Antimelanogeneseffekter av bladextrakt och fytokemikalier från ceylonoliver (Elaeocarpus Serratus) i zebrafiskmodell
Mar 23, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Chi-Ya Huang 1, I-Hsuan Liu 2, Xiang-Zhe Huang 1, Hui-Jen Chen 1, Shang-Tzen Chang 1, Mei-Ling Chang 3, Yu-Tung Ho 1 och Hui-Ting Chang 1,*
Abstrakt:Demelanogeneshämmande effekt hos zebrafisk (Danio rerio) ochantityrosinasaktiviteten hos den etanoliskaextraheraoch dess fytokemikalier från ceylonoliverblad (Elaeocarpus serratus Linn.) undersöktes i denna studie. Bland bladextraktet och fyra lösliga fraktioner uppvisar den etylacetatlösliga fraktionen det bästa antityrosinaset ochantimelanogenesaktiviteter. En fenolsyra, gallsyra och två flavonoider, myricetin, och betyder tenn, isoleras från de aktiva underfraktionerna genom den bioassayledda isoleringen; deras strukturer belyses baserat på 1D och 2D NMR, FTIR, UV och MS spektroskopiska analyser. Dessa föreningar har betydandeantityrosinasaktivitet med användning av L-tyrosin eller L-DOPA som substrat; mearnsentin visar den optimala aktiviteten. I den enzymekinetiska undersökningen är både gallsyra och mearnsetin de kompetitiva hämmarna mot svamptyrosinas, och myricetin fungerar som en blandad typtyrosinasinhibitor. Bladextraheraoch anetylacetatlöslig fraktion visar effektiva prestanda vid hämning av melaninbildning i zebrafiskembryon. Mearnsetin har också en lovande antimelanogeneseffekt, som är överlägsen den positiva kontrollen,arbutin. Resultaten visar att extraktet av ceylonoliven och dess fytokemikalier, särskilt mearnsetin, har potential att användas somantimelanogenesoch hudblekande ingredienser.
Nyckelord: antimelanogenesis effekt; Elaeocarpus serratus; melanin; tyrosinashämmare; zebrafisk
Herba cistancheshämmar tyrosinasaktivitet.
1. Introduktion
Melanin spelar en viktig roll i många biokemiska funktioner; det ger skydd åt huden från ultravioletta (UV) skador, eliminering av reaktiva syrearter (ROS) och andra biokemiska reaktioner [1–3]. Den överdrivna ansamlingen av melaninal leder också till hyperpigmentering, melasma, åldersfläckar, mörkare hud, etc. [4,5]. I östvärlden är människor intresserade av frågan om blekningseffekten på huden; kosmetikaindustrin är dedikerad till att utveckla hudblekande kosmetika mot melanogenes. Det finns flera mekanismer, bl.atyrosinashämmande aktivitet, avlägsnande av melanocyter och interferens med melaninsyntes för att uppvisa melanogenesinhiberande aktivitet. De lovande reagensen som hämmar melanogenes har undersökts sedan 1940-talet [2,4,6,7]. Dock delmelanogeneshämmare har vissa biverkningar; t.ex. kan hydrokinon orsaka exogen ochronos och permanent hypomelanos [5,8]. Överdriven kojinsyra kan resultera i allergi och sköldkörteltumörer [9,10].
Nyligen har forskare ägnat sig åt att hitta lovande melanogena reagenser med inga/lindriga biverkningar från växtnaturprodukter [11–13]. Naturligtyrosinashämmare från växtkällor har rapporterats, inklusive enkla fenoler, fenolsyror, stilbener, flavonoider, lignaner, terpenoider, kinoider, etc. [2,14-16]. Solano et al. uppgav att fenolföreningar och de andra naturliga föreningarna har den stora potentialen formelanin-hämning, t.ex. arbutin (en fenolglukosid som finns i Arctostaphylos uva-ursi), extraktet av grönt te, alfa-hydroxylsyra (AHA), askorbinsyra, och så vidare [5 ].Arbutinanvänds i stor utsträckning som en nyckelingrediens i kommersiella blekningsprodukter på marknaden [4,17]. Gallocatechin-3-O-gallat (GCG), epigallocatechin-3-O-gallat (EGCG) och epicatechin {{6 }}O-gallat (EKG) identifierades i det gröna teetextrahera; dessa föreningar har god tyrosinashämmande effekt [17]. Arctigenin, en lignan isolerad från Fructus arcticextract, kan minska melaninhalten i embryon från zebrafisk (Danio rerio) [18]. Lee et al. rapporterade att ginsenosider från Panax ginsengblad och bär hämmarmelanogenesav zebrafiskembryot; de aktiva ginsenosiderna är ginsenosid Rh6, vina-ginsenosid R4, vina-ginsenosid R13, ginsenosid Rh23 och floralginsenosid A [19–21].
