Ett extrakt från Oenothera Biennis Cell Cultures utrustat med hudanti-åldrande aktivitet förbättrar cellmekaniska egenskaper
Jul 06, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Abstrakt:Hudens åldrande är en mycket välkänd process som medför en gradvis försämring av hudens mekaniska egenskaper på grund av en nedgång i produktionen av extracellulära matrismaskiner och en samtidig förändring i sammandragningsprocessen. För att bromsa denna utveckling är det avgörande att inducera uttrycket av flera proteiner som kan främja bildning av elastiska fibrer och vävnadsreparation. Här har det vattenhaltiga cellkulturextraktet Oenothera bi-Ennis undersökts ur kemisk synvinkel, och sedan testades det in vitro, i cellen och ex vivo experiment som ett tillsatsmedel för att motverka hudens åldrande. visat att Oenothera biennis-extraktet kunde, genom att öka MYLK-genuttrycket, främja matrixkollagenkontraktion, aktinpolymerisation och produktion av essentiella ECM-proteiner.
Nyckelord:metabolomik; molekylära nätverk; hydrofilt extrakt av Oenothera biennis cellkulturer; matrix kollagen kontraktion; hudens åldrande
1. Introduktion
Hudens åldrande är en mycket välkänd process som induceras av endogena och exogena faktorer. Under senescensen degenererar alla kutana fysiologiska funktioner obönhörligt, och denna progressiva försämring skadar huden [1]. I själva verket tappar huden gradvis sina mekaniska egenskaper, både på grund av en nedgång i produktionen av extracellulära matrisproteiner och på den samtidiga förändringen i kontraktionsprocessen [2]. De viktigaste extracellulära matriskomponenterna i dermis är proteiner som kollagen I och IIl, laminin, periostin, tenascin, elastin, fibronektin och proteoglykaner, eftersom deras relativa mängd och veckningstillstånd spelar en nyckelroll i interaktionen mellan cellerna och matris som garanterar en korrekt struktur av dermis [3]. Till exempel, i det extracellulära utrymmet, spelar fibronektin en nyckelroll i matrissammansättningen eftersom det bildar en bro mellan cellytreceptorer (t.ex. integriner) och kollagen, proteoglykaner och andra fokala adhesionsmolekyler. Lamininer bidrar till strukturen av den extracellulära matrisen och modulerar adhesion, differentiering, migration, fenotypstabilitet och resistens mot apoptos. Elastin är också viktigt för cellvidhäftning och cellmigration, och det har förmågan att delta i cellsignalering. Fibrilliner samverkar på liknande sätt nära med tropoelastin och integriner, och de är viktiga för sammansättningen av elastiner till elastiska fibrer. Fabulous är tätt förbunden med basalmembran, elastiska fibrer och andra komponenter i den extracellulära matrisen och deltar i bildningen av elastiska fibrer. Tenasciner är extracellulära matrix(ECM)polymorfa glykoproteiner som förmedlar fibrotiska processer för att möjliggöra effektiv vävnadsreparation [4]Dessutom är hudens kontraktila process också baserad på verkan av fibroblaster, de mest förekommande cellerna i hudmatrisen; de sätter upp rätt spänning av huden, främjar kontakterna mellan matriskomponenterna, som i sin tur är ansvariga för dermis kompakthet, densitet och motstånd. På grundval av deras cellulära cytoskelettorganisation finns aktin-myosinmaskineriet, som bestämmer potentiella förändringar i deras form och i deras struktur. Faktum är att bindningen av aktin och myosin inducerar en mer kompakt cellulär konformation, vilket för fibrerna närmare varandra, garanterar utvecklingen av frisk och kompakt vävnad och förhindrar fibersönderdelning som resulterar i rynkor. Fibroblasternas förmåga att dra ihop sig och sträckas går dock delvis förlorad under åren eftersom de åldrade cellerna inte längre kan agera korrekt och fullständigt. På grund av en lägre mekanisk kraft går fibroblaster till en mer rundad och förvrängd morfologi än den långsträckta [5]. Vissa bevis har visat att syntesen av ett protein som kallas MYLK (Myosin Light Chain Kinase) minskade avsevärt under åldrandet. MYLK har en kinasaktivitet som utövas av fosforylering av en specifik myosindomän, benämnd den myosinreglerande lätta kedjan, som kan inducera aktinbindning och därför främja cellkontraktilitet [6].bioflavonoiderNär en låg aktivitet av detta protein detekterades, till exempel på grund av ett lägre proteinuttryck, mättes en motsvarande minskning av matrixkollagenkontraktion [7] och aktinpolymerisation [8]. Aktincytoskelettsammansättning är kopplad inte bara till cellrörelserna och förmågan att dra ihop sig utan också till produktionen av ECM-matrisprotein genom aktiveringen av TGF-II-receptorn (TGFBRII)[9]. TGFBRII tillhör TGF-cellytreceptorkomplexet som, genom aktivering av Smad-transkriptionsfaktorer, reglerar uttrycket av många gener som kodar för komponenter i ECM, inklusive kollagen, lamininer, fibronektin och proteoglykan [10]. Demontering av aktincytoskelett nedreglerar TGF-Il-receptorn. Denna nedreglering minskar i sin tur produktionen av kollagen och andra ECM-proteiner, vilket resulterar i en förlust av hudmassa och skör hud.
