Anti-aging -Klotho genaktiverad ställning främjar föryngrande sårläkningssvar i mänskliga fetthärledda stamceller

Nyckelord:anti-åldring; -Klotho; genaktiverad ställning; fetthärledda stamceller; angiogenes;matrisavsättning;föryngrande läkning

Klicka här för att få Herb Cistanche för anti-aging och sårläkning

1. Introduktion

Sårläkning är en komplex biologisk process som kräver en snäv orkestrering av flera cellulära händelser [1]. Men i den åldrande befolkningen störs cellulära händelser, vilket leder till försenad läkning [2]. Störningen i läkningsmekanismerna uppstår delvis på grund av den minskade målsökningen av progenitorcellerna från benmärgen och andra rådande metabola sjukdomar som diabetes [3,4]. Inom sårbehandling blir applicering av biomaterialställningar allt vanligare som behandling. Biomaterialställningarskydda såret från infektion, absorbera sårexsudat och hålla såret fuktigt för att förhindra vävnadsnekros [5]. Terapeutik kan också laddas i biomaterialställningar och främja snabbare läkning i svårläkta sår [1]. Men byggnadsställningar av biomaterial ensamma kanske inte effektivt orkestrerar de multipla signalkaskaderna som uppstår i såret. Att leverera stamceller föreslås ibland som en lösning för att moderera de komplexa signalhändelserna i såret [6]. 

Stamceller utsöndrar parakrina faktorer och kan differentiera till celler av flera vävnadslinjer [7]. Stamceller levereras vanligtvis in i såret genom intradermala injektioner [6], aktuell sprutning [8], eller som vävnadskonstruerade transplantat [9]. Under de senaste åren har tillämpningen av vävnadskonstruerade transplantat för kronisk sårläkning gradvis vunnit bredare acceptans på grund av deras förmåga att läka sår snabbt [9–11]. Apligraf® och Dermagraft® är två av de allmänt använda Food and Drug Administration (FDA)-godkända biotekniska konstruktionerna för kronisk sårbehandling [12,13]. Genereringen av dessa transplantat kräver dock långvarig cellodling för att producera höga cellantal [14]. När man använder stamceller kan långvarig odling öka cellulär åldrande och minska stamcellernas stamceller [15,16]. Därför är upprätthållandet av stamcellernas stamceller centralt för att uppnå det optimala terapeutiska svaret. Terapeutisk genleverans till stamcellerna med hjälp av icke-virala vektorer är en potentiell strategi för att förbättra stamcellers funktionalitet [17]. Traditionellt transfekteras cellerna i 2D-kulturer och transplanteras senare in vivo [18]. Men plattformar som de genaktiverade byggnadsställningarna, bestående av biomaterialställningar funktionaliserade med nanopartiklar som bär den terapeutiska transgenen [19], att vår grupp har varit banbrytande för att erbjuda en alternativ lösning för att transfektera cellerna i en 3-D-miljö. Denna studie fokuserade på att utveckla en genaktiverad version av 3D kollagen-kondroitinsulfat (coll-CS) ställningen som har en enorm klinisk translationspotential, eftersom dess sammansättning liknar den hos Integras Dermal Regeneration Template (DRT), en kliniskt godkänd ställning för kronisk sårläkning [20]. Vi använder i första hand en katjonisk polymer som kallas polyetylenimin (PEI) för att kondensera DNA-plasmider som kodar för tillväxtfaktorgener såsom den stromalhärledda faktorn-1 alfa- och nervtillväxtfaktorn och sätta ihop dem till laddade nanopartiklar [21–23]. Dessa laddade nanopartiklar laddas sedan i vår coll-CS-ställning för att generera de genaktiverade ställningarna. Våra tidigare studier har också visat att den PEI-baserade genaktiverade ställningen kan orsaka övergående överuttryck av den terapeutiska transgenen i en rad sårläkande celler och främja deras regenerativa förmåga [21,24,25]. Traditionellt utvecklades den genaktiverade ställningen för att rikta in sig på värdceller och främja lokal reparation [26]. Emellertid indikerar framväxande bevis att cellladdade genaktiverade ställningar har överlägsen förmåga att regenerera komplexa vävnadsstrukturer än enbart genaktiverade ställningar [27]. 

Cellulärt överflöd är ett av de avgörande kraven för generering av vävnadskonstruerade transplantat [28]. Fettvävnaden är en rik källa som kan försörja ett stort antal stamceller. Fettvävnaden innehåller så många som 500 gånger stamcellerna för samma massa av benmärg, en traditionell vävnadskälla för stamcellsextraktion [29]. Dessutom kan stamcellerna extraheras från fettvävnaden med en minimalt invasiv fettsugningsprocess [29]. Vår nyligen genomförda studie fann att mänskliga fetthärledda stamceller (ADSC) visar utmärkt biokompatibilitet med coll-CS-ställningen. Att använda en pro-angiogen genaktiverad ställning förbättrade ADSCs regenerativa svar ytterligare [30]. ADSCs tenderar dock att förlora sin stamness vid expansion [31]. Tidigare fann vi att ett anti-aging protein -Klotho kan avsevärt förbättra spridningen av friska och diabetiska mänskliga ADSCs [32]. De flesta studier använder generellt den primära varianten -Klotho [33–35] och har visat att proteinet kan öka livslängden för ADSC genom att aktivera telomeras transkriptionell aktivitet [33]. - Klotho-överuttryckande MSC:er har också visat sig utöva starka anti-fibrotiska effekter vid njurskada genom hämning av Wnt/ -catenin signalering [36]. Men rollen av -Klotho i stamceller är fortfarande relativt outforskat.

