Anastatinderivat lindrar myokardischemi-reperfusionsskada via antioxidativa egenskaper

För ytterligare information, kontaktatina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt:(±)-anastatiner A och B är flavonoider isolerade från Anastatica hierochuntica. I en tidigare studie designades tjugofyra di- och tri-substituerade nya derivat av anastatiner och deras preliminära antioxidantaktiviteter utvärderades. I föreliggande studie studerades den skyddande effekten av myokardischemi-reperfusion (I/R) och den systematiska antioxidantkapaciteten hos 24 derivat ytterligare. Förening 13 var den mest potenta bland alla de studerade föreningarna, vilket ökade överlevnaden för H9c2-celler till 80,82 procent. Antioxidantförmågan hos förening 13 utvärderades i järnreducerande antioxidantkraft, 2,2'-azino-bis (3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra) radikalfångande och 2,2-difenyl{ {20}}picrylhydrazyl-analyser. Det observerades att förening 13 signifikant reducerade infarktområden och förbättrade histopatologiska och elektrokardiogramförändringar hos råttor med myokardial I/R-skada. Dessutom minskade förening 13 läckagehastigheten av serumlaktatdehydrogenas, kreatinkinas och malonyldialdehyd från råttmyokardvävnader och ökade nivån av glutation- och superoxiddismutasaktiviteter eftermyokard I/R-skadahos råttor. Sammantaget drog vi slutsatsen att förening 13 hade potenta kardioprotektiva effekter mot myokardial I/R-skada både in vitro och in vivo på grund av dess omfattande antioxidantaktiviteter.

Nyckelord: flavonoidderivat; H9c2-celler; hypoxi/återsyresättning; kardioprotektiva effekter

Klicka här för att få mer produktinformation

1. Introduktion

Ischemisk hjärtsjukdom (IHD) är en ledande dödsorsak över hela världen [1]. Snabb återställning av blodflödet kan effektivt förbättra det kliniska resultatet av sjukdomen; reperfusion är dock inte utan risk på grund av omfattningen av cellulär skada som orsakas av själva reperfusionen. Därför är det extremt viktigt att utveckla effektiva terapeutiska strategier mot myokardischemi-reperfusion (I/R) skada [2]. Mekanismen för myokardiell I/R-skada är mycket komplicerad; det inkluderar apoptos, oxidativ stress [3], kalciumöverbelastning [4] och inflammation [5].Oxidativ stresskan leda till apoptos genom olika signaltransduktionsvägar, inklusive signalreglerat kinas (ERK), c-Jun aminoterminalt kinas (JNK), aktivering av p53 (tumörprotein p53) och p66shc-variant. Dessutom kan överdriven produktion av reaktiva syrearter (ROS) orsaka irreversibel skada på cellmembran och cellulära molekyler, såsom DNA, nukleinsyror, protein, lipider och starta kedjereaktioner, vilket ytterligare skadar myokardvävnaden. Oxidativ stress [6], som orsakas av en obalans mellan bildning av fria radikaler och eliminering av ROS, spelar en viktig roll i patogenesen av I/R-skada I. Därför övervägs strategier som skyddar myokardiet från oxidativ stress i hanteringen. av myokard I/R-skada. Därför, på grund av deras potentiella förmåga att avlägsna fria radikaler, är antioxidantbaserade strategier fördelaktiga vid hanteringen av I/R-skada.

