Ett MRNA-vaccin framkallar STING-beroende antitumörimmunsvar

Abstrakt

Lipidformulerade RNA-vacciner har använts i stor utsträckning för att förebygga och behandla sjukdomar, men deras verkningsmekanism och enskilda komponenter som bidrar till sådana effekter återstår att avgränsa. Här visar vi att ett terapeutiskt cancervaccin som består av en protamin/mRNA-kärna och ett lipidskal är mycket potent för att främja cytotoxiska CD8þ T-cellsvar och förmedla antitumörimmunitet. Mekanistiskt behövs både mRNA-kärnan och lipidskalet för att fullt ut stimulera uttrycket av typ I-interferoner och inflammatoriska cytokiner i dendritiska celler. Stimulering av interferon-b-expression är uteslutande beroende av STING, och antitumöraktiviteten från mRNA-vaccinet är signifikant äventyrad hos möss med en defekt Sting-gen. Således framkallar mRNA-vaccinet STING-beroende antitumörimmunitet.

cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret

1. Introduktion

Snabb utveckling och världsomspännande tillämpning av mRNA-vacciner för att förebygga SARS-CoV-2-infektion har visat kraften hos mRNA-baserade läkemedel i vården1,2. På grund av deras höga molekylvikt och negativa laddning måste mRNA-molekyler förpackas i leveransvehiklar för att effektivt komma in i däggdjursceller. Förpackning i nanometerstora leveransfordon har också fördelen av att skydda mRNA-molekyler från enzymatisk nedbrytning. Flera leveransplattformar har utvecklats för att passa ändamålet, såsom lipidnanopartikel4, lipopolyplex (LPP)5, liposom-protamin-RNA (LPR)6, RNA lipoplex (RNA-LPX)7 och virusliknande vaccinpartikel (VLVP) )8. Medan varje plattform har sin egen unika struktur och sammansättning, innehåller de flesta vehiklar en jonisk lipidmolekyl som underlättar mRNA-förpackning och flykten av mRNA-molekyler från endosomerna. Med framgången med de profylaktiska vaccinerna finns det en allmän insikt om att mRNA-terapi kan användas för att behandla kanske de flesta om inte alla sjukdomstyper9e12. Faktum är att mRNA-baserade terapeutiska cancervacciner har studerats i många år13,14. De senaste framstegen i kliniska prövningar har också visat deras användningspotential hos utvalda cancerpatienter15e17. Till skillnad från peptidcancervacciner som framställs med adjuvansmolekyler18e20, kan mRNA-vaccinpartiklar också fungera som självadjuvans21.

Till exempel kan ett tvåkomponents mRNA-baserat cancervaccin innehållande fritt och protaminkomplexbundet mRNA också aktivera den tollliknande receptorn 7 (TLR7) signalering22. Men med den ökande oron för akut medfödd immuntoxicitet från naken mRNA, använder de flesta utredare och företag modifierat RNA för att undvika medfödd igenkänning av TLRs23. Följaktligen spelar lipidkomponenterna en viktig roll för att förbättra adjuvansaktiviteten i mRNA-vaccinpartikeln, företrädesvis genom att aktivera icke-TLR-signalering. En nyligen genomförd studie av den lipidformulerade, negativt laddade RNA-LPX som består av 1,2- di-oktadecenyl-3-trimetylammonium (DOTMA, en katjonisk lipid)/dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE, en hjälplipid) liposom avslöjade aktivering av interleukin 1 (IL1)-interleukin 1 receptorantagonist (IL-1ra) axeln för att reglera utsöndring av proinflammatoriska cytokiner, och den väsentliga rollen av att aktivera tvåstegsinflammasomvägen i monocyter24. Intressant nog är en annan ny undersökning av den LNP-baserade BNT162b2 framställd med ALC-0315 (en joniserad lipid), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC, en hjälplipid) , polyetylenglykol-2000-N, N-di-tetradecylacetamid (PEG2000-DTA) och kolesterol visade nyckelrollen för att aktivera typ I-interferonberoende MDA5-signalering, men inte TLR eller inflammasom, för att stimulera båda medfödd och adaptiv immunitet för covid-19-vaccinet25. Dessa studier pekar på möjligheten att leveransplattformar som består av variabla lipidmolekyler kan förlita sig på olika signaltransduktionsvägar för vaccinaktivitet. Därför är det viktigt att fullständigt undersöka funktionen hos nyckelmolekyler och deras kombinationer för att ytterligare förbättra mRNA-terapi.

I den aktuella studien satte vi upp experiment för att dissekera den funktionella rollen av enskilda komponenter i ett terapeutiskt cancervaccin. mRNA-vaccinpartikeln (MVP) är sammansatt av en protamin/mRNA-kärna som är inkapslad i ett lipidskal bestående av en katjonisk lipid, en hjälparlipid, en pegylerad lipid och kolesterol (Fig. 1A). Det har visats att inkludering av laddad lipid kan underlätta riktad RNA-leverans26, och dioleoyletylfosfatidylkolin (EDOPC) och dioleoyl-3- trimetylammoniumpropan (DOTAP) är två av de katjoniska lipider som har testats för detta ändamål5,27. Vi undersökte stimulering av uttryck av interferon-b (IFN-b), IL-1b och tumörnekrosfaktor-a (TNF-a) av mRNA-kärnan, mRNA-fri vehikel och hela MVP, och korrelerade sådana aktiviteter till TLR7, mitokondriell antiviral signalering (MAVS, även känd som IPS-1), stimulator av IFN-gener (STING) och TIR-domän-innehållande adapter som inducerar IFN-b (TRIF)-signalering. Därefter undersökte vi rollen av protamin i kärnan och katjonisk lipid i skalet för att stimulera IFN-b och TNF-a uttryck. Slutligen jämförde vi antitumörimmunsvar från MVP i vildtyps- och gen-knockout-möss.

