Bedöma immunitet genom kvantitativ mätning av SARS-CoV-2 IgG-antikroppar i fingersticksprov

Abstrakt

COVID-19 har direkt eller indirekt påverkat miljarder människor runt om i världen. Svaret på pandemin har fokuserat på att förhindra spridningen av sjukdomen och förbättra behandlingsalternativen. Diagnostiska tekniker har spelat en nyckelroll i detta svar sedan pandemins början. I takt med att vacciner och andra behandlingar har utvecklats och tagits i bruk har intresset för att förstå och mäta den individuella nivån av immunskydd ökat. Historiskt sett har användningen av antikroppstitrar för att mäta systemisk immunitet begränsats av en ofullständig förståelse av förhållandet mellan antikroppar och immunitet, avsaknaden av internationella standarder för antikroppskoncentration för att möjliggöra jämförelser mellan studier och otillräckliga kliniska data för att möjliggöra utvecklingen. av robusta antikropps-immunitetsmodeller.

Dessa begränsningar har dock nyligen förändrats. Med en djupare förståelse för antikroppar, spridningen av WHO:s antikroppsstandarder och utvecklingen av immunitetsmodeller med hjälp av datauppsättningar från flera covid-19-vaccinförsök, kan vissa typer av kvantitativa antikroppstester nu ge ett sätt att övervaka individens eller samhällets immunitet mot covid-19. Specifikt, tester som kvantifierar koncentrationen av anti-RBD IgG – antikroppar som riktar sig mot receptorbindningsdomänen för S1 spikproteinkomponenten i SARS-CoV-2 viruset – visar lovande som ett användbart och skalbart mått på COVID{ {6}} immunitet för både individer och samhällen. Men för att uppfylla detta löfte krävs ett snabbt och lättadministrerat test.

För att tillgodose detta viktiga kliniska behov, distribuerade Brevitest sin point-of-care-kapabla teknologiplattform som kan köra en snabb (<15 minute), quantitative antibody test with a sample of 10 µl of whole blood from a fingerstick. The test we validated on this platform measures the concentration of anti-RBD IgG in Binding Antibody Units per milliliter (BAU/mL) per WHO Reference Standard NIBSC 20/136.

I detta dokument presenterar vi studier som används för att karakterisera Brevitest anti-RBD IgG-analysen och utvärdera dess kliniska prestanda, lägre gränser för mätning, precision, linjäritet, interferens och korsreaktivitet. Resultaten visar förmågan hos denna analys att mäta en patients anti-RBD IgG-koncentration. Denna information, tillsammans med modeller som utvecklats från de senaste kliniska prövningarna av covid-19-vaccin, kan ge ett sätt att bedöma den nuvarande nivån av immunskydd hos en individ eller ett samhälle mot covid-19-infektion.

Därför måste vi i vårt dagliga liv aktivt förbättra vår immunitet och ha en hälsosam livsstil: tillräckligt med sömn, en hälsosam kost, måttlig motion och undvika dåliga vanor som rökning är de grundläggande förutsättningarna för att förbättra immuniteten och rätt motion. Dessutom fann vi att Cistanche också kan förbättra immuniteten, och fenyletanoidglykosiderna i Cistanche kan hämma produktionen och effekten av immunsuppressiva faktorer och därigenom förbättra kroppens immunitet.

Klicka var du kan köpa cistanche

Introduktion

Severe Acute Respiratory Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) är ett nytt coronavirus som dök upp som orsaken till den allvarliga luftvägssjukdomen (COVID-19) i december 2019 i Kina och snabbt spred sig, vilket orsakade en världsomspännande pandemi . SARS-CoV-2-viruset är en del av Betacoronavirus-släktet i familjen Coronaviridae. Andra medlemmar inkluderar Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 1 (SARS-CoV-1) och Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV).1 Den höga överföringsförmågan av viruset ledde till dess snabba, globala spridning trots aldrig tidigare skådade ansträngningar av folkhälsomyndigheter för att bromsa pandemins framsteg, inklusive låsningar, maskmandat, främjande av offentlig hygien, offentliga investeringar i snabb utveckling av vaccin och terapeutisk behandling och andra åtgärder.

Diagnostiska tester för detektering av aktiv infektion av viruset och bedömning av kroppens immunsvar på en virusutmaning har spelat avgörande roller i ansträngningarna att svara på pandemin, såväl som för att förstå sjukdomen och dess effekter på kroppen. För direkt detektering av viruset i luftvägarna har en uppsjö av nukleinsyraamplifieringsanalyser (inklusive PCR-analyser) och virala antigenanalyser utvecklats. Dessa tester har visat sig vara viktiga inslag i klinisk diagnos och sjukdomshanteringsstrategier. Virala detektions- och kvantifieringsanalyser ger dock ingen information om kroppens immunhistoria, respons eller status, och de ger inte heller någon indikation på risken för framtida infektion eller återinfektion.

