Främre thalamiska kärnor: ett kritiskt substrat för icke-spatialt par-associerat minne hos råttor del 2

2|MATERIAL OCH METODER

2.1|Djur och boendeförhållanden

Long-Evans-råttor av hankön (12 månader gamla; i genomsnitt 630 g) hölls i grupper om tre eller fyra i Makrolon-burar (48 28 22 cm) på en omvänd 12-h ljus–mörker cykel (ljus tänds kl. 20.00). ).

Beteendetester inträffade i den mörka fasen av ljuscykeln, fem sessioner per vecka; observationer bekräftade att råttor var relativt mer aktiva under den mörka fasen. Råttor hölls vid 85 % av den fria kroppsvikten med vatten ad libitum; maten var ad libitum före och efter operationen för postoperativ återhämtning.

Kirurgi är processen att behandla sjukdomar och förbättra den fysiska hälsan. Återhämtningsprocessen efter operationen kräver särskild uppmärksamhet. Att må bra kräver förutom fysisk återhämtning även fokus på minnesåtervinning. Det finns ett starkt samband mellan postoperativ återhämtning och minne.

Under operationen påverkar faktorer som kroppens motgångsreaktion och effekter av anestesimedel ofta hjärnans minnesfunktion. Efter att kroppen återhämtat sig, var uppmärksam på att upprätthålla en bra kost, måttlig motion och tillräcklig sömn. Under återhämtningsperioden utanför sjukhuset måste du fortsätta att undvika överdrivna aktiviteter och upprätthålla ett bekvämt tillstånd av kroppen.

Förutom levnadsvanor är rimliga psykologiska justeringar också till hjälp för att återställa hälsa och minne. Slappna av dig själv, behåll ett fridfullt sinne och hjälp dig själv att anpassa dig till minnesåterhämtning. Samtidigt bör du aktivt delta i fritidsaktiviteter och kommunicera med släktingar och vänner för att hålla din hjärna aktiv och förbättra dina kognitiva och minnesförmågor. Denna aktivitet kan ökas gradvis och kan göras i princip en gång i veckan.

Kort sagt, återhämtningsprocessen efter operationen kräver allsidig uppmärksamhet. Att upprätthålla goda levnadsvanor och psykologiska anpassningar spelar en mycket viktig roll för att främja fysisk återhämtning och minnesåtervinning. Låt oss möta det positivt, med fullt förtroende och hopp. Vi behöver förbättra minnet, och Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt, eftersom Cistanche deserticola också kan reglera balansen mellan signalsubstanser, som att öka nivåerna av acetylkolin och tillväxtfaktorer. Dessa ämnen är mycket viktiga för minne och inlärning. Dessutom kan Kött också förbättra blodflödet och främja syretillförseln, vilket kan säkerställa att hjärnan får tillräckligt med näringsämnen och energi, och därigenom förbättra hjärnans vitalitet och uthållighet.

Klicka på vet sätt att förbättra hjärnans funktion

Alla procedurer överensstämde med godkända riktlinjer från University of Canterbury Animal Ethics Committee. Fyra grupper av råttor etablerades genom slumpmässig tilldelning efter förkirurgisk bekantskap i den radiella armlabyrinten (RAM) och landningsbanan. De fyra grupperna var bilaterala ATN-lesioner med eller utan spår mellan lukt och objektstimuli när de tränades i den parade associerade uppgiften och motsvarande två Sham-lesionsgrupper.

De slutliga provstorlekarna var (1) Sham-No Trace=7 (dvs en Sham-lesionsgrupp utan intervall mellan lukt och objektstimuli som används i den parade associerade uppgiften); (2) Sham-Trace=7 (Shamlesionsgrupp ges ett 10-s-spår mellan presentationen av lukten och objektstimuli); (3) ATN-No Trace=8; och (4) ATN-Trace=9. En ytterligare råtta med ATN-skada uteslöts för att inte uppfylla lesionskriterierna (se nedan).

2.2|Kirurgi

Råttor bedövades med isofluran (induktion 4%; underhåll 2,5%) och placerades i en stereotaktisk apparat med atraumatiska öronstänger (Kopf, Tujunga, CA). Tandstången sattes till 7,5 mm under den interaurala linjen för att minimera fornixskadan.