Fördelarna med cistanche tubulosa-Antitumor

2. Material och metoder

2.1. Material

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-etylfosfokolin (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfatidyletanolamin (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polyetylenglykol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoyl-3-trimetylammoniumpropan (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) (850375) köptes från Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, USA). Kolesterol (C8667) erhölls från Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Reagensen löstes i etanol vid en koncentration av 2 mg/ml för DSPE-PEG2k, 10 mg/ml för kolesterol och DOPC och 20 mg/ml för EDOPC, DOPE respektive DOTAP. Protaminsulfat (P4020) erhölls från Sigma Aldrich. mRNA-molekyler som kodar för ovalbumin (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) och luciferas (Luc-mRNA) (L-7204) köptes från TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, USA). RNasfritt vatten (W0805-010) erhölls från GeneDEPOT (Baker, TX, USA). TLR7-agonisten imiquimod (tlrimq) och Sting-agonisten 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) var produkter från Invivogen (San Diego, CA, USA). Lipofectamine 2000 (11668019) och Quant-iT™ RiboGreen™ RNA-analyskit (R11490) köptes från Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Rekombinant mus GM-CSF (554586) köptes från BD Biosciences (San Diego, CA, USA). 500 Protein transporter inhibitor cocktail (00-4980-93) var en produkt från Invitrogen. Cytofix/Cytoperm-kit (AB_2869010) köptes från BD Biosciences. EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit (19851) erhölls från STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Följande antikroppar förvärvades från BioLegend (San Diego, CA, USA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) och anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) och anti-CD103-PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) och anti-IFN-g-PE (554412) kom från BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) köptes från ImmuDex (Fairfax, VA, USA). ELISA-kit för IL-1b (EM2IL1B) och TNF-a (BMS607-3) köptes från Invitrogen, och ELISA-kit för CCL5 (DY478) och IFN-b (DY8234) erhölls från R&D Systems , Inc. (Minneapolis, MN, USA). Antikroppar för Western blot-analys inklusive anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-aktin (4970) och anti-GAPDH (5174) köptes från Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Figur 1. Beredning och karakterisering av mRNA-partiklar. (A) Schematisk bild av vaccinpartikelberedning. (B) Agarosgelelektrofores visar att mRNA-molekyler hölls kvar i provladdningsbrunnen i prover framställda med mRNA/protamin i ett förhållande på 1:1 till 1:2. (CeF) Karakterisering av mRNA-vaccinpartiklar (MVP) baserat på procentandel av inkapsling, polydispersitetsindex, zetapotential och storlek. (G) Representativa TEM-bilder av MVP2-partiklar, skalbar Z 50 nm. (H) Procentandel av eGFP-uttryck efter att DC2.4-celler behandlades med eGFP-MVP i 16 timmar. (I) Fluorescerande avbildning av eGFP-uttryckande DC2.4-celler, skalbar Z 400 mm. (J) Kvantitativ analys av bioluminescens i BMDCs behandlade med MVPs inkapslade med luciferaskodande mRNA i 16 timmar. (K) Förändringar i livskraften hos BMDC behandlade med PBS, mRNA-fri vehikel, mRNA/protaminkärna eller mRNA-inkapslad MVP2. Behandlingskoncentrationerna var mRNA-ekvivalenta. Data presenteras som medel-SEM (nZ3). *P < 0,05; **P < 0,01.

2.2. Cellinjer och cellkultur

Den murina dendritiska cellinjen DC2.4 erhölls från ATCC (Manassas, VA, USA) och odlades i RPMI-1640 innehållande 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin-streptomycin. Den murina melanomcellinjen B16-OVA förvärvades från Dr. Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, USA). B16-OVA-celler odlades i DMEM kompletterat med 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin. Den murina kolonadenokarcinomcellinjen MC38 köptes från ATCC. Celler konstruerades med OVA-uttryck och odlades i DMEM med 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin. Cellkultur hölls vid 37 C med 5% CO2.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

2.3. mRNA-vaccinpartikelberedning

Alla mRNA-vaccinpartiklar framställdes med NanoAssemblr Benchtop mikrofluidinstrument från Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) genom att blanda den organiska fasen och vattenfasen. För att framställa den organiska fasen löstes EDOPC (20 mg/ml), DOPE (20 mg/ml), kolesterol (10 mg/ml) och bis-DSPE-PEG2k (2 mg/ml) i etanol och blandades vid 34°C. :30:35:1 M-förhållande med en flödeshastighet på 9 mL/min. För att framställa mRNA-kärnan i vattenfasen blandades mRNA med protaminsulfat vid 1:1 (vikt/vikt) i mikrofluidinstrumentet med en flödeshastighet av 9 ml/min. Efter 20 minuters inkubation vid 20 C blandades mRNA-kärnan i vattenfasen med den organiska fasen för att generera mRNA-vaccinpartiklar. Efter 20 minuter överfördes vaccinpartikelsuspensionen till ett Amicon ultracentrifugalfilter (MWCO 30 kDa), och 9-volymvatten av molekylär kvalitet tillsattes för att späda ut etanolkoncentrationen från 25 % till 2,5 %. Partikelsuspensionen koncentrerades sedan genom centrifugering vid 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) vid 4 C. En lika stor volym av 2 PBS sattes till den koncentrerade produkten för att justera det osmotiska trycket.

2.4. Gel retardationsanalys

mRNA/protaminkärnan analyserades först genom gelretardation. Kortfattat laddades mRNA/protaminkärna innehållande 0,5 mg mRNA i brunnen i en 1 % agarosgel i 1 TBE-lösning och elektrofores utfördes vid 120 V under 30 minuter (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). RNA-band färgades med Gelred (Biotium, Hayward, CA) och detekterades med ett GelDoc-system (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Karakterisering av mRNA-vaccinpartiklar

Storleksfördelning och zetapotential mättes med Zetasizer med dynamisk ljusspridning (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA). Inkapslingshastigheten bestämdes med användning av ett Quant-iT™ RiboGreen™ RNA-analyskit. Kortfattat späddes ett vaccinpartikelprov innehållande 0,5 mg mRNA med en TriseEDTA-buffert (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) med eller utan 2 % Triton-X100 i en { {10}}brunnsplatta. Efter 10 minuters inkubation vid 37 C tillsattes RiboGreen i varje brunn och fluorescensintensiteten mättes. Inkapslingseffektiviteten beräknades såsom visas i ekv. (1): Transmissionselektronmikroskopi (TEM) av vaccinpartiklar utfördes enligt en tidigare beskriven procedur9.

