Lämplig träningsnivå dämpar tarmdysbios och ökning av valeriansyra för att förbättra neuroplasticitet och kognitiv funktion efter operation i möss Del 3

MATERIAL OCH METODER

De experimentella protokollen och procedurerna godkändes av den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid University of Virginia (Charlottesville, VA, USA; protokollnummer: 3114).

Minne är en av de förmågor vi ofta behöver använda i vårt dagliga liv. Det kan göra människor smartare, känsligare och mer gynnsamma för karriär och mellanmänskliga relationer. Därför vill många förbättra sitt minne. Det finns ett samband mellan experimentella protokoll och minne. Låt oss utforska denna fråga härnäst.

För det första kan experimentella protokoll hjälpa människor att förbättra sitt minne. I experimentet måste människor följa vissa steg för att slutföra den experimentella operationen. Denna steg-för-steg-aktivitet kan försätta den mänskliga hjärnan i ett tillstånd av hög uppmärksamhet och koncentration, vilket främjar utförandet av hjärnfunktioner. Samtidigt måste du komma ihåg vissa experimentella data och experimentella steg under experimentet, vilket också kommer att utöva hjärnans minnesfunktion. Genom att upprepade gånger öva på detta sätt kommer ditt minne gradvis att förbättras.

För det andra är den sensoriska upplevelsen under minnesprocessen också nära relaterad till utformningen av experimentplanen. I experiment ställer designers ofta in vissa specifika uppgifter under experimentet, så att deltagarna behöver upprepa samma operation flera gånger, såsom minne och skrivning av siffror, minne och igenkänning av färgblock etc. Denna repetitiva upplevelse kan stärka människors uppmärksamhet och minnesförmåga, vilket gör det lättare för människor att bearbeta denna information till långtidsminnet.

Dessutom, i experiment, kan användningen av representativa stimulansmaterial (som bilder, ljud, lukter etc.) också ge goda resultat. Eftersom dessa stimuli kan trigga hjärnans spänning och minnesprocesser, och därigenom förbättra människors minnesförmåga. Samtidigt kan dessa stimuli också kopplas ihop med miljön och situationer i livet, vilket minskar förekomsten av frikoppling och gör informationen lättare att komma ihåg och mer sammanhållen.

Sammanfattningsvis spelar experimentplanen en avgörande roll för att förbättra mänskligt minne. Genom att utföra experiment kan människor träna sina kognitiva förmågor, förbättra sina minnesnivåer och samtidigt främja hjärnans funktion. Därför bör vi fortsätta att lära oss nya experimentella metoder och delta i fler experiment för att förbättra våra minnesnivåer och ge större bidrag till våra karriärer, relationer och hälsa. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt, eftersom Cistanche deserticola har antioxidant-, antiinflammatoriska och anti-aging-effekter, vilket kan hjälpa till att minska oxidation och inflammatoriska reaktioner i hjärnan, och därigenom skydda nervsystemets hälsa. Dessutom kan Cistanche deserticola också främja tillväxt och reparation av nervceller, vilket förbättrar anslutningen och funktionen hos neurala nätverk. Dessa effekter kan bidra till att förbättra minnet, inlärningsförmågan och tankehastigheten, och kan också förhindra utvecklingen av kognitiv dysfunktion och neurodegenerativa sjukdomar.

Klicka på Vet korttidsminne hur du kan förbättra

Alla djurexperiment utfördes av National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publikationer nummer 80–23) reviderade 2011. Källorna till nyckelmaterial listades i nyckelresurstabellen i tilläggsmaterialet.

Djur och experimentell design

Åtta veckor gamla C57BL/6 J-möss av hankön som vägde 19–22 g hölls i ett rum som hölls under konstanta miljöförhållanden (temperatur 22–24 grader, en 12 timmars ljus/mörkercykel och 50 ± 10 % luftfuktighet) med fri tillgång till mat och vatten.

Alla fick acklimatisera sig i en vecka före experimenten. De tilldelades slumpmässigt följande grupper i det första experimentet: (1) kontrollgrupp (som inte exponerades för anestesi och kirurgi), (2) träningsgrupp (tränad med 35–40 % maximal kapacitet, men inte exponerad för anestesi och operation) , (3) operationsgrupp (exponering av vänster halspulsåder i 15 minuter under isofluranestesi i 2 timmar), och (4) till (6) Exe-l+Sur-, Exe-m+Sur- och Exe-h+Sur-grupper: tränade vid 35 –40 %, 55–60 % respektive 75–80 % maximal kapacitet och utsattes för anestesi och operation.