I varje hemisfär riktades två infusioner mot den anteroventrala kärnan (AV; övre och nedre), och en infusion riktades mot den anteromediala kärnan (AM). Varje operation använde en offive anterior–posterior (AP) koordinater i förhållande till en enskild råttas Bregma-Lambda-avstånd (alla värden inmm). För AV-lesioner var AP-koordinaterna: 2,20 för B–L 6,9–7,2; 2,25 för B–L 7,3 till 7,6; 2,30 för B–L Större än eller lika med 7,7. AV-infusionerna gjordes vid 5,68 och 5,73 under dura och 1,52 lateralt om mittlinjen.

AM-infusionen gjordes {{0}}.1 mm mer främre än AV-koordinaten, 5.76 under dura och 1.16 lateral; den första AM-lesionen gjordes efter att alla AV-infusioner hade avslutats och började kontralateralt till den sista AV-lesionen. 0.15 M N-metyl-d-aspartat (NMDA; Sigma, CastleHill, NSW) i 0.1 M fosfatbuffert (pH 7,20) infunderades till varje plats med 0,04 ul per minut via en 2.5-ulHamilton-spruta (Reno, NV, USA) med en mikroinfusionspump (Stoelting, Wood Dale, IL).

AV-site per hemisfär fick {{0}}.12 respektive 0.10 ul för dorsaland ventrala platser; 0,06 ul användes för varje AM-ställe. Sprutnålen förblev in situ under 3 min per sida, efter infusion.
Sham-lesionsoperationer använde samma procedur, men nålen sänktes till 1 mm ovanför övre AV- och AM-lesionsställena utan infusion.

2.3|Beteendeuppgifter

Ett åttaarmigt RAM bekräftade försämringen av rumsminnet hos ATN-skada råttor efter operation. En start- och landningsapparat användes för att träna råttorna på alla icke-spatiala uppgifter, det vill säga enkel lukt och enkla föremålsdiskriminering och doft-objekt och lukt-spår-objekt parade-associerade uppgifter.

Före operationen vände sig råttor med matbegränsade till det åttaarmiga RAM-minnet, som beskrivs nedan, för att hämta 0,1 g chokladbitar (Foodfirst LTD Auckland, NZ) och anpassa sig till öppning och stängning av armdörrar. I en röd Perspex-bana (Figur 1) formades råttor också för att näsan sticka en 2-cm cirkulär vit plastmössa som var 10 cm över golvet i mitten av en tunn svamp på en klar Perspex-insats som var fäst vid ändväggen.

De formades också för att trycka (med hjälp av en näsa eller tass) ett föremål med gångjärn på baksidan av basen till toppen av en matbrunn som var försänkt i mitten av ett 5 8,5 3 cm träblock. Maten innehöll chokladbitar (och höll otillgänglig mat under fördjupningen). Objektet som användes för förträning användes inte igen. Efter operationen gjordes återhämtningsråttor återbekanta med både RAM-minnet och banan.

2.4|Rumsligt arbetsminne i RAM-minnet

Efter operationen testades rumsligt arbetsminne med hjälp av RAM-minnet i mitten av ett fönsterlöst rum (3 3 m). Labyrinten hade ett gråmålat trä 35 cm brett centralt nav med åtta aluminiumarmar (65 cm långa 8,6 cm breda, med 4,5 cm höga bårder), upphöjda 67,5 cm över rumsgolvet. Klara plexiglasväggar (19 cm långa och 25 cm höga) sträcker sig längs ena sidan av varje arm från navet för att förhindra att råttor hoppar mellan armarna.

En svart matbrunn av trä (5 8,5 3 cm), med otillgänglig mat under, placerades i slutet av varje arm. rättegång. Genomskinliga Perspexgiljotindörrar, som kunde höjas från under navet med ett remskivasystem, kontrollerade åtkomsten till navarmarna.

Tio dagars formell träning i RAM användes för att testa det rumsliga arbetsminnet. Råttan placerades i det centrala navet och 10 sekunder senare öppnades alla åtta armar och råttan fick göra ett val definierat som båda bakfötterna över en armtröskel. När råttan väl hade gått in i en arm stängdes alla dörrar och den var instängd i armen i 15 s, oavsett om den gjorde ett korrekt val.

