Anti-allergiska och antiinflammatoriska effekter av Neferin på RBL-2H3-celler
Jul 18, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Abstrakt:Mastceller spelar en mycket viktig roll vid hudallergi och inflammation, inklusive atopisk dermatit och psoriasis. Tidigare har man funnit att referens har antiinflammatoriska och anti-aging effekter på huden, men dess effekt på mastceller har ännu inte studerats i detalj. I denna studie använde vi mastceller (RBL-2H3-celler) och musmodeller för att studera de antiallergiska och inflammatoriska effekterna av referens. Först fann vi att referens hämmar degranuleringen av mastceller och uttrycket av cytokiner. Dessutom observerade vi att när mastceller stimulerades av A23187/phorbol 12-myristat-13-acetat (PMA), hämmades förhöjningen av intracellulärt kalcium genom referens. Fosforyleringen av MAPK/NF-KB-vägen reduceras också genom förbehandling av referensen. Resultaten av in vivo-studier visar att referens kan förbättra uppkomsten av dermatit och mastcellsinfiltration orsakad av dinitroklorbensen (DNCB). Dessutom återställs också uttrycken av barriärproteiner i huden.cistanchSlutligen fann man att referens kan minska repbeteendet som orsakas av förening 48/80. Sammantaget indikerar våra resultat att referens är en mycket bra antiallergisk och antiinflammatorisk naturprodukt. Dess effekt på mastceller bidrar till dess farmakologiska mekanism.
Nyckelord:referens; naturlig produkt; mastcell; dermatit; klåda
1. Introduktion
Många studier har bekräftat att allergiska sjukdomar är resultatet av inte bara medfödd immunaktivering utan även adaptiv aktivering. Bland dem spelar mastceller en mycket viktig roll i en mängd olika allergiska sjukdomar som allergisk rinit, astma och allergisk dermatit. Mastceller uttrycker IgE-receptorer (FceRI) på sina cellmembran, och FceRI-receptorer har en hög affinitet för IgE-antikroppar [1,2]. När antigenspecifikt IgE binder till FceRI uppstår en interaktion och en allergisk reaktion. Aggregeringen av FceRI kan aktivera receptortyrosinkinaser, initiera nedströmsreaktioner och främja fosforyleringen av olika nyckelproteiner (såsom mitogenaktiverat proteinkinas; MAPK), vilket i slutändan leder till inflödet av kalciumjoner (Ca2 plus ), vilket är en nyckelhändelse vid mastcellsdegranulering [3].cistanche AustralienDe aktiverade mastcellerna degranulerar och frigör kemiska mediatorer. Dessa kemiska mediatorer som används vid allergiska reaktioner kan orsaka inflammation [4], så behandlingen av allergiska symtom involverar mastcellsdegranuleringshämmare. Därför används ofta hämningen av IgE-medierad mastcellsdegranulering för att identifiera nya föreningar för att förebygga och behandla allergiska sjukdomar. Det har fastställts att anti-dinitrofenyl (DNP)IgE-antikroppar och -antigener kan inducera passiva hudöverkänslighetsreaktioner (PCA) som en typisk in vivo-modell för omedelbar överkänslighet och som ett forskningsläkemedel för potentialen av anti-antigena allergier [5,6 ]. Dessutom kan mastcellsdegranulering också orsakas av icke-immunstimulerande medel, såsom föreningarna 48/80 och A23187. A23187 kalciumjonofor, har länge varit känt för att stimulera mastcellsekretion med frisättning av förformade mediatorer, såsom histamin från deras granulat, som ett exempel [4]Förening 48/80 är en blandad polymer av p-metoxi-N-metylfenetylamin tvärbunden av formaldehyd, som används i stor utsträckning för oberoende stimulering av mastceller [7,8]Därför har lämpliga mängder av förening 48/80 och A23187 ofta använts som reagens för att studera mekanismen för allergiska reaktioner. Enligt statistiska utvärderingar lider ungefär 15-20 procent av befolkningen av atopisk dermatit. Oavsett om det är barn eller vuxna som lider av denna sjukdom, utan korrekt behandling, kan atopisk dermatit orsaka psykisk oro för patienter och belasta deras familje- och sociala hälsokostnader [9]. Tyvärr finns det ingen lämplig behandlingsmetod för att bota allergisk dermatit. Nuvarande behandlingsalternativ undviker fortfarande sjukdomsframkallande allergener, och kontinuerlig användning av steroider är behandlingens guldstandard. De oundvikliga allergenerna och läkemedels biverkningar har föranlett den brådskande utvecklingen av nya terapeutiska läkemedel. Naturliga föreningar isolerade från medicinska örter och växter är potentiella källor till terapeutiska medel för att förebygga och behandla inflammatoriska sjukdomar och förbättra livskvaliteten för patienter med allergiska sjukdomar.