Faktum är att många kosmetiska ingredienser syftar till att stimulera syntesen av flera nyckelfaktorer som är ansvariga för att upprätthålla den korrekta kompaktheten av den dermala matrisen och en bra hudkontraktion. I detta scenario är extrakten från arten Oenothera biennis (nattljus), tillhörande familjen Onagraceae, av stort intresse på grund av deras innehåll av bioaktiva föreningar som fettsyror, fenoler, triterpener och flavonoider, som redan har varit testade vid behandling av olika hudpatologiska sjukdomar [11]. Vissa av dessa metaboliter rapporteras i sin tur undertrycka inflammationsmediatorer såsom interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), cytokiner och tumörnekrosfaktor (TNF-)[12 ]. Dessutom skyddade extrakt av luftdelar från Oenothera biennis HaCaT-celler från H, O,-inducerad DNA-skada och celldöd genom att blockera cellskador på grund av oxidativ stress genom en mekanism som involverade ROS-eliminering och Nrf2/HO-1 signalväg [ 13]. Dessutom har Oenothera biennis olja, som är rik på lipider, föreslagits som en bra fuktighetskräm för eksempatienter tack vare dess förmåga att lätt penetrera huden [14]. Tyvärr kan extraktberedningar av odlade växter, som sysslar med kosmetika, ha vissa nackdelar: för det första kan de vara förorenade av giftiga eller allergiframkallande ämnen såsom bekämpningsmedel, gödningsmedel eller föroreningar; sedan utsätts växterna för oförutsägbar stress och säsongsbetonade förhållanden eller variationer i näringstillgänglighet, vilket kan inducera syntesen av oväntade metaboliter. Extrakten kan dessutom innehålla patogena mikroorganismer, vilket minskar kvaliteten på slutprodukterna. Alla dessa nackdelar konvergerar i sin tur till risken att ha ett varierande innehåll av sekundära metaboliter och låg reproducerbarhet. För att övervinna dessa svagheter blir användningen av växtcellskulturer i kosmetika mer populär och mycket uppskattad, eftersom den övervinner många av de ovan nämnda nackdelarna [15].
I denna studie har ett hydrofilt extrakt av Oenothera biennis-cellkulturer (ObHEx) helt karakteriserats av avancerade masspektrometriska tillvägagångssätt, assisterad av bioinformatik, och testats i flera biokemiska och biologiska analyser. Blandningen innehåller bioaktiva föreningar av främst lignaner och triterpener, såsom arjunolsyra och asiatisk syra, som tidigare har associerats med pro-kollagen I-produktion i humana fibroblaster [16,17]. Extraktet undersöktes för dess förmåga att öka uttrycket av MYLK, främja matrixkollagenkontraktion, aktinpolymerisation och produktion av TGF-reglerade ECM-proteiner, som gynnar sammandragningen av dermis, och därmed bromsar hudens åldrande.
2. Resultat
2.1.Kvalitativ och kvantitativ analys av det vattenlösliga extraktet av Oenothera Biennis cellkultur
UPLC-MS/MS-analys av ObHEx utfördes och högupplösta spektrometriska data utnyttjades för den kemiska karakteriseringen med hjälp av Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), ett webbaserat masspektrometrisystem som hjälper till med identifiering och anteckning av naturliga produkter (NPS)[18]. Det syftar till att vara en kunskapsbas med öppen tillgång för gemenskapsomfattande organisationer och för delning av rå, bearbetad eller kommenterad fragmenteringsmasspektrometridata (MS/MS). Specifikt utfördes GNPS-spektralbibliotekssökningar och ett funktionsbaserat molekylärt nätverk (FBMN)-jobb: den första analysen gjorde det möjligt för oss att identifiera naturliga föreningar, jämföra deras MS/MS-spektra med de för strukturellt karakteriserade metaboliter, den andra till grupprelaterade NPs inom ett nätverk eftersom liknande MS/MS-fragmenteringsmönster uppvisades av strukturellt liknande molekyler [19]. Som visas i figur 1 och tabell 1 identifierades många NPS utan tvekan som tillhörande flera klasser av sekundära metaboliter, främst lignaner (Salvador aside och liriodendron) och triterpener (muriatinsyra, ariunolsyra, asiatisk syra och hederagenin). Kemiska arter som inte identifierats av GNPS tilldelades i enlighet med litteraturen.