För att förstå hur en patients immunsystem svarar på viruset behöver vi serologiska analyser. Innan omfattande molekylära tester och vaccinationer användes dessa analyser ibland för att även diagnostisera infektion med SARS-CoV-2. Skälet för detta tillvägagångssätt var att närvaron av antikroppar mot ett nytt virus, särskilt IgM-antikroppar, utan tidigare infektionshistoria, kunde användas för att diagnostisera aktuell infektion om de kombineras med överensstämmande kliniska symtom. Detta diagnostiska tillvägagångssätt övergavs dock till stor del tidigt i pandemin med den snabba tillväxten och lättillgängligheten av antigen- och nukleinsyratestning (NAT). Ändå fann serologiska tester fortfarande vissa användningsområden för epidemiologisk övervakning och utbrottskontroll i vissa populationer.

Allt eftersom pandemin fortskred ledde ett samarbete mellan regeringar, akademiker och läkemedelsindustrin till utveckling och testning av flera vaccinkandidater, vilket kulminerade i en serie godkännanden från hälsomyndigheter världen över med början i slutet av 2020. Även om vaccination gav en betydande inverkan på infektionernas omfattning och svårighetsgrad i de flesta fall förväntades en oundviklig försämring av detta skydd baserat på tidigare erfarenhet av vacciner. Men karaktären av detta förfall och skyddets effektiva varaktighet varierar kraftigt mellan vacciner och individer, och samhällseffekten av förlusten av skydd är fortfarande okänd. Följaktligen pågår det en debatt om användbarheten, behovet och tidpunkten för boosterdoser av vacciner för att upprätthålla immunskyddet mot viruset, en debatt som har intensifierats med uppkomsten av olika varianter av den ursprungliga stammen.

För att förstå och korrekt skildra en individs svar på vaccination för att hjälpa dem att fatta individualiserade beslut med bästa tillgängliga kunskap, behövs kvantitativa antikroppstester som känsligt kan mäta antikroppsnivåerna som genereras av vaccinet, naturlig infektion eller en kombination av de två. Men även om sensitivitet, specificitet och repeterbarhet är väsentliga, är snabba resultat och enkel administrering (inklusive både provmatris och testplats) också önskvärda egenskaper hos alla tester som förväntas bli allmänt använda.

Flera tillverkare har skapat och marknadsfört serologiska analyser. Tekniken bakom de flesta av dessa immunanalyser kan kategoriseras som antingen laterala flödestester (LFT) eller enzymkopplade immunanalyser (ELISA). LFT är enkla att använda och kräver en liten mängd blod, men de mest exakta LFTs kräver en venpunktion för att få ett serum- eller plasmaprov för testet. På senare tid har några serologiska LFT utvecklats som kan använda blodprover från fingerstick. Exempel på kommersiellt tillgängliga LFT är InBios SCoV-2 Detect IgG Rapid Test2 och Access Bios CareStart COVID-19 IgM/IgG3. Trots deras användarvänlighet och snabba vändning av resultat är en utmaning för LFTs deras brist på kvantifiering och i sig lägre känslighet jämfört med laboratorie-ELISA4. Känslighetsbegränsningen beror på frånvaron av enzymamplifiering av signalen och avsaknaden av tvättsteg mellan reaktionerna för att separera reaktantkemikalierna. Ändå spelar LFTs en betydande roll i diagnostik på grund av deras låga kostnad, hastighet och användarvänlighet.

En annan huvudkategori av immunoassaytester är ELISA. Enzymkopplade immunosorbentanalyser utförs vanligtvis med en av två metoder:

1. ELISA labbkit avsedda att köras i certifierade laboratorier med hjälp av 96-brunnsmikroplattor i kombination med plattläsare (t.ex. ZEUS ELISA SARS-CoV-2 IgG Test System5; eller EUROIMMUN Anti-SARS- CoV-2 ELISA (IgG)6).

2. Förladdade kassetter avsedda att köras på patentskyddade laboratorieimmunanalysatorer (t.ex. Roches Elecsys Anti-SARS-CoV- 7; eller Siemens ADVIA Centaur SARS-CoV-2 IgG (sCOVG)8). Dessa ELISA är högre känslighetstester som ofta är semikvantitativa.

Tyvärr saknar dessa metoder snabbheten och användarvänligheten för LFT, vilket kräver venpunktionsblod som kliniskt prov och utbildad personal för att utföra testerna i ett certifierat laboratorium, som ofta måste göra betydande kapitalinvesteringar för att uppnå höga nivåer av testkapacitet. Omhändertagande av resultaten sker vanligtvis inom några dagar, beroende på effektiviteten i testoperationen. Men även de mest effektiva operationerna kan bara leverera testresultat inom några timmar med tanke på begränsningarna hos den underliggande immunanalystekniken.

Brevitest Technologies, Inc. (Brevitest) har utvecklat en immunanalysplattform som utför enzymkopplade immunanalyser vid vårdpunkten inom 15 minuter. Den kombinerar fördelarna med LFT (enkelhet, låg provvolym, kostnad och hastighet) och ELISA (sensitivitet, specificitet, precision, kvantifiering och tillförlitlighet). Brevitest-plattformen består av en provbehandlingsenhet (SPU) som kör individuella tester på engångstestkassetter. SPU:n är en liten robotenhet som är helautomatiserad och interagerar med ett centralt analys- och databassystem som körs i molnet (Brevitest Cloud). Den använder en patenterad patron som innehåller reagenser som krävs för att utföra alla ELISA-steg och använder värme och rörliga magneter för att styra reaktionsprocessen.

