ASK1-hämmare NQDI-1 minskar oxidativ stress och neuroapoptos via ASK1/p38- och JNK-signalvägen vid tidig hjärnskada efter subaraknoidalblödning hos råttor Del 1

Abstrakt. Oxidativ stress och neuroapoptos är nyckelpatologiska processer efter subaraknoidal blödning (SAH). Den föreliggande studien utvärderade de antioxiderande och anti-apoptotiska neuroprotektiva effekterna av den apoptos signalreglerande kinas 1 (ASK1) hämmaren etyl-2,7-dioxo-2,7-dihydro-3H-nafto(1,2,(1) 3-de) kinolin1-karboxylat (NQDI-1) vid tidig hjärnskada (EBI) efter SAH i en råttmodell. Totalt 191 råttor användes och SAH-modellen inducerades med användning av monofilamentperforering. Western blotting användes därefter för att detektera de endogena expressionsnivåerna av proteiner. Immunfluorescens användes sedan för att bekräfta den nervcellulära lokaliseringen av ASK1. Kortsiktig neurologisk funktion utvärderades med de modifierade Garcia-poängen och strålbalanstestet 24 timmar efter SAH, medan den neurologiska funktionen på lång sikt utvärderades med hjälp av rotarod-testet och Morris vattenlabyrinttest. Apoptos av neuroner bedömdes med TUNEL-färgning och oxidativ stress bedömdes genom dihydroetidiumfärgning 24 timmar efter SAH. Proteinuttrycksnivåerna för fosforylerad (p‑)ASK1 och ASK1 steg efter SAH. NQDI-1 injicerades intracerebroventrikulärt 1 timme efter SAH och visade signifikanta förbättringar i både kort- och långsiktig neurologisk funktion och signifikant reducerad oxidativ stress och neuronal apoptos. Injektion av NQDI-1 orsakade en signifikant minskning av proteinuttrycksnivåerna för p-ASK1, p-p38, p-JNK, 4 hydroxynonenal och Bax och ökade signifikant proteinuttrycksnivåerna för hemoxygenas 1 och Bcl-2. Användningen av p38-hämmaren BMS-582949 eller JNK-hämmaren SP600125 ledde till signifikanta minskningar av proteinuttrycksnivåerna för p-p38 respektive p-JNK, och en signifikant minskning av oxidativ stress och neuronal apoptos; dessa hämmare visade dock ingen effekt på p-ASK1- eller ASK1-proteinexpressionsnivåer. Sammanfattningsvis förbättrade behandling med NQDI-1 neurologisk funktion och minskade oxidativ stress och neuronal apoptos i EBI efter SAH hos råttor, möjligen via hämning av ASK1-fosforylering och ASK1/p38 och JNK-signalvägen. NQDI-1 kan anses vara ett potentiellt medel för behandling av patienter med SAH.

Glykosid av cistanche kan också öka aktiviteten av SOD i hjärt- och levervävnader och avsevärt minska innehållet av lipofuscin och MDA i varje vävnad, effektivt rensa upp olika reaktiva syreradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) och skydda mot DNA-skador orsakade av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en stark rensande förmåga av fria radikaler, en högre reducerande förmåga än vitamin C, förbättrar aktiviteten av SOD i spermiesuspension, minskar innehållet av MDA och har en viss skyddande effekt på spermiemembranfunktionen. Cistanche-polysackarider kan öka aktiviteten av SOD och GSH-Px i erytrocyter och lungvävnader hos experimentellt åldrande möss orsakade av D-galaktos, samt minska innehållet av MDA och kollagen i lungor och plasma, och öka innehållet av elastin, har en bra rensande effekt på DPPH, förlänger hypoxitiden hos åldrande möss, förbättrar aktiviteten av SOD i serum och fördröjer den fysiologiska degenereringen av lungor hos experimentellt åldrande möss. Med cellulär morfologisk degeneration har experiment visat att Cistanche har den goda antioxidantförmågan och har potential att vara ett läkemedel för att förebygga och behandla åldrande hudsjukdomar. Samtidigt har echinakosid i Cistanche en betydande förmåga att ta bort DPPH-fria radikaler och kan avlägsna reaktiva syrearter, förhindra friradikal-inducerad kollagennedbrytning och har även en god reparationseffekt på anjonskada av tyminfria radikaler.