Som ett exempel på användningen av GNPS har nätverket från FBMN-analys rapporterats i figur 2a, vilket visar att ObHEx innehöll många andra okarakteriserade triterpener relaterade till muriatinsyra (18, m/z 503.3389, RT 21.89 min: muriatinsyraidentifiering har bekräftats genom en jämförelse med dess analytiska standard). Till exempel identifierades olika tidigare okarakteriserade arter vid m/z 701 och 665 som glykosylerade former relaterade till muriatinsyra eller dess isomerer, hydratiserade eller inte med två molekyler H2O
Vidare rapporterade joner vid m/z 729, 703, 699,687,685 respektive 683 härledda från glykosyleringen plus två molekyler H, O av arter vid m/z531, 505,501, 489,487 och 485: deras entydiga identifiering har inte uppnåtts. de antas alla vara triterpener, relaterade till muriatinsyra eller dess kongener, på grund av deras MSMS-fragmenteringsväg. Nyligen isolerades många triterpener med m/501 och 485 från en annan art av Oenothera, Oenothera Maritima, och deras struktur har har klarlagts på grundval av spektroskopiska data, vilket därmed väl korrelerar med våra resultat [20].
Cistanche kan anti-aging
FBMN-analys gav också information om metaboliterna vid m/z 617.3862 (MS2-joner vid m/z 453,145 och 119) närvarande i molekylära nätverk som visas i figur 2b och som inte rapporterats i litteraturen för Oenothera-arter. Detta m/z-värde och dess fragmentering överensstämmer med 2-OEp-kumaroylapostolsyra eller dess isomerer, vilket åtminstone bevisar närvaron av triterpenkumaroyl och även koffeoylestrar i extraktet. Faktum är att MS-spektra av arter vid m/z 649 (RT 25,72 och 27,19) visade närvaron av joner vid m/z 179, 161 och 135 på grund av klyvningen av koffeinsyradelen, medan MS2-spektra för de andra arterna rapporterade i figur 2b vid m/z 633 (RT 26.88, 27.20, 28.12 och 28.43), 649 (RT24.18, 24.65, 24.83) och 661 (RT 30.28) visade joner vid m/z 145 och 119 för kumaroyldel.
After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911) inom de testade intervallen. Dessutom indikerade gränsen för detektion (LOD) och gränsen för kvantifiering (LOO) att de använda metoderna kännetecknades av hög känslighet. De erhållna resultaten från den kvantitativa analysen (tabell 3) visade att liriodendron och hederagenin var de huvudsakliga representerade lignan respektive triterpen.
2.3. Analys av MYLK-genuttryck i HDF
Aktiviteten av ObHEx testades i HDF på uttrycket av MYLK-genen, som kodar för kinaset som är ansvarigt för den lätta kedjans fosforylering av myosin (Figur 3a). Resultaten visade att behandlingen med extraktet vid båda koncentrationerna ökade MYLK-genuttrycket med cirka 50 procent, liknande den positiva kontrollen TGF-.
2.4. Analys av kontraktionskapaciteten hos en kollagenmatris
För att utvärdera aktiviteten hos ObHEx på kollagenfibrernas kontraktila kapacitet använde vi HDF dispergerad i kollagengelskivor [21]. Som visas i figur 3b inducerade extraktet, vid den lägre koncentrationen, en signifikant ökning av kontraktionen av kollagenskivan, vilket antyder en potentiell effekt på kollagenets fasthet. Behandlingen med ML7(1-(5-jodonaftalen-1-sulfonyl)-1H-hexahydro-1,4-diazepin), en MYLK-hämmare, avskaffade denna ökning, vilket indikerar att både extraktet och TGF- verkar genom MYLK för kollagendiskkontraktion.
2.5. Mätning av aktinpolymerisationsnivå
ObHEx förmåga att stimulera aktinpolymerisation undersöktes genom att mäta nivån av polymeriserat aktin i cellerna, behandlade med extraktet och den positiva kontrollen TGF-, enbart och i närvaro av ML7. Som visas i figur 3c gav behandlingen med båda koncentrationerna av extrakten en ökning av mängden polymeraktin med cirka 50 procent, jämfört med 33 procent av TGF-.köpa cistancheÅterigen avskaffade förinkubationen med ML7com denna effekt helt, vilket tyder på involveringen av MYLK i polymerisationen av aktinfilament.
2.6. Analys av TGF RII/SMAD Pathway i HDF
För att verifiera om ökningen av aktinpolymerisation och kollagenkontraktion av celler behandlade med ObHEx också var associerad med aktivering av signaltransduktionsvägen medierad av TGF RII, observerade vi först uttrycket av TGF RII-genen och transfekterade sedan HDF med SMAD {{ 0}}luciferasreporterplasmid och utvärderade ökningen av luciferasaktivitet som svar på ObHEx-behandling. Resultaten, rapporterade i figur 3d,e, indikerade att behandlingen med ObHEx vid 0,002 procent och 0,006 procent ökade uttrycket av TGF RII på ett sätt som liknar den TGF- som användes som positiv kontroll och parallellt, luciferasaktiviteten kopplad till SMAD ökade med 80 respektive 40 procent. En signifikant signalreduktion erhölls när cellerna behandlades med ML7, vilket också visar att denna aktivitet var kopplad till MYLK.