När reaktionerna är klara mäter SPU:n färgförändringen i indikatorreagenset som är ett resultat av det sista steget i ELISA-processen. De råa optiska avläsningarna överförs säkert till Brevitest Cloud för analys och bearbetning innan resultatet görs tillgängligt för patienten och läkaren i realtid. Vi har tidigare publicerat användningen av denna plattform för att upptäcka närvaron av anti-SARS-CoV-2 sekretorisk IgA i saliv. 9

Brevitest har utvecklat och validerat en analys för att kvantifiera SARS-CoV-2 anti-RBD IgG-antikroppar i fingersticksblod på mindre än 15 minuter på sin egenutvecklade plattform. I denna rapport presenterar vi data från valideringsstudierna och diskuterar testets potentiella kliniska och epidemiologiska användningsområden.

Material och metoder

Material, instrument och reagens: Brevitest analysplattform har tre komponenter: en provbehandlingsenhet (SPU), en förladdad patron och molnbaserad analysmjukvara (Brevitest Cloud). (Se figur 1.) SPU:n är en miniatyriserad helautomatisk robotenhet med mekaniska, optiska och termoregulatoriska element. SPU:n använder permanentmagneter för att styra rörelsen av magnetiska mikrosfärer över flera fack i patronen och oscillerar magneterna i varje fack med hjälp av proprietära blandningsmönster.

I varje fack äger ett enda steg av flerstegs ELISA-reaktionen rum på ytan av dessa mikrosfärer. Den slutliga reaktionen resulterar i produktionen av en färgad förening som mäts som en optisk signal och råavläsningarna skickas till Brevitest Cloud för analys. Det finns flera säkerhetsåtgärder inbyggda i plattformen för att säkerställa att patronen sätts in på rätt sätt, att korrekt test utförs, att kassetten inte har passerat utgångsdatumet, att testresultaten är giltiga och att patientidentifierbar information inte är i fara.

Patronen är förladdad med de reagenser som krävs för att köra Brevitests COVID-19 IgG-analys. Patronen är inte en mikrofluidisk anordning, eftersom det inte finns någon rörelse av reagenser i patronen; snarare är de viktigaste ELISA-komponenterna – antigen, infångningsantikropp och spårningsantikropp – bundna till magnetiska mikrosfärer som förflyttas mellan reagensbrunnar. Det infångade antigenet som används är Receptor Binding Domain (RBD) för S1-proteinet från SARS-CoV-2-viruset. Det fångade IgG detekteras sedan med hjälp av ett anti-humant IgG kopplat till en pepparrotsperoxidas (HRP)-molekyl. Den sista färgförändringen sker i facket som innehåller TMB, som ändras från färglöst till blått i närvaro av HRP. Varje patron är konfigurerad att köra 3 ELISA-reaktioner samtidigt i separata kanaler. Två kanaler innehåller provet med hög respektive låg utspädning, och en kanal är laddad med en känd koncentration av anti-SARS-CoV-2 Spike S1 IgG för kvalitetskontroll. Testmaterialet, som inkluderar SPU:n och patronerna, utvecklades på Brevitest Technologies, Inc. och tillverkades vid deras CLIA-certifierade laboratorium.

Prover samlades in från försökspersoner enligt ett IRB-godkänt protokoll efter samtycke med ett IRB-godkänt informerat samtyckesformulär. Proverna inkluderar fingersticksblod som erhållits enligt standardprocedurer med lämpliga säkerhetsåtgärder. För att samla in fingersticksblodet för Brevitest-analysen användes en 28G engångslansett, följt av uppsamling med ett 10 µl engångsrör med fast volym av mikrokapillärer. Tillverkarens data för mikrokapillärröret indikerar att provvolymen varierar<1% on clinical tests. The clinical history of the subjects was collected in a questionnaire and recorded before taking their sample.

Klinisk validering: Fingerstickprover (107 prover) erhölls från individer som svarade på ett samtal om att delta i den kliniska studien som genomfördes vid Brevitests CLIA-certifierade laboratorium i Houston, Texas. Nittio (90) prover togs från de med en rapporterad historia av SARS-CoV-2-infektion och/eller de som hade fått minst en dos av något av de tre vaccinerna och klassificerades som "positiva". Sjutton (17) prover togs från individer som inte hade en medicinsk historia av infektion med SARS-CoV-2 och rapporterades aldrig ha fått ett covid-19-vaccin och klassificerades som "negativa".

Precision: Analysens precision karakteriserades i en studie vägledd av CLSI EP05-A3. I denna studie testades tre prover representativa för spektrumet av koncentrationer som påträffades i rutinmässiga kliniska operationer. Proverna testades i replikat av två under tre dagar på två olika partier per dag (för totalt sex partier) och tre analysatorer. Programvaran Analyse-it användes för att beräkna resultaten.