I kliniska studier används antioxidanter för att minskamyokard I/R-skadaär huvudsakligen indelade i två typer: enzymer och icke-enzymer. Enzymer såsom katalas och glutationperoxidas minskar koncentrationen av väteperoxid för att förhindra cellskador; icke-enzymatiska antioxidanter såsom vitamin E, Vitamin C, -karoten, etc., Försvagar vävnadens oxidativa stressrespons för att minska vävnadsskador och främja funktionell reparation. Tillämpningen av båda har dock för närvarande vissa begränsningar. Den stora molekylmassan hos enzympreparat bidrar inte till absorption [8]. Det finns också vissa problem med stabiliteten hos icke-enzymer, vilket leder till dålig stabilitet hos läkemedel, varför de lätt oxideras [9].Flavonoider, som ett slags icke-enzymatiska antioxidanter, har rapporterats ha en mängd potenta egenskaper, inklusive antioxidant, anti-cancer, antiapoptotiskt och kardiovaskulärt skydd [10]. De förhindrar bildningen av mycket reaktiva oxider och hämmar oxidativa reaktioner genom att avlägsna ROS, såsom väteradikaler och peroxinitrit. Anastatinerna A och B [11] är flavonoider med hepatoskyddande aktivitet. Anastasius A och B är aktiva komponenter i Anastatica hierochuntica (undertyp Anastatica, familjen Brassicaceae). För närvarande finns det mycket få rapporter om kemisk syntes och strukturella modifieringar av anastatinerna A och B. År 2003 isolerades aktiva föreningar från Anastatica hierochuntica och visade sig ha leverskyddande effekter mot D-galaktosamin-inducerad cytotoxicitet i primärodlade mushepatocyter. Nakashima och Eman har också visat att föreningarna utövar antioxidant- och anticanceraktiviteter in vitro. De farmakologiska effekterna av anastatinerna A och B och deras derivat, såväl som förfaranden för deras syntes, förblir dock oklara. Därför syftade vi till att syntetisera anastatinerna A och B och några av deras derivat och utvärdera dem för antioxidantaktiviteter vid hypoxi/återsyresättning(H/R) modell, som är effektiv för att studera myokard I/R-skada [12].

I en tidigare studie syntetiserade vi anastatinerna A och B och deras analoger och utvärderade deras antioxidantkapacitet med hjälp av en cellodlingsmodell av H2O2 (väteperoxid)-inducerad oxidativ skada13. Våra tidigare resultat visade att anastatinerna A och B har potenta hepatoskyddande aktiviteter som verkar vara relaterade till deras antioxidantförmåga.

I den aktuella studien syntetiserades anastatinerna A och B och 24 av deras derivat och utvärderades med avseende på antioxidantförmåga med hjälp av reducerande kraft och radikalfångande tester. Dessutom användes en enkel H9c2-cellmodell av H/R och en råttmodell av myokardial I/R-skada för att utvärdera de hjärtskyddande effekterna av föreningarna.

2. Resultat

2.1.H/R-modelletablering

Koncentrationen av Na2S, O4-behandling utvärderades som visas i figur 1A, och överlevnadsgraden för H9c2-celler reducerades med ökande Na2S2O4-koncentration. Under 4 mM Na, S, Oa minskade cellviabiliteten till mindre än 50 procent (13,7,25 respektive 43,4 procent vid återsyresättningstiden på 2,1 och 0 timmar) och nivån av cellviabilitetsminskning var lägre. Därför användes en 4 mM koncentration av Na2S2O4 för att efterlikna hypoxisk behandling. Figur 1B visar att 4 mM Na2S2O4-behandling under 2 timmar utan återsyresättning (0 timmar) signifikant minskade cellviabiliteten och förblev stabil. Under villkoret av 4 mM koncentration av NazS2O4 under 2 timmars efterliknande av hypoxi minskade 2 timmars reoxygenering cellöverlevnadshastigheten till 17,37 procent (Figur 1C). Som tydligt visas i figur 1D, vände 10 μM resveratrol den minskade cellviabiliteten orsakad av H/R, som var mer potent än samma koncentration av gallsyra (74,34 vs. 60,44 procent för gallussyra).

Som ett resultat etablerades hypoxi/reoxygeneringsmodellen genom att använda Na2S, O4 vid en slutlig koncentration av 4 mM under 2 timmar av efterliknande hypoxi följt av odlingen i normal DMEM (Dulbeccos modifiering av Eagles medium)/hög glukos för att efterlikna reoxygeneringsskada . Resveratrol vid en slutlig koncentration av 10 μM användes som en positiv kontroll.