2.7. Analys av Pro-Collagen I, Tropoelastin och Periostin
Som en konsekvens av TGF RII-signaltransduktionsaktivering analyserade vi syntesen av de viktigaste extracellulära matrisproteinerna som prokollagen typ I, tropoelastin och periostin i HDF som behandlats med ObHEx vid 0.002 procent. Som visas i figur 3f ökade ObHEx produktionen av de indikerade proteinerna med cirka 98 procent, 75 procent respektive 51 procent, liknande den positiva kontrollen TGF-. Åtgärderna utfördes med ELISA-analys, med användning av specifika antikroppar mot pro-kollagen I, tropoelastin och periostin.
2.8. Analys av MYLK, Fosfo-Myosin, Kollagen I och Tropoelastin på Ex-Vivo hudexplantat
Som visas i figur 4a-c producerade ObHEx en signifikant ökning av produktionen av MYLK och fosforylerat myosin i humana hudexplantat.
Kollagen I och tropoelastin-induktion analyserades också i hudexplantat förbehandlade med ObHEx och sedan behandlade med hydrokortison i 8 dagar för att simulera kronologiskt åldrande [22]. Behandlingen med hydrokortison minskade mängden kollagen I och tropoelastin med mer än 100 procent, och närvaron av 0,002 procent ObHEx återställde mängden tropoelastin med nästan 91 procent och kollagen med 120 procent, jämfört med askorbat användes som en positiv kontroll (Figur 4d-f). Detta tyder på en potentiell anti-aging effekt av ObHEx, särskilt effektiv för att öka fastheten i huden genom att verka på de dermala matrixkomponenterna.
2.9.Atomic Force Microscopy (AFM) i hudexplantat
För att samla in mer information om hudens biomekaniska egenskaper som främjas av behandlingen med ObHEx, utvärderade vi elasticitet, en inneboende mekanisk egenskap hos hudprover i termer av deras Youngs moduli [23]. Som beskrivs i avsnitt 4, för att beräkna elasticitetsmodulen, både på behandlade och obehandlade hudprover, samlade vi kraftkurvor med ett Atomic Force Microscope (AFM) och passade dem med Hertz-modellen [24,25]. Som visas i figur 5 hade behandlingen av hudproverna med extraktet lägre Youngs modulvärden jämfört med obehandlade prover, vilket tyder på en förbättring av hudens elastiska egenskaper. I synnerhet avslöjade obehandlade hudprover ett medelvärde för Youngs modul på 0.37±0.15 GPa, medan hudprover behandlade med ObHEx visade ett lägre medelvärde på 0.{{11 }}7±0,02 GPA. Youngs modulvärden för hudproverna var i enlighet med litteraturen [26-28].
3. Diskussion
Växtcellskulturer utgör det mest lovande tillvägagångssättet för hållbar produktion av sekundära växtmetaboliter av kommersiellt intresse, och erbjuder en kontinuerlig tillförsel av material med hjälp av storskalig odling och utgör ett hållbart och miljövänligt system [29,30]. Extrakt från växtcellkulturer har funnit lovande tillämpningar inom hälso- och sjukvårds- och kosmetiksektorerna, eftersom de har några relevanta fördelar; (i) de innehåller metaboliter biosyntetiserade under kontrollerade tillväxtlaboratorieförhållanden; (i) de härrör från standardiserade produktionsprocesser, vilket garanterar samma kvalitativa och kvantitativa egenskaper hos den erhållna arten; (ii) extrakten är fria från föroreningar såsom mikroorganismer, herbicider, bekämpningsmedel och fungicider; (iv) de är oberoende av geografiska eller miljömässiga fluktuationer och växtarterna kan bevaras för framtida generationer. I den här tävlingen undersöktes ett vattenhaltigt extrakt av cellkultur från Oenothera biennis (ObHEx) som en lovande källa till bioaktiva molekyler som är utrustade med anti-aging-aktivitet. Faktum är att ObHEx har undersökts av högupplösta UPLC-MSMS-analyser i kombination med bioinformatiska metoder för att uppnå en bred strukturell karakterisering. Sammansättningskarakterisering har realiserats huvudsakligen genom att använda GNPS för att påskynda identifieringsprocessen, jämföra MS/MS-spektra med de för strukturellt karakteriserade metaboliter, och dessutom avslöja nya oväntade arter, gruppera liknande NPs i ett nätverk. Dessutom jämfördes retentionstid, noggranna massmätningar och MS2-analyser med standarder, och alla data matchades med litteraturen. Bioaktiva lignaner och triterpener, såsom Salvador aside, liriodendron, my-anthemic acid, arjunolsyra, asiatisk syra och hederagenin identifierades. Liriodendron [31] och muriatinsyra [32] uppvisade stark antioxidantaktivitet, medan hederagenin visade hudanti-aging egenskaper på grund av en minskning av cellulär oxidation och aktivering av proteasomfunktion [33]. Emellertid ansågs arjunolsyra och asiatiska syror vara huvudsakligen ansvariga för några av följande testade aktiviteter, eftersom de stimulerar kollagen I-syntes. Det har faktiskt visat sig att ObHEx förbättrade hudens biomekaniska egenskaper, vilket mestadels beror på den relativa mängden av de olika komponenterna i ECM och på hur fibroblasterna kan dra ihop sig och ge rätt spänning till hudfibrerna.cistanchFaktum är att ObHEx främjar kollagenmatriskontraktion och aktinpolymerisation genom att öka uttrycket av MYLK-genen, vilket förstärker kontraktionskraften hos dermala fibroblaster. Montering av aktincytoskelett uppreglerar TGF-typ II-receptorn och, i överensstämmelse med stimuleringen av TGF-/Smad-signalering, ökar nivåerna av TGF-reglerade ECM-proteiner. Faktum är att ObHEx inducerar produktionen av typ I kollagen, periostin och tropoelastin. Därför gör alla dessa egenskaper den till en bra lovande ingrediens som kan användas i kosmetiska formuleringar för att bekämpa den åldersrelaterade förlusten av hudens fasthet och elasticitet. Detta antagande stöddes av resultaten som erhölls i AFM-analysen, som visade att behandlingen av hudskivor med ObHEx gav en förbättring av hudens mekaniska egenskaper, upptäckt som en minskning av Youngs modul, vilket indikerar en signifikant minskning av hudens stelhet och stelhet.