2.6. Djur

Alla djuroperationer godkändes av Animal Care and Use Committee på Houston Methodist Hospital (protokollnummer AUP06200042). Möss hölls i en miljö som helt uppfyllde de reglerande standarderna från National Institute of Health och American Association of Laboratory Animal Care-standarder. Vildtyp C57BL/6J möss och genetiskt modifierade möss inklusive Tlr7 /, Sting /, Mavs / och Trif / möss köptes från Jackson Laboratory.

2.7. Generering av murina benmärgshärledda dendritiska celler (BMDC)

Benmärgsceller spolades ut från lårbenet och skenbenet med komplett RPMI 1640. Röda blodkroppar lyserades med en ACK-lysbuffert och omogna benmärgsceller odlades i RPMI 1640 kompletterat med 20 ng/ml rekombinant murin GM-CSF i 10 dagar vid 37 C med 5 % CO2. Cellodlingsmedium uppdaterades på dag 3, 6 och 8, och icke-vidhäftande dendritiska celler samlades in på dag 10.

2.8. Mätning av cytokiner och kemokiner

BMDCs såddes i en 24-brunnsplatta med en täthet av 5  105 celler/brunn. Efter 1 timmes sedimentering behandlades cellerna med 1 mg/ml imiquimod, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP, (1 mg/ml mRNA-ekvivalent) vaccinpartiklar eller kontroller. Cellodlingsmedia samlades in 24 timmar senare, och nivåerna av TNF-a, CCL5, IFN-b och IL-1b mättes med användning av enzymkopplade immunosorbentanalyssatser (ELISA) genom att följa tillverkarens föreslagna procedurer.

cistanche växthöjande immunförsvar

2.9. Analyserar på DC-transfektion, DC-mognad och stimulering

För att analysera DC-transfektionseffektiviteten in vitro såddes DC2.4-celler vid 2.5 105 celler/brunn i en 24-brunnsplatta. Celler behandlades med eGFP- eller luciferaskodande mRNA-inkapslade partiklar vid en slutlig koncentration av 1 mg mRNA/ml. Celler skördades 24 timmar senare, tvättades med 2% FBS i PBS-lösning och återsuspenderades sedan i samma lösning innan de applicerades för flödescytometrianalys med en BD LSR II flödescytometer (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . För att mäta DC-mognad och antigenpresentation in vitro såddes BMDCs vid 2.5  105 celler/brunn i en 24-brunnsplatta och behandlades med 1 mg/ml OVA-MVP i 24 timmar. BMDC färgades under 30 minuter med antikroppar specifika för CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 och CD86 för DC-mognad och anti-H-2Kb (SIINFEKL) för antigenpresentation. För att bestämma stimulerande styrka in vivo vaccinerades C57BL/6J möss en gång med 10 mg OVA-MVP per mus i trampdynan, och dränerande popliteala LN skördades 24, 48 och följande cellytemarkörer: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Flödescytometrianalyser på T-cellsaktivering och proliferation

För att mäta T-cellsaktivering in vivo vaccinerades möss en gång med 10 mg OVA-MVP, och popliteala LN: er isolerades vid 24 eller 48 timmar. T-celler färgades med följande antikroppar: CD45, CD3, CD4, CD8 och CD69. För att detektera antigenspecifika T-celler skördades tumörer, mjälte och popliteala lymfkörtlar 5 dagar efter den andra vaccinationen. Vävnader bearbetades för att generera encellssuspensioner och celler färgades med T-cellsspecifika antikroppar och OVA257e264-MHCI-dextramer enligt tillverkarens instruktioner. För att mäta intracellulär IFN-g-nivå stimulerades 2  106 splenocyter eller celler isolerade från popliteala LN och tumörer med 10 mg/mL OVA257e264-peptid i komplett RPMI 1640-medium kompletterat med 55 mmol/L b-merkaptoetanol och 1 proteintransportörhämmare cocktail i 18 timmar. Celler skördades och färgades med T-cellspecifika antikroppar. Efter fixering och permeabilisering med Cytofix/Cytoperm-kit färgades cellerna med anti-IFN-g-antikropp och applicerades för analys på BD LSR II flödescytometer (BD Biosciences). För att mäta T-cellsproliferation isolerades T-celler från mjältarna från OT-I-transgena möss med användning av ett T-cellisoleringskit från mus. De färgades med 1 mmol/L CFSE i RPMI 1640 innehållande 200 mg/ml BSA under 10 minuter vid 37 C. CFSE-märkta T-celler tvättades två gånger med 5 volymer kall komplett RPMI 1640. Under tiden behandlades mogna BMDC med 2 mg/ml OVA mRNA-inkapslad MVP i 24 timmar före T-cellisolering. När T-celler var klara samodlades BMDC:er och T-celler i ett förhållande av 1:5 (DC:T) i 72 timmar. Celler samlades in och färgades med ytantikroppar för T-celler, proliferationen testades med en BD LSR II flödescytometer (BD Biosciences) och analyserades. Alla flödescytometriresultat analyserades med programvaran FlowJo v10 (Ashland, OH, USA).

2.11. Spåra proteinuttryck i levande möss

BALB/c-möss behandlades genom injektion i trampdynan med 10 mg Luc mRNA-inkapslad MVP. De injicerades intraperitonealt med 30 mg RediJect D-luciferin per mus 6, 12, 24 eller 48 timmar senare, och bioluminescens mättes med Xenogen IVIS-200-avbildningssystemet (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, USA).

2.12. ELISpot-analys

IP-filterplattor försköljdes med 50 mL 35 % etanol och tvättades noggrant 3 gånger med PBS innan etanolen avdunstade. Plattorna belades därefter med anti-IFN-g-infångningsantikroppar vid 4 C över natten. Plattorna blockerades med RPMI 1640 komplett medium innehållande 55 mmol/L b-merkaptoetanol under 2 timmar vid 37 C. Celler (1  105 splenocyter, 1  105 celler från popliteal LN) såddes i varje brunn och stimulerades under 36 timmar med 10 mg/ml OVA257e264-peptid. Medier kasserades och cellerna tvättades 4 gånger med PBST (PBS innehållande 0,05 % Tween 20) och två gånger med PBS. Efter den sista tvätten tillsattes en anti-IFN-g-detektionsantikropp och inkuberades i 2 timmar vid rumstemperatur i mörker. Plattorna tvättades 4 gånger med PBST och två gånger med PBS, och avidin-HRP tillsattes och inkuberades i ytterligare 45 minuter vid rumstemperatur i mörker. Slutligen tvättades plattorna med PBST och PBS igen såsom beskrivits ovan, och 50 ml AEC-substrat applicerades och observerades med avseende på fläckreaktion. När fläckar blev synliga stoppades reaktionen genom att kassera AEC-substratet och spola det med dubbeldestillerat vatten 5 gånger. Efter lufttorkning över natten skannades plattorna och analyserades med CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, USA).