Klicka på Anti-aging Cistanche Para Que Serve

【För mer information: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Nyckelord: subaraknoidal blödning, NQDI-1, apoptos signalreglerande kinas 1, oxidativ stress, apoptos, tidig hjärnskada

Introduktion

Subaraknoidal blödning (SAH) är en allvarlig akut cerebrovaskulär sjukdom som orsakas av blodflödet in i hjärnans subaraknoidala utrymme (1). Men för närvarande finns det inga effektiva läkemedel tillgängliga för att förbättra hjärnvävnadsskada efter SAH efter förebyggande av återblödning (2). Därför krävs det akuta studier av mekanismerna för hjärnskada efter SAH och utforskning av lämpliga behandlingsalternativ för att förbättra prognosen för SAH.

Tidig hjärnskada (EBI) avser sekundär hjärnvävnadsskada orsakad av flera fysiologiska störningar och en rad patologiska förändringar som inträffar inom 72 timmar efter början av SAH (3). I den akuta responsfasen efter SAH börjar skadan med att stora mängder blod tränger in i subaraknoidalrummet och detta följs av en serie patologiska skador (4). Eftersom mitokondrier är särskilt mottagliga för hypoxi och ischemisk skada, är mitokondriell dysfunktion en av de primära patologiska skadorna som drabbas efter SAH (5). Ett stort antal reaktiva syrearter (ROS) frigörs, vilket leder till förstärkning av oxidativ stress och aktivering av den mitokondriella apoptotiska vägen, vilket orsakar mitokondriell skada och dysfunktion (6). Därför är terapeutiska metoder som minskar oxidativ stress och apoptos nyckeln för att förbättra prognosen för SAH.

Apoptos signalreglerande kinas 1 (ASK1), en medlem av familjen mitogenaktiverat protein 3 kinas (MAP3K), aktiveras av många olika typer av cellulär stress och har en viktig roll vid oxidativ stress och apoptos (7). I primära kulturer av mushippocampusneuroner, reverserar Rho-kinashämmaren fasudil -amyloid-inducerad förhöjning av fosforylerad (p-)ASK1, vilket minskar neuronal apoptos vid Alzheimers sjukdom (8). Så vitt vi vet har dock inte terapeutiska alternativ inriktade på ASK1 efter SAH utvärderats.

Etyl-2,7-dioxo-2,7-dihydro-3H-nafto(1,2,3-de)kinolin1-karboxylat (NQDI-1) har rapporterats vara en specifik hämmare av ASK1 och har validerats med in vitro kinasanalyser (9,10). Tidigare studier har rapporterat att NQDI-1 kan vara effektiv vid behandling av många sjukdomar genom hämning av ASK1-aktivitet (11,12). NQDI-1 lindrar mikrocystin-LR-inducerad mitokondriell skada och apoptos i ovariegranulosaceller via hämning av aktiveringen av ASK1 (13). Vidare kan indometacin inducera apoptotiska kaskadsvar i gliaceller via ASK1-aktivering av endoplasmatisk retikulumstress (14). Därför kan den ASK1-specifika hämmaren NQDI-1 utöva neuroprotektiva effekter efter SAH genom hämning av ASK1-aktivitet. p38 och JNK anses bilda nedströmssignaleringsvägarna för ASK1; aktiverat p38 och JNK kan ytterligare aktivera en mängd olika substrat, inklusive nukleära transkriptionsfaktorer såväl som proteinkinaser och andra funktionella proteiner, vilket leder till uppkomsten av oxidativ stress och apoptos (15).

Det antogs att ASK1-hämmare NQDI-1 utövar neuroprotektiva effekter och minskar oxidativ stress och neuroapoptos via ASK1/p38- och JNK-signalvägen i EBI efter SAH hos råttor.