Förutom skillnaden i forskningsfokus mellan de - och -Klotho, anti-agingKlotho-proteiner har ännu inte helt införlivats i vävnadsteknikstrategiernaför sårläkning. Därför, i denna studie, försökte vi studera den funktionella effekten av en -Klotho genaktiverad ställning på mänskliga ADSC: er för sårläkningstillämpningar. Viundersökte först transkriptionsaktiviteterna för de klassiska pluripotensfaktorerna (okt-4,Nanog och Sox-2), spridningsmarkör (Ki-67) och sårläkningsregulatorer (TGF- 3 och TGF- 1) i ADSC:erna. Vi utvärderade sedan bioaktiviteten hos det konditionerade medietgenererad av den ADSC-laddade genaktiverade ställningen för att utvärdera dess parakrina potential.I slutändan undersökte vi regenereringen av basalmembranet (fibronektin, laminin,och kollagen IV) och ärrassocierade proteiner ( -SMA och elastin) i ADSC-laddadegenaktiverad ställning för att utvärdera kontrollerad vävnadsmognad.

2. Resultat

2.1. -Klotho genaktiverad ställning förstärker tillfälligt mänskliga ADSC:s stamstyrka och pro-reparativa gener

Genuttrycksanalys visade först att ADSC:erna på den genaktiverade ställningen överuttryckte -Klotho-genen över 172-faldigt (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1A). Detta fynd bekräftade den effektiva interaktionen mellan ADSCs med den genaktiverade ställningen. Analys av proliferationsmarkören Ki-67 bekräftade vidare att ADSC:erna på den genaktiverade ställningen också bibehöll en robust proliferativ kapacitet under 14 dagar (Figur1A). Efter att ha bekräftat överuttrycket av anti-aging -Klotho-genen, bedömde vi sedan stamcellers föryngring genom aktivering av "pluripotens"-faktorer i ADSC. Sammantaget noterade vi en övergående reglering av alla tre transkriptionsfaktorer under de 14 dagarna (Figur1B). ADSC:erna visade dock bara en signifikant ökning av uttrycket av Oct-4-genen som bibehölls till dag 14. Specifikt visade ADSC:erna en 2.5--faldig (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Nivåerna av pro-fibrotisk TGF- 1 gen i -Klotho-överuttryckande ADSC:er visade sig vara i paritet med den för den genfria ställningsgruppen under de 14 dagarna. Men nivåerna av antifibrotisk TGF- 3 var signifikant (3.6-faldig,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Klotho genaktiverad ställning

Förbättrar den parakrina styrkan hos mänskliga ADSC: er2.2.1. Pro-angiogen bioaktivitet Bioaktivitetstestet av CM som genererats av ADSCs-laddade genaktiverade ställningar visade först att det temporärt kunde kontrollera den metaboliska aktiviteten i HUVEC. Dag 3 CM ökade signifikant den metaboliska aktiviteten i HUVECs, medan användningen av åldrad CM från dag 14 signifikant minskade HUVEC:s metaboliska aktivitet (figur2A). Efter att ha observerat detta testade vi sedan den pro-angiogena effekten av CM från dag 3 och 14 på HUVEC:erna som såddes på Matrigel. Som förväntat, dag 3 CM från den genaktiverade ställningsgruppen signifikant (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Ingen ytterligare ökning av den angiogena aktiviteten inträffade dock med dag 14 CM jämfört med dag 3 CM. Dagen 14 CM från båda grupperna uppvisade också liknande pro-angiogen effektivitet (Figur2C). Sammantaget indikerar vårt fynd att den genaktiverade ställningen tillfälligt påskyndar ADSCs pro-angiogena svar.

pro-fibrotisk TGF- 1. ** och * indikerarp < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± standardavvikelse (n = 3).