2.13. Western blot-analys

BMDC härrörande från vildtyp, Mavs KO eller Sting KO-möss samlades in och celler lyserades i RIPA-cellysbuffert kompletterad med proteas- och fosfatasinhibitorer. Proteinkoncentrationen i cellysatet mättes med ett BCA-proteinanalyskit. Proteinprover separerades med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och överfördes till ett polyvinylidendifluorid (PVDF)-membran. MAVS- och STING-uttryck detekterades efter att membranet inkuberats med en anti-MAVS- eller anti-STING-antikropp vid 1:2000 utspädning följt av immunodetektion med SuperSignal West Pico och Femto Chemiluminescent Substrate. För att mäta aktivering av STING-vägen behandlades BMDC härrörande från vildtypsmöss med vehikel eller OVA mRNA-inkapslad MVP vid angiven koncentration under 2 timmar. Celler lyserades och fortsatte för Western blot-analys med anti-TBK1- och antifosfo-TBK1-antikroppar vid 1:2000 utspädning.

2.14. Antitumöranalys

Murina tumörmodeller genererades genom att inokulera 2  105 celler B16-OVA melanomceller eller 5  105 MC38-OVA-celler per mus subkutant i den vänstra flanken av 6 till {{5} } vecka gamla C57BL/6J honmöss. Möss fördelades slumpmässigt i behandlingsgrupper och behandlades två gånger åtskilda av 7 dagar med 10 mg OVA MVP eller kontroller i trampdynan. Tumörtillväxt övervakades varannan dag. Tumörvolymen beräknades enligt ekv. (2):

Möss avlivades 5 dagar efter den andra vaccinationen och vikten av tumörvävnader registrerades.

2.15. Statistisk analys

Alla resultat presenteras som medel-SEM. Statistik bedömdes med ett envägs ANOVA-test med Tukeys korrigering för jämförelse med flera grupper och ett oparat tvåsidigt t-test för jämförelse med två grupper. Data analyserades med programvaran GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 ansågs statistiskt signifikant (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Resultat

3.1. MVP förmedlar robust mRNA-uttryck i dendritiska celler (DC)

Vi förberedde kärn-skal-vaccinpartiklar i en tvåstegs mikrofluidisk tillvägagångssätt (Fig. 1A), och utvärderade systematiskt enskilda komponenter i nanopartikeln för att sätta ihop en vaccinpartikel med hög stabilitet, hög cellulärt upptag och hög uttryckspotential i DC. Gelelektrofores avslöjade att en stabil mRNA-kärna kunde bildas när mRNA-till-protamin-förhållandet var 1 eller lägre (Fig. IB). Genom att använda eGFP-kodande mRNA som en surrogatmarkör fann vi att en lipidkomposition med ett molärt förhållande av 34% EDOPC/30% DOPE/35% kolesterol/1% DSPEPEG2k gav en idealisk inkapslingshastighet och den bästa uttryckseffektiviteten (tabell 1, Stödinformation Fig. S1AeS1D). Ändring av laddningsförhållandet förändrade inte signifikant inkapslingshastigheten, polydispersitetsindex eller ytladdning av partiklarna (tabell 2, fig. 1CeE); storleken på de resulterande partiklarna var emellertid mellan 70 och 80 nm i diameter när förhållandet var mellan 12 och 16, jämfört med en diameter på 120e130 nm när förhållandet väl föll utanför intervallet (fig. IF och G). Det bästa uttrycket detekterades i DC2.4-celler behandlade med MVP2 som hade ett laddningsförhållande på 12 (Fig. IH och I). Ett liknande mönster observerades när partiklar framställdes med mRNA som kodar för luciferas och dosberoende uttryck detekterades (Fig. 1J). De mRNA-inkapslade partiklarna visade önskvärd stabilitet eftersom de inte förlorade aktivitet efter frystorkning eller frys-upptining (Fig. S1E och S1F). Dessutom fanns det ingen cytotoxicitet efter att benmärgshärledda dendritiska celler (BMDCs) behandlats med enbart mRNA-kärnan, en vehikelpartikel framställd utan mRNA-molekyler eller mRNA-innehållande MVP2 (Fig. 1K). Således visade MVP2 den bästa uttryckspotentialen. Den användes för alla ytterligare experiment i studien och märktes som MVP i resten av texten. MVP-partiklarna kunde effektivt leverera mRNA-molekyler in vivo, och det fanns ingen detekterbar toxicitet från den mRNA-inkapslade MVP baserat på kroppsviktsförändringar (Fig. S1GeS1I).