Material och metoder

Försöksdjur.Djurförsöken godkändes av Etikkommittén för försöksdjur vid Central South University (godkännande nr 2019sydw0104). Totalt 191 Sprague-Dawley (SD) hanråttor som vägde 280-320 g hölls i en miljö med konstant temperatur (21-23˚C) och luftfuktighet (45-50 procent) med en 12/12-h ljus/mörker-cykel och hade fri tillgång till vatten och mat. Alla djurförsök utfördes enligt Animal Research: Reporting In Vivo Experiments riktlinjer (16) och utfördes av National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Animals riktlinjer (17). När råttor nådde den angivna förinställda tidpunkten för experimentet eller uppfyllde vissa kriterier för dödshjälp [fullständig aptitlöshet under 24 timmar eller dålig aptit (50 procent under det normala) i 3 dagar, oförmåga att äta eller dricka, eller så bedömdes de vara nära döden (självskadebeteende, onormal hållning, andningsbesvär, etc.)] placerades råttorna i en koldioxidavlivningsanordning med koldioxidvolymförskjutningshastighet inställd på 30 procent/min (18). Döden bekräftades genom upphörande av andningen och hjärtslag och pupillvidgning. Kadaverna av alla råttor förpackades och frystes för miljövänligt bortskaffande.

SAH modell. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >8 genom bedömning av SAH-betyget ansågs uppfylla de experimentella kraven och vara en framgångsrik modell. Proceduren för skengruppen liknade den för SAH-gruppen, med undantaget att 4-0 prolintråden inte genomborrade artärväggen. Andningen, hjärtfrekvensen, hudfärgen och pedalreflexen övervakades var 5:e minut under hela det kirurgiska och anestetiska återhämtningsstadiet. Av dessa dog 23 råttor och 8 råttor exkluderades, och dessa dödsfall och uteslutningar kompletterades med nya SAH-modellerade råttor.

Svårighetsgraden av SAH.Svårighetsgraden av SAH bedömdes med SAH-graderingspoäng 24 timmar efter SAH (20). Den ventrala sidan av hjärnvävnaden var uppdelad i 6 regioner, var och en klassad som 0-3 beroende på mängden blodpropp och hur väl blodkärlen var skymd: En poäng på 0 indikerar ingen propp, 1 indikerar en liten mängd koagel, 2 indikerar en måttlig mängd koagel men stora kärl vid skallbasen är fortfarande identifierbara, och 3 indikerar en stor mängd koagel och oidentifierbara kärl vid skallbasen. De sex regionala poängen summerades för att beräkna en total poäng (0-18), där högre poäng tydde på allvarligare blödning. Råttor med en total SAH-poäng på mindre än eller lika med 8 ansågs ha mild SAH, uteslutna från efterföljande experiment och ersatta med nymodellerade råttor.

Drogadministration.För att möjliggöra att läkemedelskoncentrationerna i hjärnvävnaden kan regleras mer exakt oberoende av levern och andra faktorer, administrerades siRNA och NQDI-1 genom intracerebroventrikulär injektion (21). Efter bedövning (induktion, 3 procent isofluran; underhåll, 2 procent isofluran), fixerades råttorna på en stereotaxisk hjärnapparat. Mikroinjektorn fixerades till bregma vid 1,0 posterior, 1,5 höger och 3,3 mm djup. ASK1 siRNA (kat. nr. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) eller Scr siRNA-kontroll (kat. nr. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) löstes i 5 µl nukleasfritt sterilt avjoniserat vatten i en koncentration av 500 pmol och administreras 48 timmar före SAH. Sekvenserna för ASK1 siRNA var följande: Sense 5'-CGG CAGACAUUGUUAUCAtt-3' och antisense 5'-UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc-3'. Läkemedelskoncentrationer och doser rapporterade i en liknande studie (22) och lösligheten av NQDI-1 användes för att bestämma de koncentrationer som används i denna studie. Tre doser av NQDI-1 (1, 3 och 10 µg/kg; Selleck Chemicals) eller vehikellösning i en total volym av 5 µl/råtta injicerades 1 timme efter SAH. BMS-582949 (100 mg/kg; Selleck Chemicals), SP600125 (30 mg/kg; Selleck Chemicals) och vehikellösningar kunde passera blod-hjärnbarriären och administrerades intraperitonealt 1 timme efter SAH (23,24).