Elaeocarpus serratus Linn. (Tiliaceae), vanligen kallad Ceylonoliven, distribueras i Afrika, Australien och Sydostasien. Inläggningen gjord av den ätbara frukten av Ceylonoliven är vanlig i Sri Lanka [22]. Det används traditionellt för att förhindra huvudlöss och mjäll i Sri Lanka. Bioaktiviteter av E. serratus-extrakt utvärderades i de relaterade studierna [22,23]. E.serratus bladextrakt hade antibakteriell aktivitet mot Plesiomonas, Salmonella typhi och Proteus spp. vid koncentrationen 400 µg/ml genom platthålsdiffusionsanalysen [23].E. serratusbladextrakt hade potentialen att vara ett antitumör-, antimikrobiellt och pesticidreagens i cytotoxicitetsundersökningen av artemia salinas dödlighetsanalys; bladets LC50extraheravar 40 µg/ml mot artemiaräkan [23]. Antioxidantflavonolglykosider, inklusive myricitrin, mearnsetin 3-O- -D-glukopyranosid, mearnsitrin och tamarixetin 3-O- -L-rhamnopyranosid, isolerades och identifierades från E. serratusleaf-extraktet [22].
Syftet med denna studie är att utvärdera effekterna av E. serratus bladextraheraoch dess bråkdelar påantityrosinasaktivitet (in vitro) ochmelanogenesinhiberande aktivitet inzebrafisk (in vivo). Bioassay-guided fraktionering och isoleringstekniker utfördes för att hitta de lovande föreningarna som potentiella antimelanogenesingredienser. Utveckling av effektiva ingredienser mot melanogenes kan öka det optimala utnyttjandet av naturliga växtprodukter inom läkemedels- och kosmetikindustrin.
2. Material och metoder
2.1. Växtmaterial och utvinning
Ceylon oliv (Elaeocarpus serratus), runt 50 år gamla, löv samlades in från National Taiwan University, Taipei, Taiwan i september. Färska löv (3,95 kg) extraherades med 95 procent etanol under 7 dagar vid rumstemperatur. Den filtreradeextraheratorkades under reducerat tryck med en rotationsindunstare med en badtemperatur på 5 0 ◦C [24]. Utbytet av bladextrakt (0,32 kg) var 12,0 procent (vikt/vikt av torkad vikt).
cistancheextrahera
2.2. Vätska-vätskepartition
Deextraherautsattes för successiv extraktion av organiskt lösningsmedel i ökande polaritetsordning genom vätske-vätskefördelning [24,25]. Bladextraktet fraktionerades i hexanlöslig fraktion (HF, 9,1 procent), etylacetatlöslig fraktion (EF, 11,3 procent), n-butanollöslig fraktion (BF, 17,3 procent) och vattenlöslig fraktion (WF, 31.{ {13}} procent).