3.2. MVP inducerar effektivt antigenpresentation och T-cellsaktivering in vitro och in vivo

Vi förberedde mRNA-kärna, mRNA-fri vehikel och OVA-mRNA-inkapslad MVP och applicerade dem för att testa DC-mognad och antigenpresentation (Fig. 2A). BMDCs behandlade med MVP visade dosberoende överuttryck av DC-mognadsmarkörer inklusive CD40, CD80 och CD86 (Fig. 2BeD). Behandling med antingen den mRNA-fria vehikeln eller mRNA-inkapslad MVP utlöste MHC I-överuttryck (Fig. 2E), vilket indikerar att effekten var associerad med vehikeln snarare än mRNA-komplexet. Dessutom resulterade MVP-behandling i cellytevisning av OVA257e264-antigenepitop-MHC I-komplexet (SIINFEKL-MHC I) som detekterades med en anti-SIINFEKL-MHCI-antikropp (Fig. 2F), vilket visar effektiv antigenbearbetning och presentation av BMDC:er . Dessutom saminkubation av MVP-behandlade BMDC med B3Z, en CD8þ T-cellinje som specifikt kände igen OVA257e264-epitopen, eller T-celler isolerade från mjälten på en OT-I-mus som uttryckte en OVA257e264-specifik T-cell receptor, utlöst IL-2-utsöndring, ett resultat som inte observerades i T-celler samkuberade med DC som behandlats med enbart vehikel eller enbart mRNA/protaminkärnan (Fig. 2G). Flödescytometrianalys detekterade 32,5 % proliferativa CD8þ T-celler efter saminkubation med MVP (Fig. 2H och I). OVA-mRNA-inkapslade MVP-partiklar applicerades också för att behandla möss genom intradermal injektion. Undersökning av celler i de dränerande lymfkörtlarna avslöjade en stadig ökning av CD86-uttryck bland både klassiska DC (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC) och plasmacytoida DCs (pDC) under de första 48 timmarna, vilket indikerar stimulering av DC mognad (Fig. 2J). Behandling främjade också anrikningen av CD8þ T-celler i lymfkörtlarna, med en signifikant ökning av populationen av CD69þCD8þ T-celler (Fig. 2K och L), vilket tyder på T-cellsaktivering genom behandlingen. För att bestämma T-cellsaktivering samlade vi celler i de dränerande lymfkörtlarna 3, 5 eller 7 dagar efter MVP-behandling och utförde ELISpot-analyser efter att celler utmanats med OVA257e264-antigenpeptiden (understödjande information Fig. S2). MVP-behandling utlöste ett stort hopp i IFN-g-utsöndrande celler under tiden, med en toppaktivitet på dag 5 (Fig. 2M). Dessa resultat visade robust DC-stimulering, antigenpresentation och T-cellsaktivering efter behandling med MVP.

Tabell 1 Sammansättning av nanopartiklar inkapslade med eGFP-kodande mRNA.

Tabell 2Lipidsammansättning och laddningsförhållande för MVPpartiklar.

3.3. MVP framkallar potent antitumörimmunitet i murina modeller av kolorektal tumör och melanom

MVP applicerades för att behandla möss med MC38 koloncancer och B16 melanom. I båda modellerna blockerade behandling med OVA-mRNA-inkapslad MVP två gånger fullständigt tumörtillväxt subkutant; i jämförelse hade behandling med eGFP mRNA-inkapslad MVP eller vehikel enbart ingen detekterbar hämmande effekt på tumörtillväxt (Fig. 3AeD, Stödinformation Fig. S3). I linje med mönstret för en CD4 till CD8-förskjutning i lymfkörtlar (Fig. 2), observerade vi en ökning av CD8þ/CD4þ T-cellförhållandet i tumörer från möss behandlade med OVA mRNA-inkapslad MVP (Fig. 3E). Dessutom upptäckte vi förhöjda nivåer i IFN-gþCD8þ T-celler i mjältar, lymfkörtlar och tumörer hos möss behandlade med OVA mRNA-inkapslad MVP, men inte med enbart vehikel eller GFP mRNA-inkapslad MVP (Fig. 3FeH, Supporting Information Fig. S4). Dessutom fanns det en signifikant ökning av OVA257e264-MHCI-dextramer-positiva CD8þ T-celler i tumörer från den OVA-mRNA-inkapslade MVP-behandlingsgruppen, vilket indikerar proliferation av antigenspecifika CD8þ T-celler (Fig. 3I). ELISpot-analys med celler isolerade från mjältarna och lymfkörtlarna gav ytterligare stöd för T-cellsaktivering (Fig. 3JeM).

3.4. MVP stimulerar medfödda immunsvar genom att aktivera STING-beroende signalering

Vi applicerade mRNA-kärna, mRNA-fri vehikel och mRNA-inkapslad MVP för att behandla BMDC för att identifiera nyckelfaktorer och vägar som är ansvariga för stimulering av typ I IFN och inflammatoriskt cytokinuttryck. Intressant nog var MVP lika potent som Tlr7-agonisten imiquimod när det gällde att utlösa IFN-b-utsöndring, och enbart vehikel visade också aktivitet för att främja IFN-b-utsöndring, även om dess styrka inte var lika hög som MVP; emellertid var mRNA-kärnan ensam ineffektiv för att stimulera IFN-b-utsöndring (Fig. 4A). Resultatet antydde att både mRNA och komponenter i vehikeln behövdes för att maximera IFN-b-expression. Under tiden visade imiquimod och vehikel liknande aktivitet för att främja uttryck av TNF-a och IL-1b, medan MVP var mycket mer potent än någon av dem (Fig. 4B och C). Uttryck av CCL5, ett cytokin som vanligtvis förknippas med NF-kB och IFN-reglerande faktorer, stimulerades lika mycket i celler behandlade med imiquimod, endast vehikel eller MVP (Fig. 4D). TLR7, MAVS, STING och TRIF är nyckelfaktorer i viktiga signaltransduktionsvägar som förmedlar cellulära svar på viralt RNA och skadat DNA28e30. Vi genererade BMDC från möss med Tlr7, Mavs, Sting eller Trif gen knockout (KO) och behandlade celler med mRNA-kärna, mRNA-fri vehikel eller mRNA-inkapslad MVP för att undersöka IFN-b och TNF-a uttryck.

Figur 2 Stimulering av immunsvar genom MVP. (A) Schematisk bild av mRNA/protaminkärna, mRNA-fri vehikel och komplett MVP. (BeD) Mognad av BMDC efter att ha behandlats med OVA-MVP i 24 timmar. (E och F) MHC I-expression och OVA257e264-antigenepitop-MHC I-komplex i BMDCs efter att ha behandlats med OVA-MVP i 24 timmar. (G) Nivå av IL-2 från behandlade BMDCs saminkuberade med B3Z eller OT-I T-celler. (H och I) Flödescytometrianalys av proliferativa T-celler. Representativa kromatogram av T-celler visas. (J) DC-mognad efter MVP-behandling in vivo. C57BL/6J-möss behandlades med OVA-MVP och DCs i popliteala lymfkörtlar analyserades. (K och L) T-cellpopulationsanalys. C57BL/6J-möss behandlades med vehikel eller OVA-MVP, och T-celler i popliteala lymfkörtlar analyserades med flödescytometri. (M) ELISpot-analys. C57BL/6J-möss behandlades med OVA-MVP och lymfkörtlar samlades in vid de angivna tidpunkterna. Isolerade celler användes för mätning av IFN-g-uttryckande celler. Data presenteras som medel-SEM (nZ3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, inte signifikant.