4. Material och metoder
4.1. Växtvävnadskulturer och extraktberedning
Oenothera biennis-växter tillhandahölls av GEEL Floricultura ss och var av italienskt ursprung (utan att tillämpa Nagoya-protokollet). Cellkulturer erhölls från löv av Oenothera biennis-växter genom att inducera proliferation av meristematiska celler på fasta agarplattor tills förhårdnader erhölls. Cellerna överfördes till det flytande tillväxtmediet (Gamborg B5, kompletterat med 24 diklorfenoxiättiksyra (1 mg/L), adenin (1 mg/L) och kinetin (0.01 mg/L)). Sedan odlades cellerna som suspensionskulturer under orbital skakning. När väl kulturerna på cirka 150 g/L erhållits, samlades cellerna upp och lyserades i en fosfatbuffert (PBS) vid pH 7,4 för att framställa ett vattenlösligt extrakt, som lyofiliserades. Pulvret löstes i vatten eller cellodlingsmedia vid lämpliga koncentrationer för testning.
4.2. UPLC-MSMS-analys för kemisk karakterisering
ObHEx(5{{10}} mg/ml) preparerades och utsattes för en tvåfasisk butanol/vattenextraktion. Butanolfraktionen torkades och löstes i metanol (10mg/ml) före UPLC-MS/MS-analysen. Den utfördes på en Q-Exactive Classic masspektrometer från Thermo-Scientific (Waltham, MA, USA) utrustad med ett Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC-system. Alla kromatografiska körningar utfördes med en Phenomenex Luna③C18 100 A (150×2,0 mm, partikelstorlek 3 μm) kolonn vid 40 grader C och en flödeshastighet på 0,200 ml/min. Injektionsvolymen var 5 μL. Den mobila fasen bestod av A (vatten från ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, Storbritannien med 0,1 procent ättiksyra) och B (100 procent acetonitril från ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, Storbritannien) med en gradienteluering av 5 procent B vid0-5min,5-14 procent B vid5-8 min,14-32 procent B vid 8-11 min, 32-95 procent Bat {{ 26}}min,95-98 procent Bat32-33 min,98 procent B vid 33-38min,98-5 procent Bat38-39 min och 5 procent B vid { {34}} min. Alla MS- och MSMS-analyser utfördes i ESI-negativt läge med mantelgasflödet vid 30 (godtyckliga enheter), hjälpgasflödet vid 5 (godtyckliga enheter), sprayspänningen vid 3,2 kV och kapillärtemperaturen och den extra gasvärmarens temperatur vid 300 grader. Data förvärvades med ett Full MS/dd-MS2 (Top5)-läge. Fullständiga MS-inställningar var: upplösningen 70 000, AGC-målet på 1×106, maximal IT på 200ms, och kan variera från 100 till 800 m/z.dd-MS2-inställningarna var: upplösning på 17.500, AGC-mål på 2×105, maximalt IT på 65 ms, isoleringsfönster på 1,5 m/z och NCE på 35.
erhållna verifierades manuellt. mzXML-data bearbetades med Mzmine 2.53 innan det funktionsbaserade molekylära nätverksjobbet (FBMN) på GNPS. Massdetekteringssteget utfördes med centroidmassdetektorn samtidigt som ljudnivån hölls på 5 × 1{{10}}3. Kromatogrambyggnaden för Automated Data Analysis Pipeline (ADAP) realiserades med följande inställningar: min gruppstorlek i ett antal skanningar på 5, gruppintensitetströskel på 5 × 1{{20}}³, min högsta intensitet på 5× 10 plus ,m/z tolerans på 0.01 m/z eller 10 ppm. Kromatogramdekonvolutionen uppnåddes med hjälp av Wavelets(ADAP) som en algoritm, S/N-tröskel på 3, min funktionshöjd på 1 × 105, koefficient/area-tröskel på 5, toppvaraktighetsområde 0.{{ 18}}.00 min och RT-vågområdet 0.00-0.05. Kromatogram avisotopades med användning av isotoptoppar-grouperalgoritmen med en m/z-tolerans på 0,001 m/z eller 5,0 ppm och en RT-tolerans på 0,10 min. FBMN-jobbet utfördes med användning av modermassatolerans på 0,02 Da och en MS4-fragmentjontolerans på 0,02 Da. Kanter filtrerades för att ha en poängtröskel på 0,7 och ett minimum av 2 matchade toppar. Dessutom sattes det maximala antalet grannnoder för varje nod till 10.