2.3. Kolumnkromatografi och tunnskiktskromatografi
Bioaktiv etylacetatlöslig fraktion fraktionerades ytterligare genom silikagelkolonnkromatografi (CC). Kromatografi med öppen kolumn utfördes genom stegvis eluering med olika förhållande mellan n-hexan och etylacetat [26]. Nitton subfraktioner (E1–E19) erhölls genom tunnskiktskromatografi (TLC) [27]. Utbyten av delfraktioner var E1(1.05 procent), E2 (8,21 procent), E3 (1,64 procent), E4 (0,74 procent), E5 (1,52 procent), E6 ({ {59}}.86 procent ), E7 (1,51 procent ), E8 (9,50 procent ), E9 (7,78 procent ), E10 (3,97 procent ), E11 (2,65 procent ), E12 (8,49 procent ), E13 (5,58 procent), E14 (4,43 procent), E15 (5,31 procent), E16 (1,14 procent), E17 (1,87 procent), E18 (0,76 procent) och E19 (2,96 procent).
2.4. Högpresterande vätskekromatografi
Aktiva subfraktioner av etylacetatlöslig fraktion analyserades och isolerades med högpresterande vätskekromatografi (HPLC, L-2130, Hitachi, Tokyo, Japan) försedd med en preparativ RP-18-kolonn (Purospher®, STAR RP{{ 3}} ändlock, 250 × 10 mm,5 µm). Den mobila gradientfasen bestod av vatten (A) och acetonitril (B). Flödeshastigheten var 3 ml/min. Elueringsprogrammet involverade en linjär gradient från 30 till 35 procent B i A under 0–15 minuter, 35 till 100 procent B i A i 15–25 minuter och följt av 5 minuters jämvikt med 100 procent B. De eluerade topparna detekterades av en UV-detektor vid 254 nm [25,28].
2.5. Identifiering av isolerade föreningar
Strukturerna för isolerade föreningar bestämdes och karakteriserades med hjälp av spektralanalyser, inklusive ultraviolett-synlig spektroskopi (UV/VIS, V-550, Jasco, Tokyo, Japan), Fouriertransform infraröd spektroskopi (FTIR, FTS{{2} }, Bio-rad, Hercules, CA, USA), och masspektroskopi (MS, MAT-958, Finnigan, MA, USA). Kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR), inklusive 1D (1H-NMR, 500 MHz; 13C-NMR, 125 MHz) och 2D NMR (HSQC och HMBC), registrerades med en Bruker AVIII NMR-spektrometer (Bruker Avance, Rheinstetten, Tyskland) [ 29–32].
2.6. Antityrosinasanalys och enzymkinetisk studie
In vitroantityrosinasanalysen var en spektrofotometrisk analys baserad på de metoder som tidigare beskrivits [33-35]. L-DOPA (3,4-dihydroxifenylalanin) och L-tyrosin användes som substrat, respektive. I 96-brunnens mikroplattor blandades 40 µL provlösning och 70 µL kaliumfosfatbuffert (0,1 M, pH 6,8), vilket följdes av tillsats av 50 µL 200 enheter/ml svamptyrosinas ( EC1.14.18.1) efter inkubation vid 25 ◦C i 10 min. Sedan tillsatte vi 40 µL 2,5 mM substrat (L-tyrosin/L-DOPA) i brunnen och blandningen inkuberades i 10 minuter. Efter inkubation mättes absorbansen vid 475 nmof varje brunn med ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) läsare (SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, Offenburg, Tyskland). Den positiva kontrollen vararbutin, och antalet replikeringar var tre. Den procentuella hämningen avtyrosinasaktiviteten beräknades med följande ekvation: Inhibering ( procent )=[(Acontrol–Acontrols blank)–(Acontrol–Acontrols blank)/(Acontrol–Acontrols blank)] × 100. Sedan, den halvmaximala hämmande koncentrationen ( IC50) för provet beräknades från koncentration-responskurvan.
Enzymkinetisk studie analyseras av Lineweaver–Burks reciproka plot av reaktionshastigheten och koncentrationen av substratet för att utvärdera effekten av provet på substratets och enzymets affinitet. Koncentrationen avtyrosinashölls konstant vid 200 enhet/ml, medan substratkoncentrationen (L-tyrosin/L-DOPA) varierades vid 0.5, 0.75,1.0 1,25 och 1,5 mM. Reaktionen liknade antityrosinasanalys enligt beskrivningen ovan; 40 µL provlösning och 70 µL kaliumfosfatbuffert (0,1 M, pH 6,8) blandades, vilket följdes av tillsats av 50 µL 200 enheter/ml tyrosinas, efter inkubation vid 25 C i 10 min. Sedan tillsatte vi 40 µL av substratet i brunnen och blandade det noggrant, och kinetiska mätningar av lösningen mättes omedelbart under en period av 3 minat den detekterade våglängden (475 nm). Båda kinetiska parametrarna, Michaelis-Menten konstant (Km) och maximal hastighet (Vmax), beräknades från Lineweaver-Burk linearequation [36-38].