Cistanche kan anti-aging
Referensen kommer från lotuskärnan (fröets embryo) av växten Nelumbo nucifera och är en viktig bisbensylisokinolinalkaloid. Det finns bevis för att referensen har ett brett spektrum av farmakologiska egenskaper, såsom anti-cancer, antioxidant, antiinflammatoriska och neuroprotektiva effekter, i många sjukdomar [10-15].cistanche fördelarKhan et al. fann att referens ger antifotoåldringseffekter genom att hämma den UV-medierade ökningen av ROS och malondialdehyd(MDA)nivåer i humana keratinocyter och fibroblaster[16,17]Nyligen fann vi att referens har potential som alternativ medicin för behandling av atopisk dermatit eller andra hudrelaterade inflammatoriska sjukdomar[18]. Huruvida referens har en anti-hudallergisk effekt i mastceller är dock fortfarande osäkert. I denna studie syftade vi till att undersöka effekterna av referens på mastcellsmedierade allergiska sjukdomar, med hjälp av mänskliga mastcellinjer (RBL-2H3-celler) och en förening 48/80-och DNCB-inducerad anafylaxi möss modell.
La referencia proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la referencia tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectores, and muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referencia producera efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descubrimos tiena potento medicine que lanatami de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, segue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) och en modello de ratones con anafilaxia in DN/8 DN .
2. Resultat
2.1. Neferin cytotoxicitetstest på råttmastceller (RBL-2H3)
Eftersom basofil leukemi från råtta (RBL)-2H3-celler, en histaminfrisättande mastcellanalog, är lämpliga celler för att undersöka effekterna av mastcellsmedierad inflammation [19], använde vi dessa celler för att undersöka det antiallergiska effekter av referens. Först testade vi om referensen kan producera cytotoxicitet i mastceller. När cellerna förbehandlas med referens från 1 till 30 μM i 24 timmar, kommer cellernas livsduglighet inte att påverkas av referensbehandlingen (Figur 1).
2.2.Neferin minskar degranuleringseffekten av RBL-2H3 stimulerad av olika aktivatorer
RBL-2H3-celler används vanligtvis för in vitro-studier av degranulering [20-22]stimulering av RBL-2H3-cellerna med anti-dinitrofenol (DNP)IgE och DNP-konjugerat humant serumalbumin (HSA) utlöser degranulering. Dessutom är mastceller kända för att degranulera som svar på syntetiska föreningar, såsom förening 48/80 och kalciumjonoforen A23187, och dessa föreningar har använts som lämpliga reagenser för direkta studier av mekanismerna för in vitro allergireaktioner [23, 24]. Resultaten visade att cytoplasman av RBL-2H3 som inte aktiverades av aktivatorn innehöll begränsade sekretoriska granuler.cistanche kolesterolEnbart behandling av referens (10μM) påverkade inte aktiviteten av RBL-2H3 (Figur 2A, B). Tillsatsen av olika aktivatorer, inklusive förening 48/80, A23187 och anti-DNP/IgE plus DNP/HSA, fyllde emellertid tydligt cytoplasman med sekretoriska granuler. Under elektronmikroskopet kan man se att det finns ett stort antal sekretoriska granuler i cytoplasman, och vissa sekretoriska granuler smälter till och med samman med cellmembranet, vilket leder till degranulering (Figur 2C-E). Efter förbehandling med referens 10 uM reducerades de sekretoriska granulerna i cytoplasman signifikant (Figur 2F-H). Dessa resultat indikerar att referens effektivt kan hämma aktiveringen och degranuleringen av RBL-2H3 som stimuleras av aktivatorn.