Djuren användes för inlärnings- och minnestester med början 4 dagar efter operationen (n=20) eller deras hjärnor skördades för biokemiska analyser 6 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar och 7 dagar efter operationen (n=9 eller 14), för immunfluorescerande färgning 48 timmar och 19 dagar efter operationen (n=6), och för Golgi-färgning 19 dagar efter operationen (n=8).

Blod och avföring från möss i de första 4 grupperna skördades för mätning av SCFAs 7 dagar efter operationen (n=7) och för 16 S-analyser 3 och 7 dagar efter operationen (n=8) eller kl. slutet av 4-veckans träningsprotokoll (n=8) ​​eller vid motsvarande tidpunkt i de första 2 grupperna (n=16). Möss för vävnadsskörd var olika kohorter av möss som användes för inlärnings- och minnestester. I det andra experimentet tilldelades mössen slumpmässigt till (1) Transcontrol+Sur-gruppen och (2) Trans-exe+Sur-gruppen.

Möss i den första gruppen fick 500 ul fekal lösning från kontrollgruppen genom magsond och 600 ul genom lavemang en gång om dagen i 7 dagar i följd efter antibiotikabehandling för att eliminera den naturliga tarmmikrobiotan hos mottagarna. Möss i den andra gruppen fick 500 ul fekal lösning från träningsmöss genom magsond och 600 ul genom lavemang en gång om dagen i 7 dagar i följd efter antibiotikabehandlingen. Avföring från mottagarna skördades 14 dagar efter fekal transplantation för 16S-analys. Mössen utsattes sedan för operation.

Inlärning och minne utvärderades från 4 dagar efter operationen (n=15). Hjärnan skördades för biokemiska studier som i det första experimentet (n=10). I det tredje experimentet tilldelades mössen slumpmässigt till (1) Transcontrol-gruppen och (2) Trans-control+Sur-gruppen. Möss i båda grupperna fick transplantation av avföring från kontrollmöss. Den andra gruppen opererades 14 dagar efter fekal transplantation. Hippocampus skördades två dagar efter operationen för att mäta GDNF (n=10). I det fjärde experimentet tilldelades möss slumpmässigt till (1) kontrollgruppen (naiva möss som inte exponerades för några experimentella förhållanden som beskrivs i denna studie). (2) antibiotikagruppen som fick antibiotika i 7 dagar och (3) Trans-kontrollgruppen som fick transplantation av avföring från kontrollmöss.

Inlärning och minne utvärderades 19 dagar efter slutförandet av fekal transplantation (26 dagar efter avslutad antibiotikabehandling i antibiotikagruppen) (n=12). I det femte experimentet tilldelades mössen slumpmässigt till (1) kontrollgruppen, (2) Trans-kontrollgruppen som fick transplantation av avföring från kontrollmöss, och (3) Transkirurgigruppen som fick transplantation av avföring från operationsmöss. 

Fekal transplantation utfördes såsom beskrivits i det andra experimentet. Avföring från mottagarna skördades 14 dagar efter fekal transplantation för 16S-analys (n=10). Inlärning och minne utvärderades 4 dagar efter att det fekala provet skördades (n=17). I det sjätte experimentet tilldelades mössen slumpmässigt till (1) grupp med operation plus normal koksaltlösning som fick 200 µl normal saltlösning (NS) genom intraperitoneal injektion en gång en vecka i 4 veckor och sedan operation, (2) träning plus normal koksaltlösning plus operationsgrupp som fick 200 µl NSby intraperitoneal injektion en gång i veckan under 4-veckans träning med 35–40 % maximal kapacitet och sedan operation, (3 ) motion plus valeriansyra plus operationsgrupp som fick valeriansyra (200 mg/kg i 200 µl) genom intraperitoneal injektion en gång i veckan under 4-veckans träning med 35–40 % maximal kapacitet och sedan operation.