Figur 2. Pro-angiogen parakrin bioaktivitet hos den ADSCs-laddade genaktiverade ställningen CM. (A) CM producerad av den ADSCs-laddade genaktiverade ställningen under de 14 dagarna visade en förmåga att temporärt kontrollera HUVECs metaboliska aktivitet. (B) Dag 3 CM från den genaktiverade ställningsgruppen förbättrade signifikant bildningen av endoteltubuli och dess förgrening jämfört med den för den genfria ställningsgruppen. (C) Tubulibildning och förgrening av endotelceller 6 timmar efter exponering för CM från ADSCs. seeded genaktiverad och genfri byggnadsställning, * indikerar p < 0.05. Data representerar medelvärde! standardavvikelse (n=3)

2.2.2. Dermal fibroblastläkning och mognad

Ett av resultaten från angiogenesstudien är att när den ADSC-laddade genaktiverade byggnadsställningen mognar, främjar den inte längre angiogenes. Vidare, på dag 14 liknade deras angiogena styrka den för den genfria ställningsgruppen (Figur 2B, C) Därför undersökte vi påverkan av åldrande dag 14 CM på dermal fibroblast sårförslutning. I likhet med resultatet av angiogenesstudien visade båda grupperna liknande nivåer av fibroblastsårförslutning med dag 14 CM. Specifikt läkt båda grupperna såret med cirka 40 procent på 12 timmar (Figur 3A). Detta fynd avslöjade att den genaktiverade ställningsgruppen under mognad stöder men främjar inte dermal fibroblast sårförslutning.

Icke desto mindre, eftersom fibroblasterna stimulerades med åldrad CM, studerade vi om påverkan av uttrycket av matrisproteiner involverade i sårmognad. Som förväntat uttryckte dermala fibroblaster stimulerade med CM från den genfria ställningsgruppen rikligt det profibrotiska kollagen I-proteinet (Figur 3B). Tvärtom, fibroblaster stimulerade med CM från den genaktiverade ställningsgruppen visade 50 procent lägre uttryck (p < 0,05) av kollagen I-proteinet. Samtidigt saknade båda grupperna uttrycket av antifibrotiskt kollagen, och inga skillnader observerades mellan de två grupperna. Sammantaget innebär det att den genaktiverade byggnadsställningen förbättrar ADSCs sårmodulerande respons under mognad.

Figur 3. Parakrin påverkan på dermal läkning och mognad. (A) Ålder dag 14 CM från båda grupperna utövade liknande nivåer av sårtillslutningsaktivitet i humana vuxna dermala fibroblaster med cirka 40 procent på 12 timmar.(B) CM från den genaktiverade ställningen reducerade uttrycket signifikant av pro-fibrotiskt kollagen i fibroblasterna. " indikerar p < 0,05 Data representerar genomsnittlig=standardavvikelse (n=3). I figur 3B står GAS och GFS för genaktiverad ställning respektive genfri ställning.

2.3. B-Klotho genaktiverad ställning förbättrar källarmembranregenerering med förbättrad anti-fibrotisk respons i mänskliga ADSC:er

Efter att ha observerat den genaktiverade byggnadsställningens kontrollerade stimulering av ADSCs funktionalitet, undersökte vi slutligen ADSCs svar mot regenerering av dermala matriser och proteiner. Den genaktiverade ställningen förbättrade kraftigt regenereringen av ADSCs basalmembran. Specifikt främjade den genaktiverade ställningen avsevärt avsättningen av basalmembrankomponenter laminin och kollagen IVFigur 4A). Efter den semikvantitativa analysen noterade vi också att matrisavsättningen följde en trend i förhållande till den genfria ställningsgruppen. Den observerade trenden wasfibronektin (1.0-faldig) < laminin (2.1-faldig, p < {{10}}.05) < kollagen IV (8.8-faldig, p < 0,01). När förmågan att regenerera basalmembranet hade bestämts, utvärderade vi sedan uttrycket av proteiner som är avgörande för överlägsen kvalitativ läkning, såsom minskad ärrbildning. ADSCs på den genaktiverade ställningen visade ett signifikant (p < 0,05) reducerat uttryck av det ärrassocierade kontraktila proteinet a-SMA. a-SMA-uttrycket i ADSCs var lägre med 50 procent jämfört med den genfria ställningsgruppen (Figur 4B). Efter att slutligen ha observerat det reducerade a-SMA-uttrycket, bedömde vi uttrycket av det elastiska matrisproteinet elastin. ADSC:erna på den genaktiverade ställningen visade ett relativt överlägset kvalitativt elastinuttryck genom avsättningen av ett moget fibröst nätverk av elastin jämfört med ADSC:erna på den genfria ställningen (Figur 4B).

Figur 4. Avsättning av pro-sårläkande matrisproteiner av ADSC:erna i den genaktiverade ställningen på dag 14. (A) ADSC:erna i den genaktiverade ställningen visade signifikant regen. drift av basalmembranet jämfört med ADSC i den genfria ställningen. ADSC:erna deponerade övervägande ett relativt moget nätverk av kollagen IV-proteiner, följt av laminin och fibronektin.(B) ADSC:erna i den genaktiverade ställningen uttryckte också 2-falt lägre av SMA-proteinet jämfört med ADSC:erna i genen - gratis ställning. I anslutning till källarmem. kliregenerering avsatte ADSC:erna i den genaktiverade ställningen en kvalitativt bättre elastisk matris. Alla bilder togs genom 20x objektiv med ett IX73 Olympus-mikroskop* och * indikerar p < 0.01 respektive p < 0,05. Skalstång 50um. Data representerar genomsnittlig standardavvikelse (n=3).-SMA och fibronektin var dubbelimmunfärgade.

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950