2.3. Neferin hämmar PMA/A23187-Inducerad intracellulär kalciumhöjning i RBL-2H3
Kalciumjoner spelar rollen som sekundär budbärare i processen för cellaktivering. A23187 är det mest effektiva sättet att öka penetrationen av kalciumjoner genom cellmembran och stimulera aktiveringen av mastceller. Forbolmyristatacetat (PMA) kan aktivera proteinkinas Cand och öka intracellulära kalciumjoner för att förstärka effekten av A23187. Ökningen av kalciumjoner i mastceller har också ansetts vara en viktig faktor för att inducera mastcellsaktivering så att den påverkar degranuleringen av mastceller och frigör fler inflammatoriska cytokiner och kemokiner.cistanche deserticola biverkningar,Därför försökte den här studien undersöka om referensen kan hämma kalciumjonkoncentrationen i RBL-2H3 när den hämmar inflammation. Den experimentella gruppen delades upp i med eller utan referensförbehandling under 20 minuter och 1 mM CaClz och PMA/A23187 tillsattes för att stimulera och aktivera RBL-2H3. De experimentella resultaten visade att behandling av RBL-2H3 med olika referenskoncentrationer enbart inte påverkade ökningen av intracellulär kalciumjonkoncentration. I den PMA/A23187-inducerade Ca2t-inflödesgruppen ökade den intracellulära kalciumjonkoncentrationen signifikant. RBL-2H3-celler förbehandlades i 20 minuter med referens (3 μM och 10 μM), och kalciumjonkoncentrationen reducerades signifikant (Figur 3).
2.4. Neferin minskade mRNA-uttrycket av pro-inflammatoriska cytokiner i PMA/A23187 stimulerad av RBL-2H3
Hudens immunsvar kommer att öka antalet mastceller i kroppen, och mastcellerna kommer då att producera pro-inflammatoriska cytokiner och påskynda utvecklingen av sjukdomen. Proinflammatoriska cytokiner, speciellt TNF-a, IL-6, IL-1 och IL-8, inducerar inte bara inflammation utan orsakar också leukocytinfiltration, granulombildning och vävnadsfibros. PMA/A23187 verkar på mastceller och inducerar dem att producera IL-16, IL-6, TSLP och TNF-, vilket orsakar allergirelaterad inflammation. Därför förbehandlade vi RBL-2H3 med referens i 20 minuter och stimulerade med PMA/A23187 i 6 timmar för att detektera om referensen kan nedreglera mRNA-uttrycket av IL-1, IL{{ 19}}, TSLP och TNF-a. Resultaten visade att i gruppen som behandlades med enbart referens påverkades inte uttrycket av cytokin-mRNA, och uttrycket av mRNA i gruppen som inducerade inflammation av PMA/A23187 ökade signifikant. I gruppen som behandlades med referens observerades det att mRNA-expressionsnivåerna för IL-1, IL-6, TSLP och TNF-a var signifikant undertryckta (Figur 4).
2.5. Neferin hämmar PMA/A23187-Inducerad fosforylering av MAPK-vägen i RBL-2H3
Tidigare studier har påpekat att mastceller behöver frigöra intracellulära kalciumjoner för att aktivera MAPK. Dessutom reglerar MAPK-signalvägen uttrycket av monocyter, T-lymfocyter, B-lymfocyter, cytokiner och kemokiner och inducerar autoimmunitet. Denna mekanism liknar aktiveringsvägen för PMA/A23187. I denna studie undersökte vi om referensen kan delta i regleringen av MAPK-vägar. Vi behandlade olika referenskoncentrationer (1,3 och 10 uM) till RBL-2H3 i 20 minuter och stimulerade sedan med PMA/A23187 i 30 minuter för att inducera inflammation. Resultaten visade att när RBL-2H3 behandlades med olika referenskoncentrationer enbart påverkades inte aktiveringen av p38-, JNK- och ERK-proteiner. I gruppen som behandlades med enbart PMA/A23187 fann vi att p38-, JNK- och ERK-proteiner aktiverades och har signifikant fosforylering. I gruppen förbehandlad med referens observerades det att för högre referenskoncentrationer reducerades fosforyleringen av p38-, JNK- och ERK-proteiner signifikant (Figur 5A-C).
2.6. Neferin hämmar PMA/A23187-Inducerad fosforylering av NF-B-vägen i RBL-2H3
Uttrycket av pro-inflammatoriska cytokiner beror på aktiveringen av transkriptionsfaktorn NF-kB i mastceller. När IKB-proteinet fosforylerades och bröts ned frisattes NF-kB och migrerade in i kärnan, bindande med dess motsvarande DNA-responsiva element och främjade transkriptionen av proinflammatoriska mediatorer. Många cytokiner och kemokiner producerades, som reglerar immunsvar, differentiering och inflammation. Därför undersökte vi om förbehandling med referens påverkar proteinfosforylering inducerad av PMA/A23187. Vi behandlade olika referenskoncentrationer (1,3 och 10 μM) till RBL-2H3. Efter 20 minuter stimulerade PMA/A23187 RBL-2H3 i 1 timme eller 2 timmar för att inducera inflammation. Resultaten visade att behandling av RBL-2H3 med olika referenskoncentrationer enbart inte påverkade fosforyleringen av IKBa och NF-KB. När PMA/A23187 användes för stimulering observerades en signifikant ökning av fosforyleringen av IkBo och NF-KB. I gruppen som förbehandlats med referens fann man att fosforyleringen av IkBa (Figur 6A) och NF-KB (Figur 6B) reducerades signifikant.