Figur 3 Antitumöraktivitet från MVP. (A) Hämning av MC38-OVA-tumörtillväxt. C57BL/6J-möss av honkön inokulerades subkutant med 5  105 MC38-OVA-tumörceller/mus på dag 0 och behandlades med PBS-kontroll, vehikelkontroll, GFP-MVP eller OVA-MVP på Dag 3 och 10. (B) Hämning av B16-OVA-tumörtillväxt. C57BL/6J honmöss inokulerades subkutant med 2  105 B16-OVA-tumörceller/mus på dag 0 och behandlades med PBS-kontroll, vehikelkontroll, GFP-MVP eller OVA-MVP på dag 3 och 10. (C och D) Bild och vikt av B16-OVA-tumörer på dag 17. (E) T-cellspopulation i tumörer hos möss efter behandling. (FeH) IFN-gþCD8þ T-celler i mjältar, lymfkörtlar (LN) och tumörer hos möss efter behandling. (I) OVA-specifika CD8þ T-celler i tumörer hos möss efter behandling. (JeM) Bilder och kvantitativ analys av ELISpot-analys av mjält- och LN-celler från möss efter behandling. Data presenteras som medel-SEM (n Z 5). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001.

KO-status för Mavs och Sting i BMDCs bekräftades med Western blot-analys (understödjande information Fig. S5A). Överraskande nog raderade Sting KO ut stimulerande aktivitet på IFN-b-utsöndring från både vehikel enbart och MVP (Fig. 4E), vilket indikerar att MVP aktiverade typ I IFN-uttryck genom STING. För att stödja uppfattningen upptäckte vi fosforylering av tankbindande kinas 1 (TBK1) (Fig. S5B), ett kinas som vanligtvis är associerat med STING-aktivitet31. Dessutom var denna väg oberoende av TLR7-signalering, eftersom IFN-b-uttryck inte äventyrades i celler behandlade med imiquimod (Fig. 4E). I jämförelse hade Trif eller Mavs KO en minimal inverkan på IFN-b-uttryck som främjas av MVP. Som förväntat var imiquimod ineffektivt för att stimulera IFN-b-utsöndring i BMDC härrörande från Tlr7 KO; Tlr7 KO hade emellertid en negativ inverkan på den stimulerande effekten från MVP (Fig. 4E). Intressant nog observerades en annan profil på TNF-a-utsöndring från samma behandlingar. Knockout av Sting, Trif eller Tlr7 hade ingen till minimal inverkan på MVP-stimulerad cytokinuttryck. Knockout av Mavs, å andra sidan, minskade dramatiskt TNF-a-nivåer i celler behandlade med antingen enbart vehikel eller MVP (Fig. 4F). Resultatet indikerar att MAVS är en nyckelregulator för TNF-a-uttryck i DC vid MVP-behandling.

3.5. MVP stimulerar STING- och MAVS-vägar för att främja utsöndringen av IFN-I och inflammatoriska cytokiner

För att identifiera komponenter i fordonet som är ansvariga för stimulering av STING- och MAVS-signalering, förberedde vi fordon och MVP:er genom att ersätta eller utelämna nyckelkomponenter och tillämpade dem för att behandla BMDC. Sting-agonistens cykliska GMP-AMP (cGAMP) fungerade som en positiv kontroll vid stimulering av IFN-b-utsöndring. Ersättning av den katjoniska lipiden EDOPC i vehikeln med en annan positivt laddad lipid, DOTAP, utplånade fullständigt IFN-b-sekretion. I jämförelse bibehölls den stimulerande effekten från vehikeln och MVP med eller utan protamin, och sådan stimulerande aktivitet var beroende av en intakt Sting-gen (Fig. 4G). Intressant nog främjade BMDCs behandlade med individuella komponenter i lipidskalet inklusive EDOPC inte stark IFN-b-sekretion (stödjande information Fig. S6). Således var EDOPC väsentligt för STING-aktivering, och dess aktivitet är beroende av bildandet av en lipidnanopartikel (dvs vehikel eller MVP). Vehikel och MVP framställda med EDOPC eller DOTAP applicerades också för att behandla BMDCS härrörande från vildtyps- och Mavs KO-möss, och TNF-nivåer i celltillväxtmedier bestämdes. Som förväntat eliminerades stimulerande ansträngning från vehikeln och MVP genom att ersätta EDOPC med DOTAP eller DOPC. Dessutom reducerades TNF-a-nivån signifikant i Mavs KO-celler jämfört med vildtypsceller, men minskade inte (Fig. 4H), vilket indikerar att ytterligare faktorer kan vara involverade i att förmedla MVP-stimulerat TNF-a-uttryck.

3.6. STING-vägen är avgörande för MVP-medierade antitumörimmunsvar

Både vildtyps- och knockoutmöss behandlades med OVA-mRNA-inkapslad MVP, och DC-mognad och T-cellsproliferation undersöktes. Sting KO minskade signifikant andelen CD80þ och CD86þ DC-celler och CD69þ T-celler (Fig. 5AeD). ELISpot-analys avslöjade signifikant reducerade IFN-g-producerande celler i mjältarna och lymfkörtlarna från Sting KO-möss jämfört med vildtypsmöss efter att de behandlats med samma dos av MVP (Fig. 5EeH). Effekten från Mavs KO var minimal, eftersom ingen skillnad övervakades på CD44þCD8þ minnes T-celler, OVA257e264-MHCI dextramer-positiva CD8þ T-celler eller antalet IFN-g-producerande celler i lymfkörtlarna jämfört med vild- typ möss (Fig. 5IeL). Resultatet förstärker uppfattningen att ytterligare faktorer förutom MAVS kan vara involverade i MVP-stimulerade inflammatoriska cytokinuttryck. Både vildtyps- och Sting KO-möss applicerades för att inokulera B16-OVA-tumörer, och möss behandlades med PBS-kontroll eller OVA-mRNA-inkapslad MVP. Flödescytometrianalys på lymfkörtel- och tumörprover insamlade från vaccinerade möss avslöjade ett signifikant minskat antal IFN-g-producerande CD8þ T-celler i Sting KO-möss (Fig. 6A och B). Som ett resultat inhiberades tumörtillväxt fullständigt i vildtypsmöss behandlade med MVP, jämfört med endast partiell inhibering i Sting KO-möss (Fig. 6C).