2.7. Utvärdering av antimelanogeneseffekt hos zebrafisk
Zebrafisk (Danio rerio) av vildtyp AB-stam hölls i en frisk vattenmiljö vid 26–30 ◦C, med en 14:10 timmars ljus-mörkercykel. Efter 9 timmar efter befruktning (hpf) placerades embryon i en 24-brunnsplatta (3 embryon per brunn), behandlades med olika slutkoncentrationer av prover upplösta i 1 procent DMSO och inkuberades vid 28 ◦C i 48 timmar (vid 57 hpf). Den digitala bilden av ett levande zebrafiskembryo togs genom ett stereomikroskop (Olympus SZ61, Tokyo, Japan) med en total förstoring av 40×; sedan analyserades melanininnehållet i zebrafiskembryot med ImageJ-mjukvaran. Positiva kontroller vararbutin(kommersiell hudblekningsingrediens) och 1-fenyl-2-tiourea (PTU, en melaninsynteshämmare). Antalet replikationer var sex [21,39,40].
2.8. Statistisk analys
Data som erhölls i studien analyserades av Statistical Analysis System (SAS) v 9.2 (Cary, NC, USA) med Scheffes test, som är en post hoc multipel jämförelsemetod. Konfidensintervallet sattes till 95 procent.
dr vita OPC iblekning av huden
3. Resultat och diskussion
3.1. Antityrosinasaktivitet av E. serratus bladextrakt och dess fraktioner
Det schematiska diagrammet över extraktion, isolering, identifiering,antityrosinasaktivitet ochantimelanogeneseffekt av E. serratus bladextraheravisas i figur 1. Bladextraktet fraktionerades vidare till n-hexanlöslig fraktion (HF), etylacetatlöslig fraktion (EF), den lösliga n-butanolfraktionen (BF) och en vattenlöslig fraktion (WF) med vätska -vätskepartition.
Tyrosinas, producerat av melanocytceller, spelar en nyckelroll för att katalysera den komplicerade melaninsyntesen; utforskningen avtyrosinasinhibitor är ett av de framträdande sätten att retarderamelanogenes[2,5,41]. Tyrosinashämmande aktiviteter hos bladextraheraoch fyra fraktioner visas i figur 2. När L-tyrosin användes som substrat hade endast den etylacetatlösliga fraktionen den hämmande effekten mot tyrosinas vid koncentrationen 400 ug/ml. Bladextrakt, etylacetatlöslig fraktion och n-butanollöslig fraktion uppvisade antityrosinasaktiviteten vid byte av L-DOPA som substrat. Bland bladextrakt och fyra fraktioner visade den etylacetatlösliga fraktionen bästantityrosinasaktivitet med IC50-värdena på 279,38 och 166,95 ug/ml vid användning av L-tyrosin respektive L-DOPA som substrat (tabell 1).
Tabell 1. IC50-värden för aktiva subfraktioner mot svamptyrosinas.
Den etylacetatlösliga fraktionen utsattes för den bioanalysstyrda fraktioneringen med hjälp av preparativa kolonnkromatografiska och tunnskiktskromatografiska tekniker, och nitton subfraktioner (E1–E19) erhölls. Bland dessa subfraktioner visade E7–E10 subfraktioner den högre tyrosinashämmande effekten i båda substratanalyserna (L-tyrosin och L-DOPA). Halvmaximal inhiberande koncentration (IC50) värden för aktiva subfraktioner mottyrosinasges i tabell 1. IC50-värdena för alla E7–E10-subfraktioner var under 200 µg/ml; E7 och E9 subfraktioner visade till och med bättre prestanda jämfört medarbutin, som är en kommersiell blekningsingrediens.