Kortvarig neurologisk funktion.Modifierad Garcia-poäng och strålbalanspoäng användes för att bedöma den kortsiktiga neurologiska funktionen 24 timmar efter SAH. Den modifierade Garcia-poängen delades in i sex kategorier enligt följande: Frivillig rörelse, frivillig lemrörelse, framtassförlängning, klättringsförmåga, somatosensoriska svar och tentakelrespons, som var och en poängsattes individuellt och summerades för att ge ett totalpoäng från 3–18 (25). Högre poäng ansågs indikera bättre neurologisk funktion. För strålbalanspoängen placerades råttorna på en stråle i 1 min och en poäng som sträckte sig från 0-4 bedömdes baserat på avståndet som gick (26). Högre poäng ansågs indikera bättre neurologisk funktion.

Långsiktig neurologisk funktion.Rotarod föranpassningsexperiment utfördes på råttor med samma initiala hastighet och acceleration före SAH-modellering. Råttorna placerades på en Rotamex roterande stångtestare (Columbus Instruments) för Rotarod-testet dag 7, 14 och 21 efter SAH (27). Först sattes den initiala Rotarod-hastigheten till 5 varv per minut och accelerationen till 2 varv per 5 sek. Efter att ha satt på råttorna registrerades falllatensen hos råttorna. Råttorna fick sedan vila i 1 timme. Slutligen testades råttornas falllatens igen vid den initiala hastigheten på 5 varv per minut och en acceleration på 2 varv per 5 sekunder. Längre falllatens ansågs indikera bättre motorisk koordination hos råttan. Vid vecka 4 efter SAH-modellering användes Morris vattenlabyrinttest för att bedöma råttornas inlärningsminne och rumsliga orientering (27). Inlärningsövningen att simma och hitta en plattform som ligger under vattenytan utfördes från dag 1 till dag 5 vecka 4 (dagarna 28-33 efter SAH) och simbanan, flyktlatensen och simdistansen registrerades. Den sista dagen togs plattformen bort för testning, och simbanan, simdistansen och sondkvadrantens varaktighet registrerades under 60 sekunder.

OM färgning.Efter sekventiell perfusion av 4˚C saltlösning och 4˚C, 4 procent paraformaldehyd från hjärtat för att avlägsna blod från hjärnvävnaden, erhölls intakt hjärnvävnad. Efter uttorkning av sackarosgradienten skars hjärnvävnaden i 10 µm sektioner i en koronal position och lagrades vid -20 ˚C. IF-färgning användes för att bedöma samlokaliseringen av ASK1 med nervceller. Frysta vävnadssnitt blockerades med 5 procent åsneserum (kat. nr. G1217-5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) i 2 timmar vid rumstemperatur och inkuberades över natten vid 4˚C med primära antikroppar enligt följande: Anti-ASK1 (mus; 1:200; kat. nr. 67072-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.), anti-NeuN (kanin; 1:200; kat. nr. 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) , antijoniserad kalciumbindande adaptermolekyl-1 (Iba-1; kanin; 1:200; kat.nr. 10904-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) och antiglialt fibrillärt surt protein (GFAP; kyckling) ; 1:200; kat.nr ab4674; Abcam). Vävnadssnitten inkuberades sedan i 2 timmar vid rumstemperatur med motsvarande fluorescerande sekundära antikroppar enligt följande: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H plus L) (kat. nr. 715-585-150; 1:500 ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plus L) (kat. nr. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) och Alexa Fluor 48 AffiniPure Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H plus L) (kat. nr. 703-545-155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Därefter färgades de för cellkärnor med användning av 2 µg/ml DAPI (kat. nr. G1012-100ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) under 10 minuter vid rumstemperatur. Sektionerna bedömdes med ett Olympus BX53 fluorescensmikroskop (Olympus Corporation) och bilder togs.