Råttan släpptes sedan tillbaka in i det centrala navet och hölls där i 10 sekunder innan alla dörrar öppnades igen för att tillåta ett annat armval. Rättegången avslutades när rathaden besökte alla åtta armarna, 20 armval hade gjorts eller 10 minuter hade förflutit.

2,5|Icke-spatiala uppgifter: Enkel diskriminering och parat-associerat lärande

Både enkel diskriminering och parad-associerade uppgifter använde samma röda Perspex-bana (93 26 26 cm) placerad på ett 75-cm-högt bord (Figur 1). Banan kunde delas av tre vertikalt avtagbara dörrar (rödPerspex, 26 26 cm) som valdes ut utifrån den specifika beteendeuppgiften. När det gäller bekantskap, den 6,5 6 8 mm tunna svampen med locket i mitten innehöll en belöning för chokladmat (Figur 1).

Svampen var fastsatt på en avtagbar dörr på banan (för de parade associerade uppgifterna) eller banans ändvägg (för den enkla diskrimineringsuppgiften). En annan doorplus-svamp användes för varje lukt, som infunderades intill behållaren med 5 ml solrosolja blandad med 20 ul eteriska oljor från New Zealandsubstans.

Dofterna var citron och kryddnejlika för de parade associerade uppgifterna, och kanel och lime för de enkla diskrimineringsuppgifterna, eller tvärtom i motviktsgrupper. Lätta och visuellt distinkta föremål (Figur 1) fästes med ett gångjärn på baksidan av basen till toppen av matbrunnen så att en råtta lätt kunde trycka föremålet bakåt (antingen näsa eller tass) för att söka i brunnen efter matbelöning.

En träram (1,8 m hög från golvet 1,3 m bred), draperad i svarta gardiner, omslöt alla sidor av testområdet för att minska rumsliga signaler under testning.

De enkla diskrimineringarna (endast lukt; endast objekt) och de parade associerade uppgifterna använde en "go/no-go"-procedur.

Det första försöket för varje session började med att hålla fast råttan i startområdet i 120 s för att åter acklimatisera sig till temat; efterföljande försök använde 20 s i detta startområde. Allrats fick 12 massförsök per daglig session, med sixgo (belönade) och sex no-gos (icke-belönade) försök i apseudo-randomiserad ordning. Inte mer än tre eller tre no-go-försök kördes i följd i en session.

Inget av de fyra olika paren av lukt-objekt-stimulering upprepades i på varandra följande försök. Korrekta objekt i de enkla diskrimineringsuppgifterna och korrekta stimuleringspar i de parade associerade uppgifterna motsvarades över råttor.

För den enkla luktdiskrimineringen definierades ett svar som ett nässtick i locket i mitten av den doftbehandlade svampen; att bara snusa på svampen ansågs vara ett nej-svar. Mat fanns alltid i mössan i mitten av svampen för doft-objektpar-associerade uppgifter; go/no-go-aspekten här hänvisar till huruvida objektet trycktes för att avslöja om en matbelöning låg under det, i slutet av banan.

För objekt definierades ett svar som varje knuff med en näsa eller tass som lutade föremålet bakåt. Latens från den tidpunkt då den sista dörren lyftes och när råttan interagerade med lukten (nospet i hatten; för enkel luktdiskriminering) eller med föremålet (tryckt tillbaka på gångjärnet, för enkel föremålsdiskriminering och parade associerade uppgifter) var mätt med ett tyst stoppur (Dick Smith, Nya Zeeland).

Observatören satt inom gardinerna och intill banan för att manövrera dörrarna och registrera beteendet. Ett försök betecknades som "korrekt" om råttan svarade på mindre än 8 sekunder på gång eller inte svarade innan 8 sekunder på försök utan att gå.

2.6|Enkla diskriminering

Hälften av råttorna fick utbildning i den enkla luktdiskrimineringsuppgiften följt av den enkla föremålsdiskrimineringen och vice versa för den andra hälften. Latens mellan Dörr X (Figur 1a) och interaktion med lukten eller föremålet i slutet av banan registrerades. Råttor tränades på den enkla lukten och enkla föremålsdiskrimineringsuppgiften tills de nådde kriteriet (80 % korrekt under två på varandra följande dagar).

För den enkla luktdiskrimineringsuppgiften presenterades en enda lukt vid varje försök. Rathad att urskilja vilken av två lukter som parades ihop med en matbelöning presenterad i svampen i slutet av fack B (Figur 1a).