2.7.Neferins effekt på 2,4-dinitroklorbensen(DNCB)inducerad atopisk dermatit
DNCB, en djurmodell för sjukdomsforskning, är ett representativt irriterande ämne som orsakar atopisk dermatit[25]. Vårt experiment använder 1 procent dinitroklorbensen (DNCB) löst i 75 procent alkohol för att inducera det första steget av sensibiliseringssvar. Referens (3mg/kg och 10 mg/kg) och dexametason (Dexa,{{10}},2 mg/kg) lösta i DMSO administrerades intraperitonealt på den femte dagen i tio dagar . På den 8:e, 1:a och 14:e dagen applicerades 0,5 procent DNCB som det andra steget för att inducera inflammation. Möss delades in i fyra grupper - kontrollgrupp, DNCB-grupp, referensbehandlad grupp och dexametasonbehandlad grupp - och sedan, efter jämförelse mellan grupperna, noterades skillnaderna. Vi observerade att DNCB inducerade en atopisk hudinflammationsreaktion på huden hos möss. Efter applicering av DNCB visade det sig att huden på mössen ökade rodnad och fjällning. Dessa beror alla på onormal keratinocytproliferation, infiltration och aggregering av immunceller. Gruppen som behandlades med referens 3 mg/kg och dexametason 0,2 mg/kg under fyra dagar hade lindrat rodnad. Vi fortsatte att observera tillståndet hos mössens rygghud fram till dag 15. Jämfört med kontrollgruppen hade DNCB-gruppen allvarligt röda och svullna hudtillstånd, och det fanns mjäll och sår som verkade orsakas av klåda och smärta . Vi kan hitta en trend av minskande grad efter behandlingar av referens och dexametason (Figur 7A). Toluidinblå färg användes för att observera antalet aggregerade mastceller. Mastcellerna verkade lila när de observerades under ett mikroskop. Det kan kvantitativt visas att många mastceller infiltrerade och ackumulerades i dermis i DNCB-experimentgruppen, vilket ökade signifikant jämfört med kontrollgruppen. I gruppen som behandlades med referens och dexametason minskade infiltrationen, aggregationen och antalet mastceller (Figur 7B, C).
2.8 Neferin förbättrar mRNA-uttrycket av barriärrelaterade molekyler efter behandling av DNCB
Den hudrelaterade inflammationen som orsakas av AD kan orsaka onormal hudbarriärfunktion. Om hudbarriären är defekt är det lättare för antigener eller irriterande ämnen att penetrera hudens epidermis och komma in i kroppen för att framkalla immunrelaterade reaktioner. Samtidigt kommer produktionen av differentieringsproteiner, inklusive filaggrin, loricrin och involukrin, att undertryckas. Därför är det mycket viktigt att återställa den skadade hudbarriären för att förebygga och behandla AD [26]. I vår studie använde vi referenser för att ingripa i djurmodellen av DNCB-inducerad atopisk dermatit. Efter att ha offrat möss grundades den dorsala hudvävnaden för RI-qPCR-analys för att utvärdera om referensen kan förbättra mRNA-uttrycksminskningen i filaggrin, loricrin och involukrin efter behandling av DNCB. Resultaten visade att DNCB-experimentgruppen hade signifikant minskat mRNA-uttryck av filaggrin, loricrin och involukrin jämfört med kontrollgruppen. mRNA-uttrycket av filaggrin, loricrin och involukrin ökade signifikant i gruppen som behandlades med referens och dexametason jämfört med DNCB-gruppen (Figur 8).
Vi bevisade vidare att referens har en anti-allergisk repande effekt. Vi använde ett mastcellsdegranuleringsmedel, förening 48/80, för att inducera repbeteende hos BALB/c-möss. Som visas i figur 9 fann vi att referensbehandlingen hämmade repbeteendet orsakat av förening 48/80 (50 ug/plats). Upprepad administrering av lägre och högre referensdoser (3 och 10 mg/kg) under 5 dagar i följd reducerade signifikant antalet repor orsakade av förening 48/80.