Dihydroetidium (DHE) färgning.DHE-färgning utfördes för att bedöma hjärnans oxidativa stress (28). Frysta hjärnvävnadssnitt inkuberades med 2 µmol/l DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) vid 37˚C i 30 minuter i mörker. Efter färgning för cellkärnor med användning av 2 µg/ml DAPI under 10 minuter vid rumstemperatur, bedömdes sektionerna med användning av ett Olympus BX53 fluorescensmikroskop. Totalt sex sektioner från varje hjärnvävnad valdes slumpmässigt ut och sex områden i varje sektion valdes slumpmässigt ut för avbildning. Antalet DHE-positiva celler räknades med hjälp av programvaran ImageJ 1.4 (National Institutes of Health) och medelvärdet beräknades och togs som de slutliga procentsatserna för varje hjärnvävnadssektion.

TUNEL-färgning.TUNEL-färgning användes för att utvärdera andelen apoptotiska neuroner (29). Frysta vävnadssnitt blockerades med användning av 5 procent åsneserum i 2 timmar vid rumstemperatur och inkuberades över natten vid 4˚C med primär antikropp anti-NeuN (kanin; 1:200; kat.nr 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc. .). Vävnadssnitten inkuberades sedan med den fluorescerande sekundära antikroppen Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plus L) (kat. nr. 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) i 2 timmar vid rumstemperatur. TUNEL-färgning utfördes med användning av One Step TUNEL Apoptosis Assay-kit (kat.nr C1090; Beyotime Institute of Biotechnology) enligt tillverkarens protokoll. Slutligen färgades vävnadssektionerna för cellkärnor med användning av 2 µg/ml DAPI under 10 minuter vid rumstemperatur. Slumpmässigt urval av TUNEL-räkningsplatser och beräkning av TUNEL-positiva neuroner för varje sektion utfördes med den tidigare nämnda metoden för DHE-räkning.

Western blotting (WB).WB användes för att semi-kvantifiera proteinuttrycksnivåer. Efter perfusion av 4˚C saltlösning från hjärtat för att avlägsna blod från hjärnvävnaden erhölls intakt hjärnvävnad. Tidigare studier har rapporterat att SAH-modellen, inducerad via vänstersidig endovaskulär punktering, resulterar i en viss bias mot blödningshändelser och kan vara relativt allvarlig när det gäller skador på vänstersidig hjärnvävnad (30). Därför användes den vänstra hjärnvävnaden för att bedöma den patologiska skadan efter SAH-modellering. Hjärnvävnadsproteiner extraherades med användning av RIPA-lyslösning (kat.nr P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) enligt tillverkarens protokoll. Proteinkoncentrationen i proverna bestämdes med BCA-analysen (kat.nr P0012; Beyotime Institute of Biotechnology) och justerades därefter till 5 µg/µl genom att tillsätta olika mängder dubbeldestillerat vatten. 5 µl av 5 µg/µl proteinprover sattes till varje bana och dessa proteinprover separerades på 10 procents geler genom SDS-PAGE-elektrofores och överfördes till PVDF-membran. Membranen blockerades i 2 timmar vid rumstemperatur med användning av 5 procent fettfri mjölkpulver (kat. nr. P0216-300g; Beyotime Institute of Biotechnology). Membranen inkuberades över natten vid 4˚C med primära antikroppar enligt följande: Anti‑p‑ASK1 (Ser‑83; 1:1,000; kat.nr MA5‑28020; Thermo Fisher Scientific, Inc. .), anti-ASK1 (1:1,000; kat.nr 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1) ,000; kat.nr. 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), anti‑p38 MAPK (1:1,000; kat.nr. 8690; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-fosfo-stress-aktiverat proteinkinas/Jun-amino-terminal kinas (phospho-SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,000; kat.nr 9255; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-SAPK/JNK (JNK; 1:1,000; kat.nr. 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-4 hydroxynonenal (4-HNE; 1:1 ,000; kat.nr ab46545; Abcam), anti-hem oxygenase 1 (HO-1; 1:1,000; kat.nr 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-Bcl-2 (1:1,000; kat.nr. 26593-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), anti-Bax (1,1000; kat.nr. 60267‑1‑Ig; ProteinTech Group, Inc.) och anti-aktin (1:2,000; kat.nr. 4970; Cell Signaling Technology, Inc.). Detta följdes av inkubation med lämpliga pepparrotsperoxidaskonjugerade sekundära antikroppar i 2 timmar vid rumstemperatur: Get-anti-mus IgG-HRP (kat.nr sc-2005; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology , Inc.) eller get-anti-kanin IgG-HRP (kat.nr sc-2004; 1:5 000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), och de specifika banden visualiserades med hjälp av ett ECL-kit (kat.nr P0018AS; Beyotime Institute of Biotechnology) och avbildad med ett UVP Che Studio PLUS-system (Analytik Jena GmbH). Relativ densitometrisk analys av WB-band utfördes med ImageJ 1.4-programvara (NIH) och proteinuttrycksnivåerna normaliserades mot -aktin.