I den enkla objektdiskrimineringsuppgiften presenterades ett enda objekt vid varje försök i slutet av fack B (visas inte i figur 1). Therat var tvungen att lära sig vilket av två föremål som parades ihop med en matbelöning som presenterades under föremålet.

2.7|Parade associerade uppgifter (spårning och ingen spårning) Dessa uppgifter använde en ny layout av vertikalt avtagbara dörrar (Figur 1). Råttorna lärde sig vilken av två lukt-objekt-parningar som skulle belönas (t.ex. Lukt 1 + Objekt A och Lukt 2 + Objekt B) och vilka parningar som inte belönas (dvs. Lukt 1 + Objekt B och Lukt 2 + Objekt A).

Oavsett parning fick råttor alltid en belöning för presentationen av lukten när de släpptes in i banans andra fack. Detta var fack C för "spårfritt" tillstånd där fack A inte användes och fack B var startfacket. Lukten fanns i slutet av fack B för "spår"-tillståndet, för vilket fack A användes som startlåda.

Råttor i spårtillståndet utsattes för en 10-s fördröjning mellan presentationer av lukt och föremålsstimuli, genom att hållas i fack C, medan råttor i tillstånd utan spår exponerades för föremålet omedelbart efter deras interaktion med lukten (efter äter belöningen). Under både spårnings- och spårningsfria förhållanden registrerade vi latens för att passera fack D, från det att DoorZ lyftes tills råttan interagerade med föremålet eller avstod från att interagera med det i 8 sekunder.

Två grupper av råttor (Sham-lesion och ATN-lesion) tränades på doft-objekt parade-associerade uppgifter (inga spårgrupper), och två motsvarande grupper tränades på theodour-trace-objekt parade-associerade uppgift (spårgrupper) tills de nått kriterium (80 % korrekta försök över 3 dagar) eller högst 50 dagar.

2.8|Retentionstest efter förvärvet

Bibehållande av den parade associerade uppgiften för alla råttor utfördes 5 dagar efter att kriteriet uppnåtts eller efter 50 dagars träning. Denna session använde 12 samlade belönade/icke-belönade försök på en enda dag på samma sätt som tidigare för den råttan.

2.9|Histologi

2.9.1|Perfusion och vävnadsinsamling

De 3 dagarna före retentionstestet blev enstaka råttor bekanta med en tom ren bur i 90 minuter i ett mörkt tyst rum. Omedelbart efter det sista försöket i koncentrationstestet placerades råttan i sin bur i det välbekanta mörka tysta rummet 90 minuter före perfusion.

Råttor bedövades djupt med natriumpentobarbital (125 mg/kg) och perfuserades transkardialt med saltlösning följt av paraformaldehyd [4 % PFA i 0.1 M fosfatbuffert (PB)] för att fixera hjärnan. Hjärnor efterfixerades i 4% PFA följt av minst 48 timmar i en långsiktig lösning (20% glycerol i 0,1 M PB). Koronala 40- μm sektioner samlades med hjälp av en frysmikrotom (Thermo Fisher, Storbritannien) och lagrades i en kryoskyddande lösning (30 % glycerol, 30 % etylenglykol i 0,1 M PB) vid 20 C tills de behandlades för immunhistokemi.

De koronala sektionerna samlades in i två separata serier. Den första serien tog på varandra följande sektioner i fem kryovialer för immunhistokemi (dvs en av fem). Denna serie inkluderade ett främre block av sektioner från den prefrontala cortex till septumområdet (ungefär {{0}},7 till 0,6 mm från Bregma) och ett bakre block från den mediodorsala thalamus (cirka 3,5 mm från Bregma) till stjärten retrosplenial cortex.

Den andra serien fångade på varandra följande sektioner för lesionsverifiering. Dessa sektioner samlades in i fyra kryovialer från omedelbart framför ATN till den bakre mediodorsala thalamus (ungefär 0,6 till 3,5 mm från Bregma).

2.9.2|Neu-N-färgning och ATN-lesionsverifiering

Fritt flytande sektioner i hela ATN-regionen tvättades (3 1 0 min) i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning med Triton-X (0,2 %; PBSTx) före inkubering i endogen peroxidasblockerande buffert i 30 min [1% väteperoxid (H2O2), 50% metanol (CH3OH) i 2%PBSTx].