Korsreaktivitet och interferens: För att testa korsreaktivitet på Brevitest-analysen erhölls en panel av prover som är kända för att vara negativa för SARS-CoV-2 och positiva för IgG-antikroppar mot följande virus från BioIVT: influensa A , influensa B, HBV, HCV, HIV, Haemophilus influenzae, alfa-coronavirus 229E och NL63, beta-coronavirus OC43 och HKU1, RSV, Parainfluenza och Mycoplasma pneumoni. Dessa prover testades på Brevitest-analysen, och de med resultat under detektionsgränsen (LOD; 6,2 BAU/ml) klassificerades som icke-korsreaktiva.

Vanliga interferenser erhölls från Sun Diagnostics för att spika prover och bestämma deras effekt på testet. Fyra fingersticksprover som inte innehöll interferent (lågt och högt SARS-CoV-2 IgG-prov) spetsades med hemolysat (1000 mg/dL), triglyceridrika lipoproteiner (500 mg/dL) och konjugerat bilirubin (40 mg). /dL). Den procentuella skillnaden till kontrollprovet beräknades för varje spikprov och tolkningarna av resultaten undersöktes.

Analysens analytiska prestanda: Analysens detektionsförmåga, inklusive gränsen för blank (LOB) och LOD, bestämdes baserat på vägledning från CLSI EP{{0}}A2. För att erhålla LOB testades 4 blanka fingersticksprover i replikat om 2 under 3 dagar på 2 lots och 3 analysatorer. LOD bestämdes genom att testa 4 lågnivåprover i replikat om 2 under 3 dagar på 2 lots och 3 analysatorer. De 4 lågnivåproverna skapades genom att blanda bekräftade negativa prover med en känd mängd WHO-standard (0,17 µl 1000 BAU/ml standard). Kvantifieringsgränsen (LOQ) beräknades som den lägsta testade koncentrationen högre än LOD plus 4,5 gånger standardavvikelsen som observerades i vår LOD-studie. Den statistiska analysen utfördes med programvaran Analyse-it. En studieguide av CLSI EP06-A utfördes för att fastställa linjäriteten. Tomprover spetsades med den internationella WHO-standarden (WHO Reference Standard NIBSC 20/136) för att förbereda 10 prover med känd koncentration. Proverna testades i 4 replikat med 1 reagenslot.

Resultat

Demografiska data: En uppdelning av demografin för den testade populationen presenteras nedan (tabell 1).

Klinisk prestanda: På grund av det opraktiska i att ta pre-COVID-prover av fingerstickshelblod och avsaknaden av ett fingersticksreferenstest för kvantitativ mätning av COVID-19 IgG-antikroppar, utfördes en klinisk överensstämmelsestudie baserad på klinisk historia. Prover samlades in från totalt 107 försökspersoner. Klinisk historia data erhölls också från dessa försökspersoner; all data var självrapporterad och verifiering av data utfördes där det var praktiskt möjligt.

Baserat på denna självrapporterade kliniska historia hade 17 försökspersoner aldrig symtomatisk infektion med covid-19 och vaccinerades aldrig. De övriga 90 försökspersonerna hade antingen blivit infekterade, vaccinerade eller båda. Försökspersoner som varken hade vaccinerats eller infekterats förväntades inte ha några detekterbara antikroppar (dvs. under detektionsgränsen) och karakteriserades som negativa. De återstående försökspersonerna förväntades ha detekterbara nivåer av antikroppar (dvs. över detektionsgränsen) och karakteriserades som positiva.

Resultaten visade en övergripande positiv procentöverensstämmelse (PPA)/känslighet på 97,8 procent (95 procent CI: 92,42 procent - 99,40 procent ) och en övergripande negativ procentuell överensstämmelse (NPA)/specificitet på 100 procent (95 procent KI) : 79,61 procent - 100 procent ). Se tabell 2.

I linearitetsstudien bereddes lösningar med kända koncentrationer och testades på Brevitest-anordningen för att jämföra de erhållna värdena. Linjäritet demonstrerades över det analytiska mätintervallet på 22,2 till 2000 BAU/ml (se figur 2). Från de 10 proverna som testades togs 2 poäng, 0 BAU/ml och 4000 BAU/ml bort från det linjära området (se tabell 5). Med hänsyn till uppskattningarna av LOB, LOD, LOQ och linjäritet är det analytiska mätintervallet från 22,2 till 2000 BAU/mL.

Korsreaktivitet och interferens: Vi utvärderade analysen för potentiellt korsreagerande antikroppar. Vissa HCV-prover (2), HIV-prover (1) och alla Coronavirus-prover låg över detektionsgränsen för SARS-CoV-2 IgG-testet. Resten av proverna låg under LOD (se tabell 6).

Diskussion

Det sägs ofta att infektion är ett krig mellan patogenen och värden. I det kriget är den centrala delen av vårt försvar – oavsett om det är mot en enskild infektion eller en global pandemi – det mänskliga immunsystemet.

På sin mest grundläggande nivå är immunsystemet sammansatt av celler, proteiner och andra molekyler som samverkar för att identifiera patogener, förhindra infektion och, om en infektion skulle få fäste, eliminera den invaderande patogenen eller nå ett hållbart "dödläge" med Det.

För att fortsätta med krigsanalogin har immunsystemet en omfattande "intelligens" förmåga som använder cellytreceptorer, cytokiner, kemokiner, dendritiska celler, immunoglobuliner, stora histaminkomplex och andra element för att känna igen toxiner, bakterier, svampar, parasiter och virus , och skicka varningar till andra delar av immunsystemet om att ett hot har upptäckts och åtgärder krävs.