Injektionen gavs på morgonen den första träningsdagen i veckan. Ytterligare en injektion utfördes på operationsdagen. Beteendemässiga (n=13) och biokemiska (n=10) resultat utvärderades som i detta andra experiment. I det sjunde experimentet, 13-vecka gammal (väger 23–27 g) hane C57BL/ 6 J-möss tilldelades slumpmässigt till (1) kontrollgruppen, (2) NS-gruppen som fick 4 µl NS genom intracerebroventrikulära injektioner en gång dagligen under 4 dagar i följd, och (3) valerianasyragruppen som fick 4 mg/kg i 4 µl per intracerebroventrikulär injektion en gång dagligen under 4 dagar i följd. Vänster och höger cerebroventrikel injicerades enligt ett alternerande schema. Inlärning och minne utvärderades 4 dagar efter injektionen (n=15).

I det åttonde experimentet tilldelades möss slumpmässigt till (1) kirurgi plus dimetylsulfoxid (DMSO) grupp som fick DMSO genom intracerebroventrikulär injektion en gång dagligen under 4 dagar i följd med början på operationsdagen, (2) operation plus C3ar-antagonistgrupp som fick C3ar-antagonist (SB29) ) genom intracerebroventrikulär injektion en gång dagligen i 4 dagar med början på operationsdagen, (3) träning plus DMSO plus operationsgrupp som fick DMSO genom intracerebroventrikulär injektion en gång dagligen i 4 dagar i följd med början på operationsdagen efter 4-veckans träning vid 35 –40 % maximal kapacitet och(4) träning plus C3ar-agonist plus operationsgrupp som fick en C3aragonist genom intracerebroventrikulär injektion en gång dagligen under 4 dagar i följd med start på operationsdagen efter 4-veckans träning vid 35–40 % maximal kapacitet . Beteendetester påbörjades från 4 dagar efter operationen enligt ovan (n=15).

I det nionde experimentet tilldelades mössen slumpmässigt till (1) kontrollgruppen, (2) operationsgruppen, (3) operationen plus GDNF-gruppen som fick GDNF genom intracerebroventrikulär injektion när de opererades och (4) operation plus värmeinaktiverad GDNF grupp som fick värmeinaktiverad GDNF genom intracerebroventrikulär injektion när de opererades. Hippocampi skördades 48 timmar efter operationen för ELISA-studie (n=12). Efter en veckas acklimatisering användes gamla möss (18-månadsgamla C57BL/6 Jmöss av hankön) som vägde 30–36 g i tre studier. I det första experimentet tilldelades gamla möss slumpmässigt till (1) kontrollgruppen, (2) träningsgruppen där mössen hade en 4-veckors träning med 35–40 % maximal kapacitet, (3) operationsgruppen och (4) Exe+Sur-gruppen där mössen hade en 4-veckors träning med 35–40 % maximal kapacitet före operationen. Djuren användes för inlärnings- och minnestester med start 4 dagar efter operationen (n=12) eller deras hjärnor skördades för biokemiska analyser 48 timmar efter operationen (n=10 eller 12), för immunfluorescerande färgning vid 48 timmar och 19 dagar efter operationen (n=6), och för Golgistaining 19 dagar efter operationen (n=8).

Blod och avföring från möss i de fyra grupperna skördades för SCFA-mätning 7 dagar efter operationen (n=7) och för 16 S-analyser 3 och 7 dagar efter operationen (n=8) eller i slutet av 4-veckors träningsprotokoll eller vid motsvarande tidpunkt i de två första grupperna (n=16). Möss för vävnadsskörd var olika kohorter som användes för inlärnings- och minnestester. I det andra experimentet tilldelades gamla möss slumpmässigt till (1) Trans-Old Control+Sur-gruppen och (2) Trans-Old Exe+Sur-gruppen. Dessa möss utsattes för operation 14 dagar efter fekal transplantation enligt beskrivningen i andra experimentet med unga vuxna möss. Inlärning och minne utvärderades från 4 dagar efter operationen (n =10).

I det tredje experimentet tilldelades gamla möss slumpmässigt till (1) kirurgi plus NS-gruppen; (2) träning plus NS plus operationsgrupp; och (3) träning plus valeriansyra plus operationsgrupp. Dessa möss fick träningskonditionering och valeriansyra som beskrivs i det sjätte experimentet med unga vuxna möss. Beteenderesultat testades med början 4 dagar efter operationen (n=11). Provstorlekarna (n) som beskrivs ovan representerade antalet djur som randomiserades till varje grupp/tillstånd. Dessa antal djur var summan av minst 3 replikat av varje experiment. Djuren fördelades slumpmässigt i grupper baserade på datorgenererade randomiseringstabeller i varje experiment.