Sektioner inkuberades över natten vid 4 C inanti-NeuN primär antikropp (1:5000; monoklonal-MouseCat# MAB377; Millipore, Kalifornien, USA) i PBSTx med 1 % normalt getserum (NGS; Life Technologies, NZ).

Överskott av antikroppsbuffert avlägsnades med PBSTx och följdes av inkubation i biotinylerad get-anti-mus sekundär antikropp (1:1000 Cat# BP-9200-50: VectorLaboratories, Kalifornien, USA) över natten vid 4 C i PBSTx och 1% NGS. Sektioner placerades i ExtrAvidin (peroxidaskonjugerat; 1:1000; Sigma, NSW Australien), PBSTx och 1% NGS under 2 timmar vid rumstemperatur.

För att ta bort överskott av ExtrAvidin och Triton X{{0}} tvättades sektionerna i PBS, PB och sedan Tris-buffert (pH 7,4 i destillerat H20) för att förbereda sektionerna för visualisering med nyberedd diaminobensidin ( DAB 0,05 %; Sigma, i 0,01 % H2O2 i Tris-buffert).

DAB-reaktionen (ungefär 5 min) stoppades med hjälp av Tris-buffert (1 10 min tvätt), och sektioner placerades i PB vid 4 C över natten innan de monterades på gelatinerade objektglas och fick torka. Objektglasen dehydrerades genomgraderad alkohol (70 %–100 %) innan de rensades inxylen och monterades med DPX (06522; Sigma-Aldrich) och ett täckglas.

Antalet Neu-N-positiva celler i ATN användes för att bestämma skadans omfattning. Detta använde sektioner från både vänster och höger hemisfär för var och en av fyra 40-μm sektioner i hela ATN och området kvantifierat med ImageJ (NIH, USA). NeuN-positiv cellfärgning fotograferades vid 5 objektiv på ett LeicaDM6 B upprättstående mikroskop och DFC7000T-kamera (Leica Microsystems, Tyskland).

Automatiserade räkningar av cellerna erhölls genom ImageJ (bildanalysprogramvara, National Institute of Health, NIH, USA). Området som omger neuroner i ATN-regionen valdes manuellt och bilderna konverterades till en {{0}}bitgråskala, bakgrunden subtraherades (rullande=40), konverterades till mask och vattendelarefunktionen tillämpades, och alla neuronala celler över tröskeln ('MaxEntropy'-tröskel, cirkularitet 0.5–1.0) räknades.

Detektionströskeln var densamma för alla sektioner. Automatiserade NeuN-färgade cellkärnor räknades i nio av skenråttorna (fem i Sham-Trace-gruppen och fyra i Sham-No Trace-gruppen) för att uttrycka cellantal i ATN.

Automatiska räkningar av NeuN-färgade kärnor av besparade celler i alla ATN-skada råttor jämfördes i förhållande till det genomsnittliga antalet NeuN-celler som observerats i skenråttorna. Acceptabla lesioner definierades som att de nådde kriteriet 50 % förlust av celler i ATN, med ett minimum av 25 % per halvklot. Detta överensstämmer med ATN-lesionskriterier i tidigare studier (Mitchell & Dalrymple-Alford, 2005, 2006; Perry et al., 2018).

2.9.3|Zif268 immunhistokemi

Fritt flytande sektioner bearbetades på liknande sätt som för NeuN, men inkuberades i kanin polyklonal Zif268 primär antikropp (Egr-1; 1:1000 Cat# sc-110; Santa CruzBiotechnology, USA) i 72 timmar vid 4 C i PBSTx med 1 %NGS, följt av inkubation i biotinylerad get-antikanin sekundär antikropp (1:1000: Vector LaboratoriesBA-1000) över natten i PBSTx och 1 % NGS.

Efter DAB-visualisering (18 min) fotograferades Zif268-positiv cellfärgning i varje område av intresse med ett 10 objektiv med ett ljusmikroskop (Leica, Tyskland). Automatiserade räkningar av cellerna erhölls genom BildJ ( NIH, USA) på samma sätt som NeuNpositiva celler, förutom att cirkulariteten sattes till 0.65–1,0.