3.2. Isolering och identifiering av föreningar från bioaktiva subfraktioner
Tre föreningar (ES1–3) isolerades från bioaktiva subfraktioner (E7–E10) genom högpresterande vätskekromatografi. Gallsyra (ES1): vitt pulver; smp 257 grader; UV (MeOH) Xmax (log e) 215,5 (3,94), 268. 0 (3.46) nm; IR (KBr) vmax 3495, 3416, 3285, 1647, 1542 och 1220 cm-1; EI-MS m/z 171 [M plus H] plus , i överensstämmelse med molekylformeln C7H6O5. Myricetin (ES2): gul nål; smp 358 grader; UV (MeOH) Xmax (log e) 252,5 (4,43) och 374,0 (4,50) nm; IR (KBr) vmax 3421, 1663, 1596, 1520, 1229, 1202 och 1171 cm-1; EI-MS m/z 319,36 [M plus H] plus, molekylformel C15H10O8. Mearnsetin (4'-O-metylmyricetin, ES3): gult pulver; smp 184 grader; UV (MeOH) Xmax (log e) 259,5 (4,21) och 364,5 (4,26) nm; IR (KBr) vmax 3409, 2960, 2927, 2853, 1661, 1599, 1507, 1208 och 1163 cm-1; EI-MS m/z 333,0 [M plus H] plus, molekylformel C16H12O8. NMR-data för dessa föreningar sammanfattas i tabell 2. De kemiska strukturerna för de identifierade föreningarna visas i figur 3.
Tabell 2. IH, 13C och HMBC NMR-data för föreningar.
Bland dessa föreningar är gallsyra en fenolsyra; myricetin och mearnsetin tillhör flavonoider. Innehållet av varje förening i etylacetatlöslig fraktion och E7–E10-subfraktioner listas i tabell 3. E7-subfraktionen var rik på mearnsetin (433,38 mg/g); den primära E8-subfraktionen innehöll gallsyra (417,64 mg/g). Huvudbeståndsdelen i underfraktionerna E9 och E10 var myricetin (406,41 respektive 336,41 mg/g). Innehållet av tre föreningar i den etylacetatlösliga fraktionen var 59,72 mg/g (gallinsyra), 45,21 mg/g (myricetin) och 22,66 mg/g (mearnsetin).
3.3. Antityrosinasaktivitet och enzymkinetisk studie av isolerade föreningar
Antityrosinasaktiviteten hos dessa föreningar från aktiva subfraktioner representerades i tabell 4. När L-tyrosin användes som substrat, var ordningen för antityrosinasaktivitet för de undersökta föreningarna mearnsetin > myricetin > gallussyra > arbutin; mearnsetin hade den bästa hämmande effekten med IC50-värdet på 56,57 µg/ml (0,17 mM). Liknande resultat observerades i L-DOPA som användes som substrat; effektiviteten hos tre fytokemikalier var överlägsen den hosarbutin.
En äkta enzyminhibitor innehåller fyra sätt av hämning, inklusive kompetitiv, icke-konkurrenskraftig, blandad typ (både konkurrenskraftig och icke-konkurrenskraftig) och icke-konkurrenskraftig [12]. Kinetiska konstanter, Km och Vmax, bestäms av enzymets initialhastighet vid olika substrat koncentrationer i plottet Lineweaver–Burk; de skär varandra vid y-axeln är ekvivalent med 1/Vmax, och de skär varandra vid x-axeln är −1/Km. I enzymkinetisk studie av terpenoidföreningar från citrusskal eterisk olja mottyrosinas, citralagerad som en icke-kompetitiv hämmare, och myrcene var en kompetitiv hämmare [36]. Hämningsmekanismen för 3,7-dioleylquercetin mot svamptyrosinas var genom den kompetitiva hämningsmodellen för att undertrycka produktionen av melanin [42].