Experimentell design

Uttrycksförändringar och cellulär lokalisering av ASK1 efter SAH. Totalt 36 råttor tilldelades slumpmässigt till sex grupper (n=6/grupp) enligt följande: i) Sham-opererade (sham), ii) 3 timmar efter SAH, iii) 6 timmar efter SAH, iv ) 12 timmar efter SAH, v) 24 timmar efter SAH och vi) 72 timmar efter SAH. WB användes för att bedöma förändringar i proteinuttrycksnivåerna för endogen ASK1 och p-ASK1. Totalt 4 ytterligare råttor delades in i sken- (n=2) och SAH 24 h (n=2)-grupper och IF-färgning användes för att utvärdera samlokaliseringen av ASK1.

Terapeutiska effekter av ASK1-hämmare NQDI-1 på kort- och långtids neurologisk funktion efter SAH. Totalt 30 råttor delades in i 5 grupper (n=6/grupp) enligt följande: i) Bly, ii) SAH plus vehikel, iii) SAH plus 1.0 µg /kg NQDI‑1, iv) SAH plus 3.0 µg/kg NQDI-1 och v) SAH plus 10,0 µg/kg NQDI-1. De modifierade Garcia- och strålbalanspoängen användes för att bedöma kortvarig neurologisk funktion 24 timmar efter SAH. Baserat på omfattningen av den kortsiktiga neurologiska förbättringen, bedömdes 3,0 µg/kg NQDI-1 vara den mest lämpliga dosgruppen och denna dos av NQDI-1 användes i efterföljande experiment. Totalt 30 råttor delades in i 3 grupper (n=10) enligt följande: i) Sham, ii) SAH plus vehikel och iii) SAH plus NQDI-1. Ett rotarod-experiment användes för att bedöma den neurologiska funktionen på lång sikt dag 7, 14 och 21 efter SAH, och Morris-vattenlabyrinttestet utfördes vecka 4 efter SAH för att bedöma neurologisk funktion på lång sikt.

Terapeutiska effekter av ASK1-hämmare NQDI-1 på oxidativ stress och apoptos. Totalt 12 råttor delades in i 3 grupper (n=4/grupp) enligt följande: i) Sham, ii) SAH plus vehikel och iii) SAH plus NQDI-1. (THE)-färgning utfördes för att bedöma oxidativ stress och TUNEL-färgning användes för att bedöma neuronal apoptos 24 timmar efter SAH.

Roll av ASK1/p38 och JNK signalväg i de terapeutiska effekterna av NQDI-1. Totalt 48 råttor delades in i 8 grupper (n=6/grupp) enligt följande: i) Sham, ii) SAH, iii) SAH plus vehikel, iv) SAH plus NQDI‑1, v) SAH plus scrambled (Scr) kort interfererande (si)RNA, vi) SAH plus ASK1 siRNA, vii) SAH plus BMS-582949 och viii) SAH plus SP600125 grupper. ASK1 siRNA, p38-hämmaren BMS-582949 och JNK-hämmaren SP600125 injicerades för att bedöma om ASK1, p38 och JNK var involverade i de neuroprotektiva effekterna av NQDI-1.

