sådana kurerade motiv i ytproteinsekvenserna. En linjär sökning utfördes vidare för att identifiera närvaron av en lysinrest i närheten (8 till 14 aminosyrarester) för varje identifierat degron-motiv. Denna lysinrest antas fungera som fästställe för ubiquitin-delen. Till sist matades de kortlistade proteinsekvenserna in i IUPred (54), ett verktyg för att förutsäga proteinstruktur, för att lokalisera närvaron av en oordnad region mellan degron-motivet och proximalt lysin. De resulterande proteinerna (BgaA och PspA för SPN och RlpA för STm) valdes ut för utvärdering som ubiquitinationsmål och avkodning av deras roll i patogenclearance.

Bakteriell stamkonstruktion

Allelutbyte genom homolog rekombination utfördes med användning av genflankerande regioner som bär en insatt antibiotikakassett för generering av mutanta stammar i både SPN och STm (tabell S2).

För SPN amplifierades 500-bp uppströms och nedströms regioner av bgaA, pspA och hans gener från genomet med lämpliga primrar (tabell S3) och sattes samman i pBKS-vektorn. Efter kloning av dessa fragment sattes en antibiotikaresistenskassett (spektinomycin för påse såväl som pspA och kloramfenikol för hysA) in i denna konstruktion. De linjäriserade rekombinanta plasmiderna transformerades sedan till WT SPN med användning av kompetensstimulerande peptid 1 (GenPro Biotech), rekombinanter selekterades med användning av respektive antibiotika och genersättning bekräftades genom polymeraskedjereaktion (PCR) och sekvensering av respektive genloci. För STm användes λ-rött rekombinasmetoden för generering av gendeletionsmutanter (55).

I korthet bifogades sekvenser homologa till ändarna av repgenen i primersekvenserna som används för amplifiering av kanamycinresistenskassetten. Kassetten elektroporerades sedan in i WT STm-stammen, och knockouts genererade genom homolog rekombination valdes baserat på kanamycinresistens. Gendeletion bekräftades med användning av PCR och sekvensering av genlokuset. Fullängds-pspA, hysA och en trunkerad bgaA-T (1 till 3168 bp) klonades under P23-promotorn i skyttelvektorn pIB166 (56) och användes för komplementering.

Dessa rekombinanta plasmider användes också för platsriktad mutagenes för att generera olika varianter av bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, och bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, pspAK315R, Pgron, pspAK315R, Pgron ) och his (hysADegron-BgaA och hysADegron-PspA) med användning av lämpliga primeruppsättningar (tabell S3) och transformerades till ΔbgaA- och ΔpspA-mutanter. Alla kloner verifierades genom DNA-sekvensering. Uttryck av olika varianter av BgaA, PspA och HysA bekräftades genom Western blot med användning av lämpliga antikroppar.

Antikroppar och reagens

Anti-enolas- och anti-PspA-serum (S. Hammerschmidt, universitetet i Greifswald, Tyskland); anti-BgaA-serum (S. King, Ohio State University, USA); och antikroppar specifika för His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub-länkning (Millipore, 05-1307), K63-Ub-länkning (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), glyceraldehydfosfatdehydrogenas (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreonin (CST, 9381S), IgA, Kappa från murint myelom, klon TEPC-15 (Sig, M1421) och PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) upphandlades. Följande sekundära antikroppar användes: pepparrotsperoxidas (HRP)-märkt anti-kanin (BioLegend, 406401), HRP-märkt anti-mus (BioLegend 405306), anti-kanin Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-kanin Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), biotinkonjugerat anti-mus-immunoglobulin A (Life Technologies, M31115), anti-mus Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-mus Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), anti-goat Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) och FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Proteinuttryck och rening

BgaA-T och dess varianter klonades i pET28 med användning av Xba I/Not I-restriktionsställen. Rekombinanta plasmider som kodar för BgaA-T med N-terminal His-tag transformerades in i E. coli BL21 (DE3)-celler för proteinuttryck. Färskt transformerade kolonier odlades i LB innehållande kanamycin (50 ug/ml) vid 37 grader på en shaker-inkubator under 12 timmar. En procent av den primära kulturen sattes till 1 liter LB-buljong och inkuberades vid 37 grader på en shaker-inkubator tills OD600nm nådde mellan 0,6 och 0,8. Proteinuttryck inducerades genom tillsats av 100 μM isopropyl- -D-tiogalaktopyranosid (IPTG) och odling av kulturen ytterligare vid 37 grader i 5 till 6 timmar med omrörning vid 150 rpm.