4.4. Kvantitativ analys av lignaner och triterpener
Samma UPLC-förhållanden som rapporterats för den kvalitativa analysen användes för den kvantitativa analysen av lignaner, medan de för triterpener optimerades för att separera två par isomerer, arjunolsyra och asiatisk syra. Analysen utfördes på en Q-Exactive Classic masspektrometer som tidigare beskrivits. Separationen utfördes av en Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2,1 mm, partikelstorlek 5 μm）. Den mobila fasen bestod av A(5 mM vattenlösning av ammoniumacetat, pH 9.00 justerad med ammoniumhydroxid) och B(100 procent acetonitril) med en gradienteluering av 17-28 procent B vid 0-18 min, 28-65 procent B vid 18-22 min, 65-75 procent B vid 22-26min,75-95 procent vid {{17 }}, 5 min, 95 procent vid 26, 5-30 min, 95-17 procent vid 30-30, 1 min, 17 procent vid 30,1-42 min. Flödeshastigheten var 0,450 ml/min och injektionsvolymen var 5 uL. För både lignaner och triterpener insamlades data med ett Full MS-SIM och PRM-läge. Fullständiga MS-SIM-inställningar var: upplösningen 70.000, AGC-mål på 3×106, maximal IT på 200 ms och kan variera från 200 till 800 m/z för lignaner och från 400 till 850 m/z för triterpener. PRM-inställningar var: upplösningen 70.000, AGC-mål på 2×10 grader, maximal IT på 100 ms, isoleringsfönster på 1,0 m/z och NCE på 35 för lignaner och 50 i det av triterpener.cistanche AustralienVi köpte Salvador åt sidan (#{{0}}XS172930) från Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Schweiz), liriodendron (#SMB00181) och arjunolsyra (#SMB00119) från Sigma -Aldrich (St. Louis, MO, USA), asiatisk syra (#0027) från Extrasynthese (Genay, Lyon, Frankrike) och hederagenin (#89706) från PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Tyskland). Myriantsyra var en gåva från Prof. Maria Valeria D'Auria, Neapels universitet. Kalibreringskurvorna erhölls genom att injicera standardlösningar i koncentrationsintervallet 0,25-25 μM för lignaner och 0,1-25 uM för triterpener. Både ren Salvador aside och liriodendron visade två LC-MSMS-toppar, troligen på grund av den kemiska jämvikten som etablerats i lösningen. Detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOO) för standarder bestämdes på basis av signal-brusförhållandet (S/N).
4.5. Hudcellskulturer och explantat
Humana dermala fibroblaster (HDF) bibehölls i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kompletterat med 10 procent av fetalt bovint serum (FBS; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) )i 95 procent luft, 5 procent CO, och fuktad atmosfär vid 37 grader. Hudexplantat, erhållna från huden på friska kvinnliga donatorer (i åldern 44-47) vid operationscentret Villa Cinzia (Neapel, Italien), odlades i 24-transwellplattor i DMEM/FBS plus antibiotika i luft- vätskeförhållanden vid 37 grader i 5 procent CO2 fuktad luft. Alla donatorer hade gett sitt skriftliga informerade samtycke till användningen av hudvävnaderna, enligt Helsingforsdeklarationen.