Statistisk analys. Data presenterades som medel ± standardavvikelse och experimentella data för WB erhölls i 6 oberoende replikat, medan DHE-färgning och TUNEL-färgning utfördes som 4 oberoende replikat. Data analyserades med SPSS version 17 (SPSS, Inc.). Data från Morris water labyrint-testet utvärderades med hjälp av en blandad ANOVA/två-vägs upprepade mätningar ANOVA, följt av LSD post hoc-testet. Data från de återstående experimenten testades för normalfördelning med Shapiro-Wilks normalfördelningstest följt av envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc multipla jämförelsetest. Grafer plottades med användning av GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.). P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Resultat

Dödlighet och SAH svårighetsgrad. Totalt 191 SD-råttor användes i den föreliggande studien, varav 8 råttor exkluderades på grund av endast mild SAH (SAH-graderingspoäng Mindre än eller lika med 8). Av SD-råttorna som användes i experimenten var 34 råttor i skengruppen och 149 råttor genomgick SAH-modellering. Inga råttor i skengruppen dog; dock dog 23 råttor efter SAH-modellering (dödlighet 15,4 procent) (tabell SI-V). Jämfört med skengruppen var blodproppar i subaraknoidalrummet primärt belägna nära Willis-ringen och på båda sidor om basilarartären efter SAH-modellering (Fig. 1A). SAH-graderingspoängen 24 timmar efter SAH-modellering visade ingen signifikant skillnad i svårighetsgraden av blödningar mellan alla icke-blödningsgrupper och en signifikant skillnad mellan sken- och alla icke-blödningsgrupper (Fig. 1B).

Proteinuttrycksförändringar och cellulär lokalisering av ASK1 efter SAH. Proteinuttrycksnivåerna för ASK1 ökade och nådde en topp vid 24 timmar i hjärnan efter SAH (Fig. 1C och D). Men förhållandet mellan proteinuttrycket av p-ASK1/ASK1 visade ingen signifikant skillnad (Fig. 1C och E). Cellulär lokalisering av ASK1 med NeuN-positiva neuroner, Iba-1-positiva mikroglia och GFAP-positiva astrocyter visades i både sken- och SAH 24-timmarsgruppen (Fig. 1F-H).

ASK1-hämmare NQDI-1 förbättrar kortsiktiga neurologiska funktioner 24 timmar efter SAH. NQDI-1 (1, 3 och 10 µg/kg) injicerades intracerebroventrikulärt 1 timme efter SAH. Råttor som genomgick SAH-modellering hade signifikant lägre modifierade Garcia- och strålbalanspoäng 24 timmar efter SAH-modellering; alla tre doserna av NQDI-1 ledde dock till en signifikant partiell förbättring av kortsiktig neurologisk funktion (Fig. 2A och B). De modifierade Garcia-poängen var signifikant högre i gruppen SAH plus NQDI‑1 (3.0 µg/kg) jämfört med gruppen SAH plus NQDI‑1 (1.0 µg/kg); inga statistiskt signifikanta skillnader visades dock jämfört med SAH plus NQDI-1 (10,0 µg/kg)-gruppen (fig. 2A och B), vilket antydde att ytterligare ökning av koncentrationen av NQDI-1 gjorde det. inte framkalla ytterligare förbättring av kortsiktig neurologisk funktion efter SAH. Därför ansågs NQDI-1 (3,0 µg/kg) vara den effektiva optimala koncentrationen och användes i efterföljande experiment.

ASK1-hämmare NQDI-1 förbättrar långsiktiga neurologiska funktioner efter SAH. Med starthastigheter på 5 eller 10 rpm för Rotarod-testet minskade falllatensen signifikant i SAH plus-vehikelgruppen jämfört med skengruppen, medan falllatensen var signifikant förlängd efter intracerebroventrikulär injektion av NQDI-1 jämfört med SAH plus-vehikeln. grupp (Fig. 2C och D). Vidare, under dagarna 1-5 av träningsfasen av Morris water labyrint-testet vecka 4 efter SAH, visade SAH plus fordonsgruppen signifikant längre flyktlatens och simdistans jämfört med skengruppen, medan NQDI-1 behandling visade en signifikant minskning jämfört med SAH plus-vehikelgruppen (Fig. 2E-G). I testfasen med avlägsnandet av den cirkulära undervattensplattformen observerades inga signifikanta skillnader i simhastighet mellan de tre grupperna (Fig. 2H). Sondkvadrantens varaktighet var signifikant kortare i SAH plus-vehikelgruppen jämfört med skengruppen och NQDI-1-behandlingen förlängde prospekteringstiden signifikant jämfört med SAH plus-vehikelgruppen (Fig. 2I).