Cellerna skördades genom centrifugering vid 6000 rpm under 10 minuter vid 4 grader. Cellpelleten återsuspenderades i buffert A [25 mM tris (pH 8,0) och 300 mM NaCl] och lyserades genom sonikering. Cellrester separerades genom centrifugering (14, 000 rpm, 50 min, 4 grader), och supernatanten applicerades på en Ni-NTA-kolonn, ekvilibrerad med buffert A. Kolonnen tvättades med 10 kolonnvolymer buffert A, och de His-märkta proteinerna eluerades med imidazol (250 mM) i buffert A. Alla varianter av BgaA-T uttrycktes och renades med användning av samma procedur. FBXW7 subklonades i pGEX-4 T-1-vektorn med en N-terminal glutation S-transferas (GST)-tagg från pCMV6-Entry-FBXW7-vektorn med användning av EcoRI-restriktionsenzymet.

GST-märkt FBXW7 uttrycktes i E. coli BL21 (DE3)-celler efter induktion av proteinuttryck med 0.1 mM IPTG och tillväxt vid 30 grader under 4 timmar. GST-FBXW7 från E. coli råextrakt renades med hjälp av Glutation-Sepharose (GE HealthCare) kolonnkromatografi. Fraktioner innehållande renade proteiner slogs samman och koncentrerades upp till 0,5 mg/ml med användning av ett 10-kDa molekylviktsavskärningsfilter (Amicon) genom centrifugering vid 4700 rpm vid 4 grader. Renheten hos proteinerna kontrollerades på SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) följt av färgning med Coomassie-blått.

Värdcellstransfektioner

BgaA-T klonades i doxycyklin-inducerbar vektor pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene nr. 130261) med användning av ett infusionskloningskit (Takara). En positiv klon bekräftades genom Sanger-sekvensering. FBXW7R505C-mutation utfördes genom platsriktad mutagenes med användning av pMRX-GFP-FBXW7 som mall och bekräftades genom Sanger-sekvensering. Alla transfektioner utfördes med användning av Lipofectamine 3000-reagens (Thermo Fisher Scientific), och urval gjordes i närvaro av blasticidinhydroklorid (2 ug/ml; HiMedia).

siRNA-riktad gennedbrytning

För RNA-interferensmedierad knockdown av specifika gener användes följande siRNA: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) och siGSK3DGETharmacon ONTARGETharma (Qiagen, 1027423). SMARTpool L-003010-00-0005). I korthet transfekterades A549-celler odlade i en 24-brunnsplatta tillfälligt med genspecifika siRNA eller scramble (siControl) (150 pmol) med Lipofectamine 3000 enligt tillverkarens instruktioner. Trettiosex timmar efter transfektion bearbetades celler för Western blotting och immunfluorescens- eller penicillin-gentamycinskyddsanalyser.

Strukturförutsägelse och modellering

Alla strukturer förutspåddes av AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) och visualiserades med PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC). Strukturer färgkodades i PyMol baserat på IUPred (54) poäng från ordnade (blå) till oordnade (röda) till vitt.

Western blotting

SPN-kulturer odlade till {{0}}.4 OD600nm lyserades genom sonikering och råextrakt uppsamlades efter centrifugering (15,000 rpm, 30 min, 4 grader). För A549s tvättades monolager flera gånger med PBS och lyserades i iskall radioimmunoprecipitationsanalys (RIPA) buffert [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1 procent Triton X-100, 0,5 procent natrium deoxicholat och 1 procent SDS] innehållande proteashämmare cocktail (Promega), natriumfluorid (10 mM) och EDTA (5 mM). Cellsuspensionen sonikerades kortvarigt och centrifugerades för att samla cellysat. Proteiner närvarande i bakteriella eller A549-cellysat (10 eller 20 ug) separerades på 12 procent SDS-PAGE-geler och överfördes till ett aktiverat polyvinylidendifluoridmembran. Efter blockering i 5 procent skummjölk undersöktes membranen med lämpliga primära och HRP-märkta sekundära antikroppar. Blotterna utvecklades slutligen med användning av ett förbättrat kemiluminescenssubstrat (Bio-Rad).
Penicillin-gentamicin skyddsanalys