2.2. Anastatiner och deras derioatior förbättrar livskraften hos H9c2-celler som utsätts för H/R-behandling

Först undersökte vi effekterna av anastatinerna A och B (Figur 2A, B) och deras derivat på livsdugligheten hos H9c2-celler i en MTT(3-(4,5)-dimetyltiahiazo(-z-y1){{ 10}},5-di-fenyletrazoliumromide) analys [13]. Föreningarna 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 och 11 var inte signifikant cytotoxiska för H9c2-celler (Figur 3A, B, Tabell S2). Anastatin A och B, deras derivat och resveratrol (positiv kontroll) reverserade hypoxiinducerad cellskada (Figur 4). I modellgruppen minskade cellviabiliteten till 20,31 procent, vilket ökades till 82,68 procent av resveratrol, och anastatin A och föreningarna 22b, 22c, 24b, 24c, 13 och 14 ökade cellöverlevnaden till mer än 70 procent ( 71.49,71.00,76.50, 73.24,77.57, 80.82 respektive 77.13 procent). Därför hade förening 13 (Figur 2C) den starkaste skyddande effekten bland anastatinderivaten från H/R-skada och användes i de efterföljande experimenten.

2.3. Förening 13 Lindrar H/R-inducerad cellskada och oxidativ stress

För att utforska föreningens antioxidantkapacitet, treoxidativ stressindikatorer, LDH (laktatdehydrogenas), GSH (L-Glutation) och SOD (superoxiddismutas), valdes ut för att utvärdera föreningarnas antioxidantkapacitet. LDH är det stabila cytoplasmatiska enzymet som finns i myokardceller, som snabbt frisätts från cell till cellodlingsmedium vid skada på myokardcellmembranet. Ju allvarligare skadan är, desto högre nivå av LDH i odlingsmediet. Figur 5A visade att 2 timmars hypoxi följt av 2 timmars återsyresättning avsevärt ökade LDH-frisättningen (478,98 U/L mot 55,84 U/Lin blankgruppen, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4.Antioxidantkapacitet hos förening 13

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>resveratrol. Därför kan antioxidantkapaciteten hos förening 13 vara högre än den hos andra typiska antioxidanter.

2.5. Effekter av anastatinderivat 13 på myokardial I/R-skada hos råttor

2.5.1. Effekter av förening 13 på oxidativ stress och antioxidantenzymaktiviteter

Nivån av myokardskada bedömdes genom att detektera markören för oxidativ stress och antioxidantenzymaktiviteter. Effekterna av förening 13 på MDA-aktivitet (malondialdehyd) i myokardvävnad, såväl som nivåerna av LDH, CK(kreatinkinas), GSH och SODin-serum, utvärderades. Som visas i figur 7, resulterade I/R-skada i en ökning av nivåerna av LDH (Figur 7A) och CK (Figur B) och en signifikant minskning av GSH (Figur 7C) och SOD-aktiviteter (Figur 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. Effekter av förening 13 på förändringar i elektrokardiogram (EKG) och hjärtfrekvens

Typiska EKG-förändringar (elektrokardiogram) inducerade av myokardial I/R-skada visas i figur 8. Jämfört med normalt EKG (Figur 8A) kan myokard I/R-skada orsaka ORS (en del av den elektrokardiografiska vågen) amplitudökning (Figur 8B); QRS-våg och ST-vågfusion (Figur 8C); ST-segment (intervallet mellan S-vågen och T-vågen) höjd (Figur 8D); och ST-segmentinversion (Figur 8E). Efter 15 minuters LAD-ligering ökade QRS-amplituden signifikant från cirka 0,5 mV till 1,2 mV i modellgruppen (Figur 9A), medan en lägre QRS-amplitudökning observerades i alla behandlingsgrupperna (från runt 0,4 mV till 1,0,8 och 0,6 mV för resveratrol-, lågdos 13- respektive högdos 13-gruppen)(Figur 9B-D ). Dessutom observerades en liknande trend vid ligering av 30 min. Under reperfusionen började QRS-amplituden att minska; QRS-vågen i modellgruppen var dock den högsta under hela perioden. Efter 20 min reperfusion minskade QRS-amplituden i modellgruppen till cirka {{30}},8 mV, värdet i behandlingsgruppen var cirka 0,6, 0,5, 0,5 mV för gruppen resveratrol, låg dos 13 respektive hög dos 13. Sammantaget reducerade behandlingen av resveratrol, låg dos 13 och hög dos 13 alla patologiska QRS-amplitudökningar jämfört med modellgruppen under både ischemi och den tidiga reperfusionsprocessen, vilket kan tillskrivas deras myokardskyddande aktivitet.