Tabell 4. IC50-värden för föreningar mot svamptyrosinas
Inhiberingstypen på tyrosinas av tre fytokemikalier klargjordes av en kinetisk in vitroenzymstudie. Figur 4 visade Lineweaver-Burk-plotten (dubbel ömsesidig plot) av mearnsetin. I analyserna av båda substraten, L-tyrosin och L-Dopa, hade den linjära regressionslinjen för olika koncentrationer av mearnsetin samma skärning på y-axeln och den ökande lutningen. De kinetiska parametrarna för gallussyra, myricetin och mearnsetin sammanfattas i tabell 5. I närvaro av gallussyra eller mearnsetin observerades en ökning av Km och en konstant i Vmax, vilket indikerar att både gallussyra och mearnsetin var den kompetitiva hämmaren av tyrosinas. Det indikerade att gallsyra och mearnsetin kunde binda till friatyrosinasmed hög affinitet och förhindra att substrat (L-tyrosin eller L-DOPA) binder till det aktiva stället för tyrosinas. Myricetin visade sig vara en hämmare av blandad typ, innehållande kompetitiv och icke-kompetitiv hämning eftersom Km ökades och Vmax minskade. Icke-kompetitiv hämning visade att föreningar binder till tyrosinas-substratkomplexet men inte till det fria tyrosinaset.
3.4. Antimelanogeneseffekter av extrakt, fraktioner och isolerade fytokemikalier
Zebrafisk (Danio rerio) är en ny och giltig modellorganism för melanogenesforskning i nyare studier [18–21,40]. Deantimelanogeneseffekter av bladextrakt och fyra fraktioner i zebrafiskanalysen in vivo visas i figur 5. Bladetextraheraoch etylacetatlöslig fraktion uppvisade goda prestanda vid hämning av melaninbildning embryon från inzebrafisk. Vid en koncentration av 200 µg/ml hämmade bladextraktet och den etylacetatlösliga fraktionen 27,72 procent respektive 35,60 procent av melaninproduktionen hos zebrafiskembryon. Alla behandlingar påverkade inte tillväxten av zebrafiskembryon med en överlevnadsgrad på 100 procent.
Figur 6 presenterade effekterna av föreningar och positiva kontroller, PTU och arbutin, påmelanogenesav zebrafisk i en koncentration av 50 µM. PTU är en starktyrosinashämmare för att förhindra melaninproduktion, medanarbutinär ett kommersiellt hudblekmedel; båda positiva kontrollerna kan minska melaninbildningen hos zebrafisk. Bland tre fytokemikalier visade myricetin en lätt melaninhämmande effekt, medan mearnsetin hade den bättre melanogeneshämmande aktiviteten hos zebrafisk.
De effektiva koncentrationerna avmelanogenes inhibition activity in zebrafish of compounds are listed in Table 6. IC50 values of PTU and arbutin were 26.29 µM and 323.69 µM, respectively. The order of antimelanogenesis activity of examined compounds was PTU >mearnsetin >arbutinoch myricetin > gallussyra. Mearnsetin uppvisade den bästa effekten med ett IC50-värde på 121,01 µM bland undersökta fytokemikalier.
För mer information, klicka på bilden.
4. Sammanfattningar
Demelanogeneshämmande effekt ochantityrosinasaktiviteten hos bladextrakt från ceylonoliven (E. serratus) utvärderades i denna studie. Bland bladextraheraoch dess fyra fraktioner, etylacetatlöslig fraktion hade bästantityrosinasaktivitet. Fytokemikalier, inklusive gallussyra, myricetin och mearnsetin, isolerades och identifierades från de aktiva subfraktionerna genom bioassay-guided kromatografi och spektralanalyser. Ordningen för antityrosinasaktivitet för dessa föreningar var mearnsetin > myricetin > gallussyra. Den kinetiska studien av enzymer in vitro avslöjar att gallussyra och mearnsetin var kompetitiva hämmare av tyrosinas, och myricetin var en hämmare av blandad typ. Resultat från zebrafisken in vivo-analysen visade att en etylacetatlöslig fraktion och tre fytokemikalier hade betydandemelanogeneshämmande effekter. Mearnsetins antimelanogeneseffekt var överlägsen den hos den positiva kontrollen,arbutin, i zebrafisk.