SPN-stammar odlade tills OD600nm 0.4 i Todd-Hewitt-buljong kompletterad med 0.2 procent jästextrakt (THY) pelleterades, återsuspenderades i PBS ( pH 7,4), och späddes i analysmedium för infektion av A549-monoskikt med en infektionsmångfald (MOI) på 10. Efter 1 timmes infektion tvättades monoskikten med DMEM och inkuberades med ett analysmedium innehållande penicillin (10 ug/ml) ) och gentamicin (400 ug/ml) under 2 timmar för att döda extracellulär SPN. Celler lyserades sedan med 0,025 procent Triton X-100 och lysatet ströks ut på Brain Heart Infusion-agarplattor för att räkna upp livsduglig SPN. Procentuell invasion beräknades som [kolonibildande enheter (CFU) i lysatet/CFU som användes för infektion] × 100. För att bedöma den intracellulära överlevnaden, 9 timmar efter infektion (från början av penicillin-gentamycinbehandling), bereddes cellysat som nämnts ovan, och spridda pläterade och överlevande bakterier räknades upp. Överlevnadseffektivitet (procent) representerades som en gånger förändring i procent överlevnad i förhållande till kontroll vid angiven tidpunkt (normaliserad till 0 timmar).

Immunfluorescens

För immunfluorescensanalys odlades A549- eller HeLa-celler på täckglas och infekterades med SPN- eller STm-stammar vid MOI ~25 under 1 timme följt av antibiotikabehandling i 2 timmar. Vid önskade tidpunkter efter infektion (9 timmar för SPN-infektion i A549s och 3 timmar för infektion med STm i HeLa), tvättades cellerna med DMEM och fixerades med iskyld metanol vid -2 0 grader i 10 minuter. Vidare blockerades täckglasen med 3 procent bovint serumalbumin (BSA) i PBS under 2 timmar vid rumstemperatur (RT). Celler behandlades sedan med en lämplig primär antikropp i 1 procent BSA i PBS över natten vid 4 grader, tvättades med PBS och inkuberades med en lämplig sekundär antikropp i 1 procent BSA i PBS under 1 timme vid RT. Till sist tvättades täckglasen med PBS och monterades på glasskivor tillsammans med VECTASHIELD med eller utan 4′,6-diamidino-2-fenylindol (Vector Laboratories) för visualisering med ett konfokalt lasermikroskop (LSM 780, Carl Zeiss) ) under 40× eller 63× oljemål. Bilderna förvärvades efter optisk sektionering och bearbetades sedan med ZEN lite-programvara (version 5.0). Superupplösningsmikroskopi utfördes på liknande sätt med Elyra 7 (Carl Zeiss) i SIM-läge. För kolokaliseringsanalys poängsattes bakterier genom visuell räkning av n > 100 bakterier per replikat.

Transmissionselektronmikroskopi

Efter infektion med SPN och STm tvättades cellerna med {{0}},1 M natriumkakodylatbuffert, fixerad med 2,5 procent glutaraldehyd (Sigma-Aldrich) i 0,1 M natriumkakodylatbuffert ( Sigma-Aldrich) i 3 timmar vid 4 grader. Efter fixering samlades celler upp genom en cellskrapa och pelleterades vid 2000 rpm under 10 min. Cellerna tvättades sedan med 0,1 M natriumkakodylatbuffert och efterfixerades med 1 procent osmiumtetroxid i 0,1 M natriumkakodylatbuffert under 20 minuter vid 4 grader. Efter efterföljande tvättar med kakodylatbuffert och destillerat vatten, dehydrerades cellerna sedan i ökande koncentrationer av etanol (50, 70, 95 och 100 procent) och propylenoxid i 30 minuter och inbäddades till sist i epoxiharts (Electron Microscopy Sciences, 14300) polymerisation vid 75 grader i 45 min. Därefter överfördes kapslarna till en 95 graders ugn under 45 min. Ultratunna sektioner (70 nm) skars med en diamantkniv på en Leica EM UC7 Ultramicrotome och färgades med 2 procent uranylacetat och 1 procent blycitrat och betraktades med ett transmissionselektronmikroskop (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) vid 120 KV.