Tillsammans med övervakningen av EKG upptäcktes förändringarna i hjärtfrekvensen noggrant. Som visas i tabell S3 minskade 30 minuters ligering hjärtfrekvensen dramatiskt i alla grupper, medan inga signifikanta skillnader upptäcktes mellan någon av behandlingsgrupperna och modellgrupperna. Efter 2 timmars reperfusion ökade hjärtfrekvensen men inga signifikanta förändringar hittades bland någon av grupperna.

2.5.3. Effekter av förening 13 på infarktområde och histopatologiska förändringar

För att utvärdera nivån av myokardskada färgades hjärtvävnader med TTC (2,35-trifenyltetrazoliumklorid) och histopatologiska förändringar upptäcktes. Såsom visas i figur 10, i skengruppen, observerades inga förändringar i myokardiet efter TTC-färgning medan en skala på cirka 30 procent av vita infarktområden observerades i I/R-gruppen. I resveratrolgruppen och lågdos 13-grupperna minskades infarktområdena signifikant till cirka 10 procent och infarktområdet i högdosgrupperna 13 minimerades till cirka 5 procent. Figur 10 visar resultatet av HE (hematoxylin-eosin) färgningsundersökning: förstoring av hjärtceller, delvis upplösta membran och kärnor, och inflammatorisk cellinfiltration observerades i vävnadssnitt från modellgruppen. Emellertid lindrade förbehandling med förening 13 signifikant dessa histopatologiska förändringar. Resultaten av TTC-färgning och HE-färgning indikerade att förening 13 kan reducera I/R-inducerad hjärtinfarkt på ett dosberoende sätt.

3. Diskussion

Med sikte på den potentiella antioxidantaktiviteten hos anastatinerna A och B, syntetiserade vårt laboratorium 24 derivat av anastatiner och genomförde en preliminär analys av föreningars cytotoxicitet mot PC-12 och deras cytoprotektiva aktiviteter i HO-inducerad oxidativ skada [13] . I denna studie genomförde vi huvudsakligen den djupgående biologiska utvärderingen av 13 av de 24 derivaten med de starkaste antioxidantaktiviteterna.

I den aktuella studien etablerades myokard I/R-skada i H9c2-celler genom induktion med H/R-behandling. Resultaten av studien visade att anastatinerna A och B och deras studerade derivat förbättrade livsdugligheten för H9c2-celler efter H/R-behandling. Förening 13 visade sig vara den mest potenta bland de 26 studerade föreningarna och valdes därför ut för ytterligare utvärdering. Aktiviteterna av LDH (en markör för cellskada), SOD och GSH (oxidativ stressmarkörer) detekterades i supernatanterna av H9c2-celler efter H/R-behandling. Vi fann att förbehandling med testföreningarna signifikant minskade LDH-nivåerna och ökade SOD- och GSH-nivåerna i cellerna. Således antog vi att anastatinderivat hade hjärtskyddande aktivitet som kan tillskrivas deras förmåga att undertrycka oxidativ stress. DPPH- och ABTS-analyserna används för att utvärdera föreningens radikalfångande kraft [14]. Som ett resultat hade förening 13 hög antioxidantkraft och den rensade bort ABTS och DPPH vid låga EC50-värden, vilket ytterligare indikerar undertryckande av oxidativ stress. LAD-ligering är en vanlig metod som används för att etablera myokardial I/R-modeller. Genom att bedöma amplituden av QRS-komplex före ischemi, efter ischemi och efter reperfusion fann vi att förbehandling med förening 13 kan lindra ventrikulär arytmi signifikant under ischemi och tidig reperfusion. Dessutom påverkade förening 13 infarktområdena och histopatologiska förändringar av hjärtinfarkt också. Dessa resultat, tillsammans med fynden att förening 13 undertryckte oxidativ stress och ökade nivåerna av antioxidantenzymer i råttserum på ett dosberoende sätt, visade att förening 13 hade en potent effekt mot myokardskada.