cistanche växthöjande immunförsvar

Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Diskussion

I den aktuella studien har vi systematiskt undersökt de funktionella rollerna för enskilda komponenter i MVP vid stimulering av antitumörimmunsvar. Vår cellbaserade studie har tydligt visat att både mRNA-molekyler och den RNA-fria vehikeln i MVP behövs för dess fulla aktivitet för att främja uttrycket av IFN-b och ett antal inflammatoriska cytokiner inklusive IL-1b och TNF -a i dendritiska celler. Sådana cytokiner har visat sig spela väsentliga roller i aktivering av dendritiska celler och vaccinmedierad antitumörimmunitet20. Vår studie har också avslöjat att stimulering av cytokinproduktion är beroende av ett antal viktiga signaltransduktionsvägar involverade i medfödd immunavkänning inklusive de som medieras av STING och MAVS. Medan STING är väsentligt för IFN-b-uttryck, är MAVS huvudsakligen involverat i att reglera TNF-a-uttryck (Fig. 6D). Betydelsen av STING-signalering på MVP-medierad antitumörimmunitet demonstreras ytterligare av minskad T-cellsaktivitet och följaktligen äventyrad tumörtillväxthämning hos Sting KO-möss. Detta resultat är i linje med andra rapporter om att STING-aktivering bestämmer cytotoxisk T-cellsmedierad antitumörimmunitet32. MAVS är en viktig mellanhand i RIG-I-receptorn (RLR) signalering som svar på virusinfektion. Aktivering av denna väg leder till en kaskad av inflammatoriska svar33. Det är spännande att T-cellsaktivitet inte äventyras i Mavs KO-möss, med tanke på att MAVS-signaleringen helt klart spelar en stor roll för att reglera uttrycket av inflammatoriska cytokiner inklusive TNF-a. En möjlig orsak är att stimulering av sådana cytokiner av MVP medieras av flera vägar, och avbrott i MAVS-vägen minskar inte cytokinuttrycket till en tillräckligt låg nivå för att orsaka en betydande påverkan. Alternativt kompenseras förlusten av MAVS-signalering av de andra vägarna. Ytterligare studier behövs för att identifiera dessa vägar för att ytterligare förstå verkningsmekanismen för MVP-vaccin. Även om TLR7 traditionellt har associerats med mRNA-terapi21, verkar TLR7-signaleringen inte spela någon större roll för att förmedla MVP-aktivitet. Tillämpningen av helt metylerade mRNA-molekyler i den aktuella studien kan ha gjort TLR7-signaleringen mindre relevant. Det har visats väl att RNA-metylering undertrycker igenkänning av TLRs23. TRIF är ett nyckeladapterprotein för TLR3/7/8-signalering28. Knockout of Trif påverkar inte heller MVP-aktivitet, vilket förstärker uppfattningen att ovanstående TLR inklusive TLR7 inte spelar någon större roll i att förmedla cellulära svar på MVP. Flera Sting-agonister har använts vid utveckling av cancervaccin inklusive cykliska dinukleotider och små och stora molekylära föreningar34e37. Sådana Sting-agonister måste tillsättas som externa adjuvanser under vaccinberedningen, vilket tillför ytterligare ett lager av komplexitet till vaccinkompositionen. Dessutom kan den externt tillsatta Sting-agonisten orsaka oönskade biverkningar när den väl separeras från mRNA-komplexet. Som jämförelse fungerar vår MVP som en självadjuvans och fungerar i samband med ett cancervaccin, eftersom ingen av de enskilda komponenterna i vaccinet inklusive EDOPC kan främja cytokinuttryck. Intressant nog kan den katjoniska fosfolipiden EDOPC inte ersättas med icke-fosfolipiden DOTAP som också är positivt laddad. Det är spännande att spekulera i den potentiella mekanismen för skillnaden mellan dessa två katjoniska lipider. Det har dock dokumenterats att andra egenskaper hos en lipidmolekylkomponent, såsom hydrofobicitet, kan ha en djupgående inverkan på den övergripande funktionen hos en nanopartikel och dess leveranseffektivitet för nukleinsyror38. Därför måste försiktighet iakttas vid valet av de rätta molekylerna för att framställa ett fullt fungerande mRNA-vaccin. Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett potent mRNA-baserat terapeutiskt cancervaccin och tilldelat enskilda komponenter i vaccinet med deras funktionalitet. Dess verkningsmekanism skiljer sig ganska mycket från andra mRNA-plattformar som används för profylaktiska och terapeutiska ingrepp. Kunskapen från den aktuella studien kommer definitivt att styra framtida utveckling av ytterligare mRNA-terapi.

Figur 4 Främjande av medfödda immunsvar genom MVP. (AeD) BMDCs behandlade med 1 mg/ml imiquimod, 1 mg/ml mRNA-ekvivalent kärna, vehikel eller MVP i 24 timmar. IFN-b, TNF-a, IL-1b och CCL5 nivåer mättes med ELISA. (E och F) IFN-b och TNF-a uttryck av BMDCs härledda från vildtyp och gen knockout (KO) möss. BMDCs behandlades med de angivna reagensen i 24 timmar. IFN-b och TNF-a mättes med ELISA. (G) IFN-b i BMDCs härledda från vildtyp och Sting knockoutmöss. BMDCs behandlades med 20 mg/ml cGAMP, 1 mg/ml mRNA-ekvivalent kärna, vehikel eller MVP i 24 timmar. Fordon (DOTAP): förberedd genom att ersätta EDOPC med DOTAP; vehikel (utan protamin): framställd genom att utelämna protamin. ND: ej detekterbar. (H) TNF-a i BMDCs härledda från vildtyp och Mavs knockoutmöss. BMDCs behandlades med 1 mg/ml mRNA-ekvivalent kärna, vehikel eller MVP i 24 timmar. Fordon (DOTAP): förberedd genom att ersätta EDOPC med DOTAP; fordon (DOPC): framställt genom att ersätta EDOPC med DOPC. Data presenteras som medel-SEM (nZ3). ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, inte signifikant.