Som svar mobiliserar immunsystemet ett brett spektrum av "vapen" för att neutralisera och eliminera hotet, inklusive men inte begränsat till reaktiva syrearter, antimikrobiella peptider, effektor B-celler, plasmaceller, CD4 T-celler, CD8 T-celler NK-celler, makrofager, neutrofiler och ett utomordentligt mångsidigt utbud av fria immunglobuliner eller antikroppar. Dessa komponenter kan ses som delar av tre stora delsystem – medfödd immunitet, slemhinneimmunitet och humoral immunitet – men sammankopplingen och interaktionen mellan dessa subsystem är omfattande, vilket ger både redundans och komplexitet till det övergripande immunsystemet. 10

Antikroppar är viktiga effektorer av både mukosal och humoral immunitet men deltar också i patogenigenkänning och signaleringsprocesser. Deras två primära effektorlägen är neutralisering och opsonisering, där neutralisering är av särskild betydelse när de utmanas med en viral patogen. Vaccinforskare och -utvecklare har ägnat särskild uppmärksamhet åt att neutralisera antikroppar på grund av deras förmåga att förhindra inträngning av viralt RNA i värdceller, och på så sätt hindra den virala replikationsprocessen som är en nödvändig komponent i alla allvarliga infektioner.

Den skyddande rollen som antikroppar spelar har visats vid covid-19 med både konvalescent serum och terapeutiska monoklonala antikroppar, vilket har visat sig vara särskilt fördelaktigt för individer med låga nivåer av endogena antikroppar.11,12 FDA har godkänt monoklonala antikroppar terapeutiskt hos individer som nyligen diagnostiserats med covid-19 och profylaktiskt hos individer som inte kan starta ett immunsvar mot SARS-CoV-2.13

Men medan antikroppar spelar viktiga biologiska roller som effektorer av immunitet, kan de ha ännu viktigare kliniska och epidemiologiska roller som indikatorer på immunitet.

Dessa roller är ofta förvirrade; vi hör regelbundet att "immunitet är mer än antikroppar" som en anledning till att inte testa antikroppsnivåer. Denna observation är naturligtvis sann. Det krävs mer än antikroppar för att generera den sorts robusta, överflödiga och snabba respons som krävs för att den mänskliga arten ska överleva i den fientliga miljö vi lever i.

Men frågan är inte om antikroppsnivåer är synonymt med immunitet; frågan är om antikroppsnivåer är korrelerade med immunitet.

Ur ett kliniskt perspektiv är det viktigaste måttet på övergripande immunskydd en minskning av risken för symtomatisk infektion jämfört med den allmänna befolkningen. (Asymptomatiska infektioner kan vara relevanta för vissa epidemiologiska frågor, men de anses vanligtvis inte vara ett sjukdomstillstånd av klinisk betydelse.) Detta mått har använts i stor utsträckning för att bedöma effektiviteten av ett covid-19-vaccin.14

Vaccinförsök har till exempel ett primärt slutmått på "vaccineffektivitet", vilket är minskningen av infektionsfrekvensen i den aktiva (vaccinerade) armen i förhållande till kontrollarmen (placebo).

Men eftersom infektionsfrekvensen vanligtvis är ganska låg, har vaccinförsök av nödvändighet ett mycket stort antal försökspersoner. Varaktigheten och kostnaderna (både i pengar och risker för människors hälsa) för sådana försök har varit en fråga av stor oro för beslutsfattare och industri, eftersom de begränsar svar på snabbrörliga virusutbrott som kan bli globala pandemier. Som ett resultat av detta har det länge funnits en önskan att hitta en surrogatbiomarkör som kan användas för att bedöma immunstatus hos individer och populationer, och därmed vägleda både vaccinutveckling och pandemiresponshantering.

Kort sagt, vi vill ha ett enkelt sätt att mäta immunitet.

Med tanke på vad vi vet om hur immunsystemet fungerar är antikroppar en självklar kategori av mätningar att överväga för denna roll. De är involverade i både det tidiga svaret på en patogen utmaning (genom generering av pentameriskt IgM och dimert sekretoriskt IgA) och långsiktig immunitet genom minnes B-celler som differentierar till antikroppsproducerande plasmaceller när en patogen dyker upp igen och genererar ett sekundärt immunförsvar. svar.15

Användningen av antikroppar som korrelat av immunitet har emellertid hindrats av bristen på svar på två grundläggande frågor:

Den senaste tidens framväxt av en internationell standard för antikroppskoncentration var ett viktigt första steg för att besvara dessa två frågor. Utan en sådan standard sträcker sig jämförelsen av antikroppstestdataset från svårt till opraktiskt till omöjligt. WHO:s referensstandard NIBSC 20/13616 etablerades i december 2020 och är en avgörande och välkommen utveckling som lovar att dramatiskt accelerera vår förmåga att både hitta och sprida insikter av intresse för forskare, kliniker och beslutsfattare.