Sammanfattningsvis hade anastatinderivat potenta antioxidantegenskaper, med förening 13 som visade den högsta antioxidantaktiviteten bland de testade föreningarna. De mekanismer som är ansvariga för effekten av anastatinderivat på oxidativ stressrelaterade signalvägar behöver fortfarande diskuteras. Astaxantin (en undertyp av karotenoid) kan rensa ROS och ytterligare lindrar ischemi/reperfusionsskada [15]. Läkemedel med potential att förhindra ROS-generering kan vara lovande vid oxidativ stressrelaterade sjukdomar [4]såsom cellterapi och kardiovaskulära sjukdomar. Dessutom undertrycker ROS den hypoxiska induktionen av hypoxiinducerbar faktor-1 (HF-1) målgenuttryck, vilket rapporteras ha en hjärtskyddande effekt på ischemi-reperfusionsskada [16]. Vi antar att ROS och HIF-1 regulatoriskt protein kan spela en avgörande roll i den kardioprotektiva effekten av förening 13. Tournefolic acid B (TAB), som härrör från kinesisk örtmedicin, skyddar mot myokard I/R-skada [17 ]. Studien avslöjade de viktiga rollerna för TAB i endoplasmatisk retikulum (ER) stress, apoptos och PI3K (fosfatidylinositol 3 kinas)/AKT (proteinkinas B) vägar i hanteringen av myokard I/R skada. Andra vägar, såsom den mitogenaktiverade proteinkinasvägen (MAPK) [18] och AMPK (Adenosin 5'-monofosfataktiverad proteinkinas) signalvägen [19], kan också vara involverade i myokardiell I/R-skada. Därför är nästa steg att börja med ROS- och HIF-1-regulatoriska proteiner och använda TAB-medierade vägar för att utforska mekanismerna genom vilka 13 utövar en antioxidanteffekt och skyddar myokardial I/R. Dessutom bör experimenten på cellnivå i denna studie också utföras i mänskliga cellinjer.

4. Material och metoder

4.1.Cellkultur

Råttkardiomyocyt H9c2-cellinje köptes från Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjing, Kina). Celler odlades i DMEM/högglukos (Hyclone, USA) och kompletterades med 10 procent FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Kina) och 1 procent penicillin/streptomycin (Hyclone, Marlborough, MA, USA) i en fuktad inkubator vid 37 grader med 5 procent CO2.

4.2. Cellviabilitetsanalys

Cellviabilitet mättes med användning av MTT-analysen. H9c2-celler såddes i en 96-brunnsplatta vid 1 x 10* celler/brunn under 24 timmar. Efteråt behandlades celler med anastatiner A och B och deras derivat i 48 timmar eller förbehandlades med anastatiner A och B och deras derivat följt av H/R-behandling. Sedan tillsattes MTT (20 μL/brunn) och odlades vid 37 grader i 4 timmar. Absorbansen mättes vid 578 nm med användning av en mikroplattläsare (Tecan, Infinite 50). Cellviabiliteten i den blanka gruppen ansågs vara 100 procent.

4.3. Hypoxi/Reoxygenation(H/R) modell och läkemedelsadministration

4.3.1.H/R-modell

NazS, O4 användes för att efterlikna det hypoxiska tillståndet, som reagerar med [20] syre och minskar syrespänningen. En mängd olika sju koncentrationer av 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 mM utfördes för att bestämma de optimala koncentrationerna av Na2S, O4. För att välja optimal hypoxitid utfördes odlingar på 0,5, 1,2, 3 eller 4 timmar efter behandling med Na2S2O4-lösning. Odlingen under normalt DMEM / högt glukosmedium under 0, 1, 2, 3 eller 4 timmar utfördes för att efterlikna återsyresättningstiden [21].

4.3.2. Drogadministration

För läkemedelsadministration separerades anastatinerna A och B och deras derivat (kemiska strukturer i tabell S1) i två grupper: anastatiner A och dess derivat, och anastatiner B och dess derivat. Resveratrol, som rapporterades ha en hjärtskyddande effekt genom sin antioxidantaktivitet, användes som en positiv kontroll. För att bestämma koncentrationen av den positiva kontrollen utvärderades resveratrol och en annan antioxidantförening, gallussyra (3-100 μM), med hjälp av en MTT-analys där celler behandlades i 48 timmar 【22】. I allmänhet förbehandlades H9c2-celler med anastatin A och B och deras derivat (10 uM slutkoncentration) såväl som 10 uM resveratrol under 30 minuter före H/R-behandling.