Maximal träningskapacitet bestämning och träningsträning

Före operationen exponerades {{0}}vecka- och 18-månadsgamla möss för en 4-veckoträningsövning efter en bestämning av den maximala träningskapaciteten för enskilda möss. Denna bestämning utfördes på ett sätt som liknar de som beskrivits tidigare [47, 48]. Kortfattat acklimatiserades mössen till löpbandet den första dagen med initiala inställningar av stötnät vid 25 V, 0,3 mA och 2 Hz och hastigheten och lutningen vid noll i 10 minuter. Löpbandets hastighet ökades sedan till 10 cm/s med lutningen inställd på 50 under 10 min. Därefter ökades löpbandets hastighet och lutning till 15 cm/sand 100 under 5 min.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50 % av tiden på nätet; och/eller (3) avsaknad av motivation till manuell propping. Musen togs bort omedelbart från respektive körfält när ett eller flera av dessa kriterier uppfylldes. Nästa dag sprang möss på samma löpband med hälften av den genomsnittliga maximala hastigheten (35 cm/s hos unga möss eller 30 cm/s hos gamla möss) och 100 i lutning tills de nådde ett av utmattningskriterierna igen, och varaktigheten av kontinuerlig träning registrerades som den maximala träningskapaciteten för varje mus. Efter dessa två protokoll hölls möss separat i 30 minuter för att undvika märkbart aggressivt beteende efter träning.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >3 % av den totala tiden under 3 dagar i följd skulle exkluderas.

Icke-träningsgrupperna i samma uppsättning experiment som träningsgrupperna placerades på ett icke-rörligt löpband dagligen i cirka 30–40 minuter. De fick 10 stötar under totalt 5 s, det genomsnittliga antalet stötar som möss i en träningsgrupp fick varje dag, under sin vistelse på ett löpband som inte rör sig. Om en uppsättning experiment inte hade en träningsgrupp fick inga möss i uppsättningen av experiment stötar.

Antibiotisk behandling

För att underlätta koloniseringen av den transplanterade mikrobiotan, fick mottagarmöss en antibiotikabehandling en gång dagligen i 7 dagar i följd för att eliminera deras ursprungliga tarmmikrobiota som beskrivits av oss och andra [11, 36]. Kort sagt, efter rening med 10 % magnesiumsulfat (200 ul/10 g, två gånger med 3 timmars intervall) genom magsond den första dagen, fick C57BL/6 J-möss amoxicillin/klavulansyra (200 mg/kg), metronidazol ( 200 mg/kg) och cefazolin (2 g/kg) genom magsond och ema (i 300 ul för magsond och 400 ul NS för lavemang) på morgonen en gång om dagen i 7 dagar i följd, och amoxicillin/klavulansyra (20 mg/kg) ), metronidazol (20 mg/kg) och cefazolin (300 mg/kg) i 200 ul NS dagligen genom intraperitoneal injektion under samma 7 dagar (kl. 16.00 till 17.00). För att förhindra bakteriell korskontaminering utfördes mushantering och dagliga bur- och vattenflaskorbyten av tekniker som bar en ren klänning och handskar i en ventilerad huva. Avföring från dessa möss skördades 24 timmar efter den sista behandlingen för 16 S analyser för att bestämma effekten.

Fekal transplantation

Färska fekala pellets uppsamlade inom 30 minuter efter avföring från kontrollmöss, möss omedelbart efter avslutad 4-veckors träning, ormöss 2 till 8 dagar efter operationen späddes med 100 mg/ml steril koksaltlösning. Alla fekala pellets om 7 –10 donatorer med varje experimentellt tillstånd blandades och återsuspenderades tillsammans i saltlösning. Kortfattat, det fekala ämnet vortexblandades i 5 minuter och passerade sedan genom en 70 μm nyloncellsil för att avlägsna osmält mat och partikelmaterial. Mottagaren fick 500 ul motsvarande fekal lösning genom magsonden på morgonen och 600 ul genom lavemang på eftermiddagen från 24 timmar efter den sista dosen av antibiotika under 7 dagar i följd. Transplanterade möss hölls i 2 veckor efter fekal transplantation innan de utsattes för fekal insamling för 16 S analyser och kirurgi.