Antalet Zif268-positiva celler för alla regioner använde samma tröskelalgoritm, med mellan två och sex sektioner per region av intresse i varje råtta kvantifierad. Det genomsnittliga Zif268-positiva cellantalet per mm2 över sektioner (från båda hemisfärerna) inom ett område av intresse användes.

2,10|Dataanalys

ANOVA med hjälp av Statistica (v13; Dell Inc.) utfördes för att testa medelskillnader mellan de fyra grupperna av råttor (Sham-No Trace, Sham-Trace, ATN-No Trace och ATNTrace). Faktorer för upprepade mätningar lades till för dagar (RAM och enkel diskriminering), block av försök (parade associerade uppgifter) och Zif268-räkningar över relaterade regioner eller underregioner av intresse.

ANOVA för både RAM- och enkla diskrimineringsuppgifter jämförde fyra grupper för att bekräfta att de två Sham-lesions- och tvåATN-lesionsgrupperna överensstämde med varandra, men notera att det inte fanns någon spårkomponent i RAM-minnet eller enkla diskrimineringsuppgifter. För både enkel diskriminering och parade associerade uppgifter på banan användes en ömsesidig transformation av latensdata i individuella försök för att säkerställa variansens homogenitet.

På vilken testdag som helst genererade de transformerade latenserna genomsnittlig latens för var och en av de sex icke-belönade försöken och de sex belönade försöken. För de enkla diskrimineringsuppgifterna analyserade vi medelvärdet för latensskillnaden (genomsnittet av premierade försök minus genomsnittet av de icke-belönade försöken) men inte de premierade och icke-belönade försöken separat på grund av ett datalagringsfel.

Alla tre latensmåtten var tillgängliga för de parade associerade minnesuppgifterna (icke-belönade försök, belönade försök och latensskillnad). För att ta hänsyn till flera jämförelser och för att balansera typ I- och typ II-fel använde vi signifikansnivån p < 0.02 för beteendeanalyser eftersom det fanns tre relaterade mått i den parade associerade uppgiften (icke-belönade försök, belönade försök och genomsnittlig latensskillnad).

Det fanns sex primäranalyser för regioner av intresse för Zif268-uttryck, sosignifikans i dessa analyser sattes till p < 0.01. Posthoc Newman–Keuls (NK) tester bedömde parvisa gruppskillnader. Enkel huvudeffektanalys användes när det fanns signifikanta interaktioner som involverade upprepade åtgärder.

3|RESULTAT

3.1|Verifiering av skada

Alla utom en av de 18 råttorna med ATN-skador uppfyllde apriori-kriteriet på 50 % bilateral skada på ATN och minst 25 % per halvklot. Medianbilateral skada var 76 % för båda ATN-lesionsgrupperna (intervall: ATN-Inget spår, 61 %–93 %; ATN-spår, 63 %–93 %; Figur 2). Den uteslutna råttan hade en tillfredsställande skada endast i ena hemisfären (48 % totalt, 75 % vänster och 20 % höger).

Figur 2d visar att NeuN-tal för ATN-neuroner i ATN-lesionsråttorna (M=3388, SD=2024) var långt under de värden som hittades i sken-lesionsråttorna (M=15, 339, SD=1065; denna räkning liknade den som rapporterades av Frost et al., 2020). Åtta av de 17 lesionsråttorna (fyra i Trace-gruppen och fyra i No-Trace-gruppen) hade inga skador på vare sig den mediodorsala thalamus (MD) eller återföreningar/romboida (Re/Rh) kärnor, och det var relativt liten skada på dessa strukturer i de återstående nio råttor med lesioner.

När MD-skada inträffade var det i de främre aspekterna som ligger intill ATN. Så MD-skadan bedömdes från ungefär {{0}},72 till +2,10 mm från Bregma, där den varierade från 0 % till 41 % förlust av celler över hela grupp (median=21%). När Re/Rh-skada inträffade låg den också intill ATN-regionen, så den bedömdes ungefär 1,08 till 2,04 mm från Bregma, där den varierade från 0 % till 33 % (median=6 %). Observera att dessa procentuella skadevärden inte representerar hela MD- och Re/Rh-regionerna, eftersom de bakre regionerna av båda kärnorna var intakta i alla ATN-lesionsråttor.

For more information:1950477648nn@gmail.com