4.4.Utvärdering av antioxidantkapacitet

4.4.1. Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) analys

FRAP-analysen gjordes enligt Oivuans metod 【23】. Totalt 25 μL 1 procent kaliumferricyanid K3Fe（CN）6 pipetterades och 10 μL av förening 13, vitamin c(askorbinsyra, Vc) och resveratrol(0.{{8} } mM) plus 1 × PBS (pH=6.6) tillsattes. Blandningen hölls i 50 graders vattenbad i 20 minuter följt av snabb iskylning. Sedan tillsattes 25 μL 10 procent triklorättiksyra (TCA), 0,1 procent järnklorid (FeCl) och destillerat vatten i följd. Blandningen överfördes till en 96-brunnsplatta och absorbansen analyserades vid 650 nm. Vc-lösning (20-200 ug/mL) användes för att bygga en standardkurva. Antioxidantförmågan beräknades från den linjära kalibreringskurvan och representerades som Vc-ekvivalenter.

4.4.2.ABTS-metod

ABTS-radical scavenging-aktiviteten [24] utfördes enligt Sugahara et al. och Re et al. ABTS-lösningen späddes för att justera absorbansen spektrofotometriskt vid 650 av 0.70±0.02 nm, och ABTS-fångande aktiviteter mättes enligt följande formel, E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(A control-Ablank))× 10, där kontroll är absorbansen av kontrollreaktionen innehållande 130 μL ABTS · plus arbetslösning och 5,5 μL provspädningsmedel （DMSO）, och Ablank är absorbansen av 130 μL natriumacetatbuffert och 5,5 μL DMSO. A är absorbansen för 130 μL ABTS plus arbetslösning (natriumacetatbuffert) och 5,5 μL av förening 13 (0.02-20 mM), och Az är absorbansen av 130 μL natriumacetatbuffert och 5,5 μL (förening 13) 0,02-20 mM). Alla blandningar vortexbehandlades i 30 s och inkuberades vid rumstemperatur under 10 min följt av mätning av absorbansen vid 650 nm. ECs0 beräknades med hjälp av det linjära sambandet mellan koncentrationen av föreningen och sannolikheten för andelen ABTS-hämning.

4.5. Ischemi-reperfusionsmodell

4.5.1.Djurvård

Sprague Dawley (SD)-råttor erhölls från PLA Military Academy of Medical Sciences Laboratory Animal Center (Beijing, Kina). Femtio SD-hanråttor som vägde från {{0}} g acklimatiserades i en vecka vid rumstemperatur på 23±1 grad med en 12 timmars ljus/mörkercykel och mat och vatten tillhandahölls. Råttor delades in i fem grupper: blankgruppen (råttor fick ingen behandling utan skenoperation), modellgruppen (råttor fick vehikelbehandling och MI/R-operation), resveratrolgruppen (råttor fick 200 mg/kg resveratrol och MI/R) operation), lågdos 13-gruppen (råttor fick 100 mg/kg förening 13 och MI/R-operation) och högdos 13-gruppen (råttor fick 200 mg/kg förening 13 och MI/R-operation). Föreningar formulerades i 0,5 procent natriumkarboximetylcellulosa och doserades som en suspension vid 1 ml/kg oralt en gång dagligen under sju dagar. Alla djurförsök utfördes i enlighet med National Institutes of Healths guide för vård och användning av laboratoriedjur och godkända av den akademiska kommittén vid Tianjin University of Science and Technology.

4.5.2. Experimentellt protokoll

Sprague Dawley-råttor bedövades med 20 procent uretan (0,8 ml/100 g) och vi utförde sedan myokardischemi genom vänster anterior descending (LAD) ligering. Hjärtat exponerades genom ett snitt i vänster bröstkorg och placerades på en 4-0 sidensutur för att utföra regional ischemi under 30 min ischemi följt av 2 timmars reperfusion. Bevisen för myokardischemi bekräftades av ST-segmentförhöjning och QRS-amplitudökning. Under experimentet hölls råttor på en ventilator DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Peking, Kina). Hjärtfrekvens och EKG övervakades genom det biologiska signalinsamlingssystemet MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Peking, Kina). Efter övervakning av ischemi/reperfusionsprocessen avlivades råttorna och blodprover och hjärthomogenat användes för att detektera myokardskada med användning av kommersiella detektivsatser.