ASK1-hämmare NQDI-1 minskar oxidativ stress och neuronal apoptos 24 timmar efter SAH. Nivån av oxidativ stress mättes med DHE-färgning och andelen apoptotiska neuroner bedömdes med hjälp av procentandelen TUNEL-positiva neuroner 24 timmar efter SAH. Andelen DHE-positiva celler var signifikant högre i SAH plus vehikelgruppen jämfört med skengruppen och NQDI-1 behandling minskade detta signifikant jämfört med SAH plus vehikelgruppen (Fig. 3A och). Andelen TUNEL-positiva neuroner var signifikant högre i SAH plus vehikelgruppen jämfört med skengruppen. Andelen TUNEL-positiva neuroner minskade dock signifikant efter behandling med NQDI-1 jämfört med SAH plus-vehikelgruppen (Fig. 3B och D).

ASK1 siRNA, BMS-582949 och SP600125 förbättrar kortsiktiga neurologiska funktioner 24 timmar efter SAH. Jämfört med SAH plus Scr siRNA-gruppen eller SAH plus-vehikelgruppen, visade administrering av ASK1 siRNA, BMS-582949 eller SP600125 signifikant förbättring av den modifierade Garcia- och strålbalanspoängen (Fig. 4A och B).

NQDI-1 dämpar oxidativ stress och apoptos efter SAH via minskad fosforylering av ASK1, p38 och JNK. Proteinuttrycksnivåerna för ASK1, p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE, HO‑1, Bax och Bcl‑2 var signifikant högre efter SAH jämfört med skengruppen; förhållandet p-ASK1/ASK1 var dock inte signifikant annorlunda (Fig. 5A-M). Injektionen av vehikel eller Scr siRNA inducerade inte signifikanta skillnader i proteinuttrycksnivåerna jämfört med SAH-gruppen. Jämfört med SAH plus-vehikelgruppen orsakade behandling med NQDI-1 en signifikant minskning av proteinexpressionsnivåerna för p-ASK1/ASK1, p-p38, p-JNK, 4-HNE och Bax, medan proteinexpressionsnivåerna för HO ‑1 och Bcl‑2 ökade betydligt. Jämfört med SAH plus Scr siRNA-gruppen, minskade proteinuttrycksnivåerna av ASK1 signifikant efter injektion av ASK1 siRNA. Behandling med ASK1 siRNA resulterade också i en signifikant minskning av proteinuttrycksnivåerna för p‑p38, p‑JNK, 4‑HNE och Bax och en signifikant ökning av HO‑1 och Bcl‑2 uttryck jämfört med SAH plus Scr siRNA grupp.

p38-hämmaren BMS-582949 minskar proteinexpressionsnivåerna för p-p38 men påverkar inte p-ASK1-, ASK1- eller p-JNK-proteinexpressionsnivåerna. Behandling med p38-hämmaren BMS-582949 visade en signifikant minskning av proteinuttrycksnivåer av p-p38, 4-HNE och Bax och även signifikant ökat proteinuttryck av HO-1 och Bcl-2 jämfört med SAH plus-vehikelgruppen; proteinuttrycksnivåerna för ASK1, p‑ASK1/ASK1 och p‑JNK visade dock inga signifikanta skillnader (Fig. 6A‑M). JNK-hämmaren SP600125 minskar proteinexpressionsnivån för p-JNK men påverkar inte p-ASK1-, ASK1- eller p-p38-proteinexpressionsnivåerna. Behandling med JNK-hämmaren SP600125 orsakade en signifikant minskning av proteinuttrycksnivåerna för p-JNK, 4-HNE och Bax och en signifikant ökning av HO-1- och Bcl-2-proteinexpressionsnivåerna jämfört med SAH plus-vehikelgruppen; proteinuttrycksnivåerna för ASK1, p-ASK1/ASK1 och p-p38 förändrades dock inte signifikant (Fig. 7A-M).

【För mer information: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】