Figur 5 Antitumörimmunsvar hos Sting och Mavs knockoutmöss. (AeD) Minskad DC- och T-cellsaktivering i Sting knockout-möss. Både vildtyps- och Sting-knockoutmöss behandlades med OVA-mRNA-inkapslad MVP, och lymfkörtlar samlades in 48 timmar senare för DC- och T-cellsmätning. (EeH) Reducerade IFN-g-uttryckande T-celler i mjälte och lymfkörtlar från Sting knockout-möss. Både bilder av fläckar och kvantitativa analyser visas. (IeL) Ingen påverkan på T-cellsaktivitet i Mavs knockout-möss. Både vildtyps- och Mavs knockoutmöss behandlades med PBS-kontroll eller OVA-mRNA-inkapslad MVP, och lymfkörtlar samlades in 48 timmar senare för mätning av CD44þCD8þ minnes T-celler (I), OVA257e264-MHCI dextramer-positiv CD8þ T-celler (J) och antal IFN-g-producerande celler (K ​​och L). Data presenteras som medel-SEM (n Z 3 eller 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, inte signifikant.

Figur 6 Stingberoende antitumörimmunitet. (A och B) Analys av IFN-g-uttryckande T-celler i lymfkörtlar och tumörvävnader efter vildtyp- och Sting-knockoutmöss som bär B16-OVA-tumörer behandlades med OVA-mRNA-inkapslad MVP. Möss behandlades på dag 3 och 1 0 och lymfkörtlar och tumörer samlades in på dag 15. Enstaka celler analyserades med flödescytometri. (C) Hämning av tumörtillväxt i vildtyp och Sting knockout möss. Möss behandlades med PBS-kontroll eller MVP på dag 3 och 10. Data presenteras som medel-SEM (n Z 5). *P < 0,05; ****P < 0,001; ns, inte signifikant. (D) Schematisk bild av MVP-stimulering av signaltransduktionsvägar som leder till cytokinproduktion i DC. Medan stimulering av IFN-b-uttryck uteslutande förmedlas av STING, finns det flera faktorer inklusive MAVS som medierar TNF-a- och IL-1b-uttryck.

Referenser

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, et al. Effekten av mRNA-1273 SARS-CoV-2-vaccinet vid slutförandet av blindfas. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, et al. Säkerhet och effekt av en tredje dos av BNT162b2 Covid-19-vaccin. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. Att övervinna cellulära barriärer för RNA-terapi. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Lipidnanopartikelsystem för att möjliggöra genterapier. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, et al. Lipopolyplex potentierar antitumörimmuniteten för mRNA-baserad vaccination. Biomaterial 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, et al. Systemisk leverans av modifierat mRNA som kodar för herpes simplex virus 1 tymidinkinas för riktad cancergenterapi. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, et al. Systemisk RNA-leverans till dendritiska celler utnyttjar antiviralt försvar för cancerimmunterapi. Nature 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L, et al. Virushärmare mRNA-vaccin för cancerbehandling. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA-vacciner ny era inom vaccinologi. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, et al. CAR T-celler produceras in vivo för att behandla hjärtskada. Science 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Finns det något hopp om ett funktionellt botemedel mot hiv i mRNA-vaccinernas era? Virus 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Struber M, Kirchhoff S, Bukur T, et al. Ett icke-inflammatoriskt mRNA-vaccin för behandling av experimentell autoimmun encefalomyelit. Science 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNA-vaccin för cancerimmunterapi. Mol Cancer 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, et al. mRNA i cancerimmunterapi: bortom en antigenkälla. Mol Cancer 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Personliga RNA-mutanomvacciner mobiliserar polyspecifik terapeutisk immunitet mot cancer. Nature 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M, et al. Ett RNA-vaccin driver immunitet vid kontrollpunktshämmare-behandlat melanom. Nature 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, et al. Aktivt personligt anpassat vaccinationsförsök för nydiagnostiserat glioblastom. Nature 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Immunterapi mot cancer. Ett vaccin mot dendritiska celler ökar bredden och mångfalden av melanom neoantigen-specifika T-celler. Science 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Neoantigenvaccin genererar intratumorala T-cellsvar i fas Ib glioblastomförsök. Nature 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, et al. Synergistisk aktivering av antitumörimmunitet med ett partikelformigt terapeutiskt vaccin. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Att göra medfödd känsla av mRNA-vaccinadjuvansitet. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Messenger RNA-baserade vacciner med dubbel aktivitet inducerar balanserade TLR-7-beroende adaptiva immunsvar och ger antitumöraktivitet. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Undertryckande av RNA-igenkänning av Toll-liknande receptorer: effekten av nukleosidmodifiering och RNAs evolutionära ursprung. Immunity 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, et al. IL-1 och IL-1ra är nyckelregulatorer för det inflammatoriska svaret på RNA-vacciner. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M, et al. Mekanismer för medfödd och adaptiv immunitet mot PfizerBioNTech BNT162b2-vaccinet. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Ersättningen av hjälparlipider med laddade alternativ i lipidnanopartiklar underlättar riktad mRNA-leverans till mjälten och lungorna. J Control Release 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, et al. Litet störande RNA för cancerbehandling: övervinner hinder vid leverans. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Typ I interferonsvar och medfödd immunförnimmelse av cancer. Trends Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Mitotisk progression efter DNA-skada möjliggör mönsterigenkänning inom mikrokärnor. Nature 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. DNA-skada primerar typ I-interferonsystemet via den cytosoliska DNA-sensorn STING för att främja antimikrobiell medfödd immunitet. Immunitet 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helikas DDX41 känner av intracellulärt DNA som medieras av adaptern STING i dendritiska celler. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, et al. Omfattningen av terapeutisk STING-aktivering bestämmer CD8þ T-cellsmedierad antitumörimmunitet. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Mönsterigenkänning och signaleringsmekanismer för RIG-I och MDA5. Front Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. STING-agonistformulerade cancervacciner kan bota etablerade tumörer som är resistenta mot PD-1-blockad. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, et al. Direkt aktivering av STING i tumörmikromiljön leder till potent och systemisk tumörregression och immunitet. Cell Rep 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, et al. Leverans av mRNA-vacciner med heterocykliska lipider ökar antitumöreffektiviteten genom STING-medierad immuncellsaktivering. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y, et al. Ett STING-aktiverande nanovaccin för cancerimmunterapi. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Transfektionsaktivitet av binära blandningar av katjoniska o-substituerade fosfatidylkolinderivat: den hydrofoba kärnan modulerar starkt fysikaliska egenskaper och DNA-leveranseffektivitet. Biophys J 2006;91:3692e706.