Ex vivo ubiquitination

A549-uttryckande BgaA-T och dess varianter behandlades med MG132 (5 μM), och proteinuttryck inducerades med doxycyklin (100 ug/ml) under 24 timmar. Celler lyserades sedan i RIPA-buffert och prover underkastades elektrofores med SDS-PAGE (8 procent). Bekräftelse av proteinuttryck och ubiquitination av BgaA-T och dess varianter bevisades genom Western blot efter sondering med anti-BgaA- respektive anti-K{10}}Ub-antikroppar.

Ubiquitination in vitro

För in vitro ubiquitinationsanalyser renades rekombinanta proteiner såsom beskrivits tidigare (58). SCFFBW7 E3-ligaskomplexet inkuberades med rekombinant 0,1 mM El (UBE1; Boston Biochem), 0,25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) och ubiquitin (2,5 ug/ml; Boston Biochem) i närvaro av renat BgaA-T och dess varianter. Ubiquityleringsreaktioner utfördes i analysbuffert [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosintrifosfat (ATP), 1 mM -merkaptoetanol och 0,1 procent Tween 20] under 2 timmar vid 25 grader . Reaktionerna stoppades med 5 x Laemmli-buffert, löstes upp på SDS-PAGE-geler och analyserades genom immunoblotting med användning av en anti-BgaA-antikropp.

In vitro kinasanalys

För att utföra in vitro kinasanalys användes GSK3 kinasenzymsystemet (Promega) enligt tillverkarens protokoll med följande modifieringar. Kortfattat sattes 3 ug rekombinant BgaA-T till 0,5 ug aktiv GSK3 med 400 μM ATP i reaktionsbuffert bestående av 40 mM tris, (pH 7,5), 20 mM MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) och 50 μM ditiotreitol. Reaktionen inkuberades i 2 timmar vid 30 grader och stoppades genom att tillsätta 1 x Laemmli-buffert. Proverna kokades sedan och underkastades elektrofores för Western blotting som nämnts tidigare. Fosforylerat BgaA-T detekterades med en anti-fosfotreoninantikropp.

In vivo-modell

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 procent startkroppsvikt, och uttalad nasal eller okulär flytning. Blodprov togs genom hjärtpunktion under terminal anestesi, och mjältar skars ut postmortem för bakterieräkning. Vävnadsprover bearbetades med en handhållen vävnadshomogenisator och homogenat serieutspäddes i PBS innan de sattes på blodagarplattor. Plattorna inkuberades över natten vid 37 grader, 5 procent CO2, och antalet bakteriekolonier bedömdes följande dag.

Statistisk analys

GraphPad Prism version 5 användes för statistisk analys. Statistiska tester som utförts för enskilda experiment nämns i respektive figurförklaringar. P < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant. Data testades för normalitet och för att definiera variansen för varje grupp som testades. Alla multiparameteranalyser inkluderade korrigeringar för flera jämförelser, och data presenteras som medelvärden ± SD om inte annat anges.

REFERENSER OCH ANMÄRKNINGAR

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs och alarmins: Allt vi behöver veta om fara. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Patogenigenkänning och inflammatorisk signalering i medfödda immunförsvar. Clin. Microbiol. Upps. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Livet på insidan: cytosoliska bakteriers intracellulära livsstil. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Rollen av ubiquitylation i immunförsvar och patogenflykt. Nat. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, The ubiquitination system within bacterial host-pathogen interactions. Microorganisms 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Global analys av värd och bakteriell ubiquitinome som svar på salmonella typhimurium-infektion. Mol. Cell 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, A mycobacterium tuberculosis ytprotein rekryterar ubiquitin för att utlösa värdxenofagi. Nat. Commun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 under bakteriell infektion. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubiquitinligaskomplex styr xenofagi genom att känna igen bakteriell ytglykan. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engström, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Lysinmetylering skyddar en intracellulär patogen från ubiquitylering och autofagi. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, ett E3 ubiquitinligas med känsla för bakterier. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Ubiquitinligas Smurf1 fungerar i selektiv autofagi av mycobacterium tuberculosis och anti-tuberkulösa värdförsvar. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBACsyntetiserade linjära ubiquitin-kedjor begränsar cytosolinvaderande bakterier genom att aktivera autofagi och NF-KB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Ubiquitinligas Parkin förmedlar resistens mot intracellulära patogener. Nature 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com