Anestesi och operation

Operationen var exponering för halspulsådern som vi beskrev tidigare [6]. Kortfattat bedövades möss med 2 % isofluran och höll spontanandning med en ansiktsmask försedd med 100 % syre under proceduren. Rektal temperatur övervakades och hölls vid 37 grader med hjälp av en värmefilt. Ett halssnitt på 2- cm i mitten av halsen och dissektion av mjukvävnad med 1- cm lång exponering för vanlig artär utfördes utan någon skada på vagusnerven efter att musen bedövats med isofluran i minst 20 minuter. Såret sköljdes sedan och stängdes med en 4–0 kirurgisk sutur. Det kirurgiska ingreppet utfördes understerila förhållanden och varade cirka 15 minuter i unga möss och 12 minuter i gamla möss. Den totala varaktigheten av allmän anestesi var 2 timmar. Efter operationen fick alla djur en subkutan injektion av 3 mg/kg bupivakain. Inget svar på tåklämning observerades under anestesin.

Intracerebroventrikulära injektioner

Som beskrivits ovan fick vissa grupper av möss intracerebroventrikulär injektion. Kortfattat placerades dessa möss i en stereotaktisk huvudram i bukläge. Injektionsstället var lokaliserat som: 1,00 mm mediolateralt,-0,3 mm anteroposterior från Bregma och -2,5 mm dorsoventralt djup. Möss i operation plus GDNF-gruppen fick en intracerebroventrikulär injektion av 1{{ 20}} ug/kg rekombinant mus-GDNF i 3 ul fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som beskrivits i tidigare studier [6, 26], och möss i kirurgi plus värmeinaktiverad GDNF-grupp fick en injektion av värmedenaturerad (5 minat 1000C) ) GDNF-lösning. Möss i operation plus C3ar-antagonistgruppen fick 10 ug/kg SB290157 i 3 ul PBS innehållande 5% DMSO vid 0 timmar, 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar efter operationen. Möss i träningen plus C3ar-agonist och operationsgrupp fick 1 ug/kg C3ar-agonist i 3 ul PBS innehållande 5 % DMSO samtidigt som för SB290157. Möss i en valeriansyragrupp av sexthexperimentet fick 4 mg/kg valeriansyra i 4 ul under 4 på varandra följande dagar.

Beteendetestning

Inlärning och minne utvärderades genom ny objektigenkänning och Barnes labyrinttest. Alla beteendetester utfördes klockan 10:00 am−5:00pm i ett ljudisolerat rum. Möss som användes i inlärnings- och minnestester användes inte för några biokemistudier för att undvika effekterna av dessa tester.

Nytt objektigenkänningstest

Som vi och andra beskrivit tidigare [20, 49, 50], sattes möss i en öppen fältkammare i 5 minuter för tillvänjning 4 dagar efter operationen. Testet utfördes på följande sätt. Två av samma föremål placerades i angränsande vinklar av kammaren på inlärningsdagen. Möss sattes in i kammaren med ryggen vänd mot föremålen och fick utforska kammaren fritt i 5 minuter. Djuret eliminerades om den totala utforskningstiden på två objekt var<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Barnes labyrint

Sju dagar efter operationen utsattes djuren för Barnes labyrint för att testa deras rumsliga inlärning och minne som vi tidigare beskrivit [6, 49]. Barnes labyrint är en cirkulär plattform med 20 lika fördelade hål (SDInstruments, San Diego, CA). Ett av hålen var kopplat till en mörkkammare som kallades mållåda. Testet började med att placera djur mitt i Barnes labyrint. Aversivt brus (85 dB) och starkt ljus (200W) som spreds på plattformen användes för att uppmuntra möss att hitta denna box. Efter träning i 4 dagar testades deras referensminne dag 5 och dag 12. Inget test utfördes under perioden. från dag 5 till dag 12. Latensen för att komma in i målrutan under varje försök registrerades av ett ANYMaze videospårningssystem (SD Instruments).

For more information:1950477648nn@gmail.com