4.6. Cytotoxicitetstest
Cytotoxicitetstester baserades på användningen av MTT-föreningen [{{0}}(45-dimetyltiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid][34]. Cellerna odlades i 96-brunnsplattor i DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) odlingsmedium, kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum, under cirka 8 timmar. Efter behandling med ObHEx mellan 0.05 procent och 0,0004 procent (500 ug/mL och 4 ug/mL) under 48 timmar tvättades cellerna i PBS och inkuberades med 100 μL/brunn av "reaktionsbuffert" innehållande ∶ 10 mM Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO, 5 mM glukos och 0,5 mg/ml MTT kolorimetriskt substrat i buffert PBS vid pH 7,4. Efter 3 timmars inkubation vid 37 grader C i 5 procent CO, tillsattes 100 μL solubiliseringslösningar innehållande 10 procent Triton-X100, 0,1 N HCl i absolut isopropanol till varje brunn. Efter 16 timmars inkubation mättes den kolorimetriska reaktionen vid 595 nm med Victor3-plattläsaren (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
4.7. Analys av uttrycket av MYLK- och TGF6RII-genen i HDF
Per brunn odlades 1×10 grad av HDF i 6-brunnsplattor i DMEM vid 2 procent FBS, efter 24 timmar späddes FBS ytterligare till 0,5 procent, och celler behandlades med 0,002 procent och 0,006 procent koncentrationer av ObHExand TGF- 2.5ng/mL, följt av en inkubation på 2 timmar för MYLK och 48 för TGFRII. För RNA-extraktion användes "GenEluteM Total RNA Purification"-kit köpt av företaget Merck (Darmstadt, Tyskland). Efter de angivna behandlingarna tvättades cellerna med PBS, uppsamlades i lysbuffert och utsattes för extraktionsförfarandet som rapporterats. Proverna behandlades med DNas I (Ambion, Austin, TX, USA) vid 37 grader i 30 minuter för att avlägsna den genomiska DNA-kontaminanten. Från varje prov laddades 2 μL på gel 1 procent agaros i närvaro av denaturerande laddningsfärgämne i syfte att kvantisera mängden RNA med hänvisning till en specifik markör för RNA (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) har använts som programvara för kvantisering. Därefter retrotranskriberades 300 ng totalt RNA med användning av enzymet omvänt transkriptas (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Semi-kvantitativ RT-PCR utfördes med användning av som interna standarder paret av universella primers 18S primer/konkurrent (Ambion, Austin, TX, USA). PCR-produkterna separerades på 1,5 procent agarosgel, sågs med hjälp av Reliance-verktyget (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) och analyserades med densitometri med användning av Genetools programvara. Sekvenserna för primrarna som användes för amplifiering var följande: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.
4.8. Analys av kontraktionskapaciteten hos en kollagenmatris
När det gäller HDF-celler återsuspenderades 2,0× 10 grader i 5x DMEM-tillväxtmedium (Gibco, Waltham, MA, USA) i en 24-brunnsplatta och en 2 mg/ ml lösning av kollagen från bovin hud (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sattes till varje brunn. Lösningens pH justerades till 7,2. Plattan inkuberades vid 37 grader C under 45 minuter för att möjliggöra stelning av kollagengelen. DMEM kompletterat med 10 procent FBS och/eller ML7 25 uM, som MYLKprotein-hämmare, lades till senare. Efter 16 timmar rensades ML7 och ObHExat koncentrationen på 0,002 procent i DMEM med 2 procent FBS tillsattes. TGF- 2,5 ng/ml användes som en positiv kontroll. Den bildade kollagenskivan lossades omedelbart från brunnen genom att använda en steril mikrospatel för att främja dess sammandragning. Områdena på skivan för varje behandling mättes vid tidpunkten 0 och 5 timmar och analyserades med hjälp av programvaran Image.
4.9. Analys av graden av aktinpolymerisation
Därefter odlades 1,5×10 grad av HDF-celler per brunn i en 24-brunnsplatta och nästa dag tillsattes mediet med 2 procent FBS och Cytochalasin B, som är en hämmare av aktin polymerisation, vid 2 μM under 3{{1{{20}}}} min. Efter 30 minuter, på cellerna, tillsattes ObHEx (0,002 procent och 0,006 procent) tillsammans med TGF- 2.5 ng/mL, använd som en positiv kontroll, och ML7 25μM, som en negativ kontroll av MYLKenzymet. Efter 30 minuters behandling fixerades cellerna med 4 procent paraformaldehyd (PFA) i buffertfosfat under 30 minuter på is. Cellerna tvättades med PBS och permeabiliserades med en lösning av fosfatbuffert och Triton-X100 vid 0,2 procent under 30 minuter. Därefter inkuberades cellerna med en lösning av 0,4 μM falloidin konjugerad med rhodamin (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) i 1 timme i mörker.cistanche fördelarVid tidpunkten 0 och efter 18 timmar mättes fluorescensen vid 540/570 nm med hjälp av Victor3-plattläsaren (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). 4.10. Analys av SMAD2 Pathway
HDF-celler såddes med en densitet av 3 × 103 i 96-brunnsplattor och transfekterades efter 16 timmar med X-tremeGeneTM HP DNA-transfektionsreagens (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) med Smad2-reportervektor enligt tillverkarens instruktioner. Efter 24 timmar behandlades cellerna med ObHEx eller TGF- 2.5 ng/ml, ensamma eller i kombination med ML7 25 μM under 24 timmar. Vid slutet av inkubationen tvättades cellerna med PBS och aktiviteten av luciferas bestämdes genom att använda SteadyGlo Luciferase-analyssystemet (Promega Corporation, Madison, WI, USA) i Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA) , USA).