4.5.3. TTC-färgning och HE-färgning

Omfattningen av det ischemiska området kvantifierades genom trifenyltetrazoliumklorid (TTC)-färgning. Hjärtproverna frystes omedelbart vid {{0}} grader i 10 minuter och fem skivor av tunna 1 till 2 mm skivor gjordes. Därefter placerades skivorna i 1 procent TTC-fosfatbuffert (pH=7.0) och färgades vid 37 grader under 20 minuter och fixerades i formalin. Bilder togs med hjälp av en digitalkamera, och procentandelen av infarktområdet (TTC-negativ) och riskområdet (TTC-positivt) mättes med hjälp av programvaran ImageJ [25]. För HE-färgning skars infarktområdet bort och fixerades i 10 procent formaldehyd och bäddades sedan in i paraffin. Därefter färgades vävnader med HE(hematoxylin-eosin) och undersöktes under ett ljusmikroskop. Dehydratiserade inbäddade sektioner och tätningssektioner beställdes av Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tianjin, Kina).

4.6. Spektrofotometriska kommersiella kit

Kommersiella kit som används i denna forskning köptes från Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Beijing, Kina) och Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing, Kina). ), aktiviteter för kreatinkinas (CK), glutation (GSH) och superoxiddismutas (SOD) utvärderades. Malondialdehyd (MDA)-aktiviteter mättes med användning av råtthjärthomogenat. Alla kommersiella kit utfördes enligt tillverkarens instruktioner.

4.7.Statistikprocess

Alla experimenten upprepades minst tre gånger. Experimentdata bearbetades med GraphPad Prism7-programvara, och experimentresultatet för varje grupp uttrycktes som medel ± standardavvikelse (x± s). t-testet användes för att jämföra den statistiska signifikansen mellan grupperna. P<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Referenser

1. Uzdensky, AB; Demyanenko, S. Histonacetylering och deacetylering vid ischemisk stroke. Neural Regen. Res. 2021, 16, 1529–1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li, H.; Yin, A.; Cheng, Z.; Feng, M.; Zhang, H.; Xu, J.; Wang, F.; Qian, L. Dämpning av Na/K-ATPas/Src/ROS amplifieringssignalväg med pNaktide förbättrar myokardischemi-reperfusionsskada. Int. J. Biol. Macromol. 2018, 118, 1142–1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levin, RM; Xia, L.; Wei, W.; Schuler, C.; Leggett, RE; Lin, ADY Effekter av Ganoderma Lucidum skal-bruten spor på oxidativ stress i kanin urinblåsan med hjälp av en in vivo-modell av ischemi/reperfusion. Mol. Cell. Biochem. 2017, 435, 25–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tan, Z.; Liu, H.; Song, X.; Ling, Y.; Han, S.; Yan, Y.; Yan, J.; Wang, S.; Wang, X.; Chen, A. Honokiol efterbehandling förbättrar myokardischemi/reperfusionsskada genom att förbättra autofagisk efflux och minska intracellulär ROS-produktion. Chem. Biol. Påverka varandra. 2019, 307, 82–90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hausenloy, DJ; Yellon, DM Myokardischemi-reperfusionsskada: Ett försummat terapeutiskt mål. J. Clin. Undersök. 2013, 123, 92–100. [CrossRef]

6. Yu, C.; Li, D.; Li, Z.; Yu, D.; Zhai, G. Effekt av sacubitril/valsartan på inflammation och oxidativ stress i doxorubicin-inducerad hjärtsviktsmodell hos kaniner. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473–484. [CrossRef]

7. Wang, Y.; Che, J.; Zhao, H.; Tang, J.; Shi, G. Platycodin D hämmar oxidativ stress och apoptos i H9c2-kardiomyocyter efter hypoxi/reoxygenationsskada. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2018, 503, 3219–3224. [CrossRef]

8. Pavlovic, M.; BNáfrádi Rouster, P. Mycket stabil enzymhärmande nanokomposit av antioxidantaktivitet. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174–182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Wangi, WZ; He, JY Antioxidativt system av Deinococcus radiodurans. Res. Microbiol. 2019, 171, 822–831. [CrossRef]

10. Shao, L.; Shao, Y.; Yuan, Y. Pinocembrin flavanone hämmar cellviabiliteten i PC-3 human prostatacancer genom att inducera cellulär apoptos, ROS-produktion och cellcykelstopp. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669–678. [CrossRef]