En annan viktig ny utveckling som dramatiskt har förbättrat potentialen att mäta immunitet är det aldrig tidigare skådade antalet och omfattningen av vaccinförsök som genomförts under de senaste 12 månaderna. När data från dessa försök har publicerats och analyserats har två mycket viktiga insikter framkommit:

A. Neutraliserande antikroppar är starkt korrelerade med immunitet mot covid-19.17 Från början av pandemin fokuserade forskare på spikproteinet från SARS-CoV-2-viruset.

Det fokuset belönades och förstärktes av data från mRNA-vaccinförsök, som visade att antikroppar mot spikeproteinet som genererades av vaccinet var mycket skyddande.

B. Vissa antikroppstester är bra korrelat för skydd mot covid-19. 18 Baserat på ovanstående insikt är det inte förvånande att neutraliseringsanalyser – både levande virus- och pseudovirustyper – är bra korrelat för immunitet mot COVID-19 och minskning av sjukdomens svårighetsgrad. Emellertid är neutraliserande antikroppsanalyser svåra (och, i fallet med analyser av levande virus, farliga) att utföra, vilket begränsar deras tillgänglighet till endast ett fåtal kliniska miljöer. Ytterligare forskning har emellertid funnit att bindande antikroppar mot RBD-domänen också är starkt korrelerade med skydd mot COVID-19, kanske på grund av den neutraliserande effekten av kompetitiv antikroppsbindning som stör bindningen av spikproteinet till ACE{ {5}} receptor.

All denna senaste utveckling – uppkomsten av en internationell standard, identifieringen av neutraliserande antikroppar som utmärkta skyddskorrelat och utvidgningen av denna korrelation till andra, mer tillgängliga antikroppstester – har skapat förutsättningar för en dramatisk förbättring av den kliniska hanteringen av COVID-19 med antikroppstester som vägledning. Men för att implementera denna förbättring behövs en testteknik som kan leverera kvantitativa resultat i WHO-standardenheter av BAU/mL med tillräcklig precision vid vårdpunkten från ett bekvämt, patientvänligt prov inom en snabb tidsram.

Brevitest Quantimmune™ COVID-19 IgG Antibody Test är ett kvantitativt test som presenterar resultaten i BAU/mL, enligt WHO Reference Standard NIBSC 20/136 för anti-SARS-CoV-2 antikropp. Vid utvecklingen av denna analys mättes och beräknades LOB, LOD, LOQ, reproducerbarhet och linjäritet. LOD beräknades till 6,2 BAU/ml och Lwas OQ var 22,2 BAU/ml. Studierna för att fastställa dessa värden utfördes på fingersticksprover från patienter som inte tidigare var infekterade eller vaccinerade. Prover från patienter spetsades också med låga nivåer av WHO-standarder för att skapa låga nivåer av prover som användes i beräkningarna. För att testa linjäriteten spetsades ett negativt prov med kända nivåer av referens WHO-standarden. Baserat på resultaten bestämdes det kvantifierbara området för analysen till att vara från 22,2 till 2000 BAU/ml. Precisionsstudier visade en precision inom partiet på 13,8 procent och en reproducerbarhet på 23,4 procent CV. Korsreaktivitet och interferens testades också för att avgöra om potentiella prover eller substanser kunde påverka testresultatet.

Brevitest mäter antikroppar mot RBD-delen av spikeproteinet, som är mycket korrelerande med neutraliserande aktivitet.19 I en nyligen publicerad studie analyserade forskare sambandet mellan koncentrationen av vissa antikroppar och skydd mot SARS-CoV-2 kvantifierat som vaccinets effektivitet, det vill säga minskningen av frekvensen av symtomatisk infektion för vaccinerade kontra ovaccinerade försökspersoner. 18 I studien mättes bindande och neutraliserande antikroppar 28 dagar efter den andra dosen hos infekterade och oinfekterade vaccinmottagare, med antikroppskoncentrationer rapporterade med hjälp av WHO:s referensstandard. En vaccineffektivitet på 50 procent mot symtomatisk infektion med en majoritetsvariant av alfa (B.1.1.7) av SARS-CoV-2 uppnåddes med 95 procents konfidens (VE50@95) vid en koncentration av anti-RBD-antikroppar av 109 BAU/ml.18

I Brevitest-analysen användes detta nummer för att ställa in cutoff-skillnaden mellan "Låg" och "Hög", med värden under LOD rapporterade som "Ingen upptäckt." Figur 3 visar cutoffs för Brevitest-analysen. Således kan resultaten av Brevitest Quantimmune™ COVID-19 IgG Antibody Test användas för att uppskatta skyddsnivån i en klinisk miljö.

Tillgången till snabb, kvantitativ serologi i en vårdcentral från ett fingerstick som kan bedöma nivån av immunskydd på individ- och gemenskapsbasis är aldrig tidigare skådad och kan ha en djupgående inverkan på svaret på pandemier som COVID{{ 2}}. Till exempel, vid administrering av vaccinförstärkare har folkhälsotjänstemän och vaccinutvecklare vanligtvis rekommenderat en booster efter en viss tid. Den nuvarande rekommendationen för mRNA-vacciner är till exempel att få en booster efter 6 månader. Detta tillvägagångssätt med "fast boostertid" kan dock vara suboptimalt för patienter (särskilt äldre) som tenderar att förlora sin immunitet snabbare än 6 månader. Dessutom ger vaccination mot covid-19 12 månader eller mer för många människor. För det segmentet av den vaccinerade befolkningen kan det vara optimalt att skjuta upp en booster tills deras immunitet faller under en tröskel. Ett sådant uppskov kan ha flera fördelar: det kan förlänga den totala skyddsperioden för den patienten, kanske generera ett starkare och mer specifikt sekundärt svar och möjliggöra bättre användning av begränsade vaccintillgångar.

Figur 4 visar data hämtade från Brevitests kliniska valideringsstudie, som endast visar försökspersoner som fått ett mRNA-vaccin (Moderna eller Pfizer-BioNTech). Även om datauppsättningen är relativt liten (n=73), var mer än 12 procent av försökspersonerna under VE50@95-nivån på 109 BAU/mL före det 6-månads rekommenderade boosterdatumet, vilket tyder på att de kunde ha en skyddsgap om de skulle vänta med att öka. Å andra sidan hade mer än 31 procent av försökspersonerna antikroppsnivåer över VE50@95, vilket tyder på att de fortfarande hade kvarvarande immunitet, åtminstone mot B.1.1.7-varianten, och kan förlänga sin period av immunskydd genom att skjuta upp en booster . Även om sådana beslut alltid bör fattas i samråd med en läkare, kan detta tillvägagångssätt vara en användbar vägledning för dem som försöker hantera patientens immunitet.

Ett andra kliniskt användningsfall kan vara att utvärdera immunsvaret efter infektion eller vaccination. Detaljerna för serokonversion varierar mellan individer beroende på ålder, genetisk sammansättning, underliggande sjukdom, medicinering och andra faktorer. Människor som vaccineras producerar olika typer och koncentrationer av antikroppar, och dessa egenskaper förändras över tiden. Information om en patients nuvarande koncentration av antikroppar kan vägleda livsstilsbeslut genom att ta hänsyn till riskerna förknippade med skyddsnivåer och eventuell virusexponering i olika miljöer.

En tredje användning kan vara vid screening och övervakning av patienter som genomgår antikroppsbehandling eftersom beslut kan påverkas av nivåerna av antikroppar som upptäcks. Till exempel har det visat sig att behandlingar med konvalescent plasma och terapeutiska monoklonala antikroppar är mer effektiva för patienter utan antikroppar jämfört med patienter som har endogena antikroppar mot SARS-CoV-2. 11,12 Således kan denna information också användas för att identifiera patienter som skulle ha större nytta av administrering av monoklonala antikroppar, antingen terapeutiskt eller profylaktiskt, och hjälpa vårdgivare att hantera administreringen av dessa terapier.

Slutligen kan seroprevalensstudier förbättras avsevärt genom att använda ett kvantitativt antikroppstest för att bedöma flockimmunitet. Oavsett om det görs på samhällsnivå eller i vissa andra lämpliga miljöer som kontor, tillverkningsanläggningar eller skolor, skulle epidemiologisk modellering och beslutsfattande för folkhälsan förbättras avsevärt med ett mer exakt, lättadministrerat test, särskilt ett som är molnansluten och kan därmed få en "fågelperspektiv" av immunitet genom att integrera antikroppsresultat i realtid i ett programvarusystem för geolokalisering och kartläggning.

Slutsats

Nyligen genomförda studier har visat att ett kvantitativt anti-RBD IgG-antikroppstest är ett användbart korrelat för immunskydd mot covid-19. För att maximera effekten av denna viktiga insikt, ett test som är snabbt (<15 minutes) and precise, requiring only a fingerstick sample of blood, and capable of running in a point-of-care setting is needed.

Brevitest-analysen kan kvantifiera mängden SARS-CoV-2 IgG-antikroppar i fingersticksprover i BAU/mL, enligt WHO Referensstandard 20/136. Dess prestandaegenskaper presenteras i detta arbete. I analysvalideringstesterna bestämdes och utvärderades de nedre gränserna för mätning, precision, linjäritet, interferens och korsreaktivitet.

Bland möjliga användningsområden kan detta test vara ett värdefullt verktyg för att optimera tidpunkten för en vaccinförstärkning, verifiera serokonversion i immunförsvagade och andra riskgrupper, optimera den terapeutiska och profylaktiska användningen av monoklonala antikroppar och, mer allmänt, bedöma individ och befolkning. immunsvar, specifikt produktion av IgG-antikroppar, utlöst av SARS-CoV-2 eller vaccinet. Information om antalet SARS-CoV-2-antikroppar som finns i ett prov av en individ vid en given tidpunkt kan vara värdefull eftersom den kan vägleda terapeutiska, förebyggande eller livsstilsbeslut som kan förebygga eller hantera covid-19 .

Referenser

1 Lu, R., Zhao, X., Li, J., Niu, P., Yang, B., Wu, H., ... & Tan, W. (2020). Genomisk karakterisering och epidemiologi av 2019 års nya coronavirus: implikationer för virusursprung och receptorbindning. The Lancet, 395(10224), 565-574.

2 US Food and Drug Administration. InBios International Inc. EUA210368 Letter of Authorization, 24 augusti 2021.

3 US Food and Drug Administration. Access Bio Inc. EUA201309 Letter of Authorization, 6 augusti 2021.

4 Trombetta, BA, Kandigian, SE, Kitchen, RR, Grauwet, K., Webb, PK, Miller, GA, ... & Suliman, S. (2021). Utvärdering av serologiska sidoflödesanalyser för allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus-2. BMC infektionssjukdomar, 21(1), 1-14.

5 US Food and Drug Administration. ZEUS Scientific Inc. EUA201833 Letter of Authorization, 12 maj 2021.

6 US Food and Drug Administration. EUROIMMUN US Inc. Auktoriseringsbrev, 4 maj 2020.

7 US Food and Drug Administration. Roche Diagnostics EUA200514 Letter of Authorization, 19 maj 2021.

8 US Food and Drug Administration. Siemens Healthcare Diagnostics Inc. EUA202670 Letter of Authorization, 17 juni 2021.

9 Varadhachary, A., Chatterjee, D., Garza, J., Garr, RP, Foley, C., Letkeman, A., ... & Linbeck III, L. (2020). Saliv anti-SARS-CoV-2 IgA som en tillgänglig biomarkör för mukosal immunitet mot COVID-19. MedRxiv.

10 Janeway, C. (2001). Immunbiologi: Immunsystemet vid hälsa och sjukdom. Krans.

11 Hamilton, FW, Lee, TC, Arnold, DT, Lilford, R., & Hemming, K. (2021). Är konvalescent plasma meningslös vid covid-19? En Bayesiansk omanalys av den randomiserade kontrollerade studien RECOVERY. International Journal of Infectious Diseases.

12 Horby, PW, Mafham, M., Peto, L., Campbell, M., Pessoa-Amorim, G., Spata, E., ... & Landray, MJ (2021). Casirivimab och imdevimab hos patienter inlagda på sjukhus med covid-19 (ÅTERHÄLLNING): en randomiserad, kontrollerad, öppen plattformsprövning. medRxiv.

13 Deb, P., Molla, MMA, & Rahman, KSU (2021). En uppdatering av den monoklonala antikroppen som ett terapeutiskt alternativ mot COVID-19. Biosäkerhet och hälsa.

14 Bernal, JL, Andrews, N., Gower, C., Robertson, C., Stowe, J., Tessier, E., ... & Ramsay, M. (2021). Effektiviteten av Pfizer-BioNTech- och Oxford-AstraZeneca-vaccinerna på covid-19-relaterade symtom, sjukhusinläggningar och dödlighet hos äldre vuxna i England: test negativ fall-kontrollstudie. BMJ, 373.

15 Parham, P. (2014). Immunförsvaret. Garland Science.

16 Världshälsoorganisationen. (2020). Upprättande av WHO:s internationella standard och referenspanel för antiSARS-CoV-2-antikroppar. Expertkommitté för biologisk standardisering, Genève, 9-10.

17 Khoury, DS, Cromer, D., Reynaldi, A., Schlub, TE, Wheatley, AK, Juno, JA, ... & Davenport, MP (2021). Neutraliserande antikroppsnivåer är mycket förutsägande för immunskydd mot symtomatisk SARS-CoV-2-infektion. Naturmedicin, 1-7.

18 Feng, S., Phillips, DJ, White, T., Sayal, H., Aley, PK, Bibi, S., ... & Voysey, M. (2021). Korrelat av skydd mot symtomatisk och asymtomatisk SARS-CoV-2-infektion. Naturmedicin, 1-9.

19 Dolscheid-Pommerich, R., Bartok, E., Renn, M., Kümmerer, BM, Schulte, B., Schmithausen, RM, ... & Hartmann, G. (2021). Korrelation mellan en kvantitativ anti-SARS-CoV-2 IgG ELISA och neutraliseringsaktivitet. Journal of Medical Virology, 94(1), 388-392.

Javier T. Garza1* , Jacob Quick1* , Dev Chatterjee1* , Robert P. Garr1 , Atul Varadhachary1 , Leo Linbeck III1* 1Brevitest Technologies, Inc., Houston, TX. *Dessa författare bidrog lika mycket

Motsvarande författare:

Javier Garza: javierg@fannininnovation.com

Dev Chatterjee: dev@fannininnovation.com

Konkurrerande intressen:

JTG, JQ, DC, AV och LL är anställda hos Brevitest Technologies, Inc.

Forskningsstöd:

Utvecklingen av Brevitest-plattformen stöddes av National Institute on Drug Abuse (NIDA) och National Institute on Minority Health and Health Disparities (NIMHD) vid National Institutes of Health (NIH), anslagsnummer: 1 R43 DA{{2} }; 1 R43 MD013409-01A1; 1 R43 DA043325-01, 2 R44 DA043325-02, 5 R44 DA043325-03; 3 R43 DA041966-01S1, Vijay and Marie Goradia Foundation och Fannin Innovation Studio.

Författarbidrag:

Alla författare lämnade bidrag till utformningen, designen eller utförandet av verket. Alla författare har granskat manuskriptet kritiskt och har gett ett slutgiltigt godkännande till manuskriptet.

For more information:1950477648nn@gmail.com