4.11. Analys av syntes av pro-kollagen I, tropoelastin och periostin
Per brunn odlades 8×103 HDF i 96-brunnsplattor och behandlades med 0.002 procent av ObHEx eller TGF 2,5 ng/ml. Efter 24 timmar bearbetades cellerna för ELISA med användning av monoklonal primär antikropp anti-prokollagen typ I(sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), följt av inkubation med den sekundära anti-mus-antikroppen märkt med peroxidas(170-6516, Biorad, Hercules, CA, USA). Supernatanterna av cellerna belades på en annan platta för detektering av tropoelastin och periostin med användning av anti-tropoelastin kaninantikropp (ab21600, Abcam, Cambridge, U eller anti-periostin musantikropp(sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology , Dallas, TX, USA), följt av inkubation med sekundär antikropp anti-kanin märkt med peroxidas (170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA). Den kolorimetriska reaktionen utvecklades genom att tillsätta 100 μL av en vattenlösning av OPD(O-fenylendiamin),0,35 mg/ml i 50 mM citratbuffert och 0,012 procent väteperoxid(H2O2). Efter 30 minuter mättes absorbansen vid 490 nm med användning av multipla läsaren Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
4.12. Ex Vivo-tester
ImmunoHistoFluorescens (IHF) av MYLK och fosforylerat myosin utvärderades i hudexplantat från {{0}} år gamla donatorer. Mänskliga hudexplantat skars med stansbiopsikyretter på 8 mm och odlades i 24-brunnsplattor i DMEM med 10 procent FBS och antibiotika. De erhållna stansarna behandlades med 0.002 procent och 0,006 procent av ObHEx under 24 timmar. De inkuberades i 15 procent sackaros, sedan i 30 procent sackaros och frystes slutligen. Därefter erhölls 10 μm sektioner med CM1520 kryostat (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Objektglas med kryosektioner hydratiserades under 30 minuter i PBS och placerades i en "blockerande" lösning (6 procent BSA, 5 procent serum, 20 mM MgCl, 0,2 procent Tween) under 1 timme. Kryosektioner inkuberades med den primära anti-MYLK-kaninantikroppen (1:100, GeneTex, Irvine, CA, USA) och antikroppens primära anti-fosfo-myosin (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) i 16 timmar kl. 4 grader. Objektglasen tvättades med PBS i 30 minuter och inkuberades sedan med den sekundära anti-kanin Alexa-Fluor 546-antikroppen (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) under 1 timme. Kärnorna färgades med DAPI(4',6-5 diamidino-2-fenylindol)1 ug/ml i PBS under 10 min. Bilderna förvärvades med ett fluorescensmikroskop och analyserades med ImageJ-mjukvaran. För IHF av tropoelastin och kollagen I användes hudexplantat från 36-åriga kvinnliga donatorer. Hudbiopsier erhölls enligt beskrivningen ovan och förbehandlades med 0,002 procent och 0,006 procent av ObHEx under 24 timmar. Stress med hydrokortison vid 10 ug/ml under 8 dagar tillsattes i närvaro av ObHEx. Efteråt frystes biopsier enligt beskrivningen ovan och sektionerna inkuberades med den primära antikroppen anti-tropoelastin kanin (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, Storbritannien) och anti-kollagen I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Tyskland) för 16h vid 4 grader. Bilderna analyserades enligt beskrivningen ovan och bilderna förvärvades och analyserades med ImageJ-mjukvaran.
4.13. Atomic Force Microscopy (AFM) i hudexplantat
Elasticiteten hos hudprover obehandlade och behandlade med ObHEx utvärderades för att säkerställa deras Youngs moduli med en metod i nanometrisk skala baserad på Atomic Force Microscopy (AFM), utvecklad inte bara för biologiska prover utan även för oorganiska. Dessa tillvägagångssätt är baserade på Hertz modellers antaganden och betraktade provet och konsolen som två fjädrar i en serie i en AFM-experimentmiljö. Kortfattat, hud ex-plant behandlad med 0.006 procent av ObHEx och obehandlade hudprover skars med kryostat i skivor på 10 um i tjocklek. Proverna förvarades vid 12 grader, tvättades sedan med PBS och undersöktes vid en fast temperatur och relativ luftfuktighet på 22 grader respektive 55 procent. Varje prov undersöktes av en NanoScope IIA AFM in Force Spectroscopy Single Mode med användning av en pyramidformad spets (RESP-20) med en fjäderkonstant på 0,9 N/m. För att beräkna Youngs modul förvärvades tio kraftkurvor i tio olika punkter av samma provyta. Varje kraftkurva är en kurva för avböjning (Volt) mot förskjutning (nm) och kan omvandlas till kurvor för kraft (N) kontra separation (nm). Faktum är att varje kraftkurva rapporterar lastnings- och lossningskurvor. De representerar spetsens trend med avseende på provet: när spetsen är långt ifrån provet när de kommer i kontakt och spetsen börjar avböja, och när den rör sig bort igen. Endast den första delen av dessa kurvor kan undersökas. Var och en av dessa delar av kurvorna passade med en standard Hertzian-modell, i synnerhet den typiska Hertzequation för en pyramidspets, för att extrahera elasticitetsmodulen känd som Youngs modul i GPa.
4.14. Statistisk analys
Alla värden som rapporterades var medelvärdet av tre oberoende experiment, som vart och ett utfördes i tre exemplar. Asteriskerna indikerar statistisk signifikans beräknad i enlighet med t-testet: *medelvärde Mindre än eller lika med 0.05;** p-värde Mindre än eller lika med 0. 01;***p värde Mindre än eller lika med 0,001.
Den här artikeln är extraherad från Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites