Bensylerade dihydroflavoner och isokinolin-härledda alkaloider från barken av Diclinanona Calycina (Annonaceae) och deras cytotoxicitet

För mer information kontaktatina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Diclinanona calycina RE Fries populärt känd som "enviro", är en art av familjen Annonaceae som är endemisk i Brasilien. I vårt pågående sökande efter bioaktiva föreningar från Annonaceae Amazon-växter, undersöktes barken av D.calycina med klassisk kromatografiteknik som gav tretton föreningar (alkaloider och flavonoider) beskrivna för första gången i D. calycina såväl som i släktet Diclinanona. Strukturen av dessa isolerade föreningar fastställdes genom omfattande analys med användning av 1D/2D-NMR-spektroskopi i kombination med MS. De isolerade alkaloiderna identifierades som tillhörande underklasserna: enkel isokinolin, thali online (1); aporfin, anonain (2); oxoaporfin, liriodenin (3); bensyltetrahydroisokinoliner, (S)-(plus)-retikulin(4); dehydro-oxonorretikulin (3,4-dihydro-7-hydroxi-6-metoxi-1-isokinolinyl)(3-hydroxi-4-metoxifenyl)-metanon)(5 );( plus )-1S,2R-retikulin Ng-oxid (6); och (plus)-1S,2S-retikulin-N-oxid (7);tetrahydroprotoberberin, coreximin(8); och pavin, bisnorargemonin (9). Medanflavonoidertillhör de bensyleradedihydroflavonerisorhamnetin (10), dikamanetin (11) och en blandning av uvarinol (12) och isouvarinol (13). Förening 5 beskrivs för första gången i litteraturen som en naturlig produkt. Den cytotoxiska aktiviteten hos de huvudsakliga isolerade föreningarna utvärderades mot cancer och icke-cancercellinjer. Bland de testade föreningarna hittades de mest lovande resultaten för de bensylerade dihydroflavonerna dikamanetin (10) och blandningen av uvarinol (12) och isouvarinol (13), som uppvisade måttlig cytotoxisk aktivitet mot de testadecancercellrader(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Dichamanetin (11) visade cytotoxisk aktivitet mot HL-60 och HCT116 med IC50-värden på 15,78 ug·mL-I(33,70 umol·LI) och 18,99 ug∶mL-(40,56 umol. L-）, respektive medan blandningen av uvarinol（12） och isouvarinol (13) visade cytotoxisk aktivitet mot HL-60, med ett IC5-värde på 9,74 ugs.mL-1, och HCT116, med ett IC50 värde av 17,31 ug. ml-I. Dessa cytotoxiska aktiviteter kan tillskrivas närvaron av en eller flera hydroxibensylgrupper närvarande i dessa molekyler såväl som den position i vilken dessa grupper är kopplade. De cytotoxiska aktiviteterna av retikulin, anonain och liriodenin har tidigare fastställts, där liriodenin är den mest potenta föreningen.

Nyckelord: Diklinanona calycina; alkaloider och bensylerade dihydroflavoner; cytotoxisk aktivitet

Klicka för att lära dig mer om produkter

1. Introduktion

Annonaceae är en stor familj av tropiska och subtropiska träd och buskar, som omfattar cirka 112 släkten och 2440 arter [1]. Flera arter är kända för sina ätbara frukter och medicinska egenskaper ]2]. Den tidigare fytokemiska undersökningen med vissa arter av Annonaceae ledde till isolering och karakterisering av olika klasser av sekundära metaboliter, såsom monoterpener, diterpener, triterpener, lignaner,flavonoider, asaron-härledda fenylpropanoider, acetogeniner och främst typiska isokinolin-härledda alkaloider [3-7]. Några av dessa sekundära metaboliter isolerade från Annonaceae-arter uppvisade viktiga biologiska aktiviteter, såsom antiinflammatoriska och ureashämmande egenskaper [8,9], trypanocidala [10,11],leishmanicida [11,12], antimalaria [4,13] , antimikrobiell [4,14,15], antioxidant och antireumatiska verkan [9,15] och särskilt cytotoxisk aktivitet mot olika humana tumörcellinjer [4,6,11,16-21].

Även om familjen Annonaceae anses vara en primitiv och välstuderad familj, har få fytokemiska och/eller farmakologiska studier utförts med dess arter[3]. Fytokemiska och/eller farmakologiska studier har främst fokuserat på arter av släktena Annona, Asimina och Cananga, på grund av deras stora ekonomiska betydelse, och på vissa arter av släktena Duguetia, Guatteria och Xylopia[5]. Trots den stora tillväxten under de senaste 20 åren i förhållande till fytokemiska och farmakologiska studier är antalet undersökta arter fortfarande mycket litet i förhållande till ett stort antal erkända arter. För närvarande, enligt Web of Science, Scopus och SciFinders vetenskapliga databaser, har endast cirka 15 procent av de beskrivna Annonaceae-arterna någon motsvarande fytokemisk och/eller farmakologisk studie.

Bland de föga studerade arterna finns de som tillhör släktet Diclinanona Diels. Detta släkte tillhör stammen Annoneae, av underfamiljen Annonoideae, och förekommer endast i det tropiska Sydamerika (främst i Amazonasområdet). Det är ett släkte som endast består av tre arter, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas och Diclinanona tessmannii Diels, som förekommer som träd [22-24].D.calycina (synonym Xulopia calycina Diels) är en 8 till 30 m högt träd, populärt känt som "envireira" och "enviro", fördelat över hela Amazonas i Brasilien, Peru och Venezuela [23]. D.calycina är ytligt lik Xylopia för sina blommor med långsträckta och smala kronblad, men den är annorlunda för sina träiga, olösliga, klotformiga och tjockväggiga monokarper [23,24].

Tidigare studier med D. calycina rapporterar endast farmakologiska studier. Den första studien beskriver undersökningen av den antimikrobiella aktiviteten av metanoliska, kloroform- och vattenhaltiga extrakt mot mikroorganismerna Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus och Candida albicans med hjälp av gel-diffusionsmetoden [25]. Den andra rapporterar undersökningen av den antimikrobiella aktiviteten av organiskt (diklormetan: metanol 1:1) och vattenhaltiga extrakt mot mikroorganismen Enterococcus faecalis med hjälp av mikroutspädningsbuljonganalysen (MDBA) och diskdiffusionsanalysen (DDA)[26]. I vårt kontinuerliga sökande efter nya bioaktiva naturprodukter från Annonaceae från Amazonas regnskog, syftade denna studie till att undersöka de fytokemiska och farmakologiska egenskaperna hos barken av D.calycina. I denna rapport, tretton föreningar (nio alkaloider och fyra bensyleradedihydroflavoner) isolerades och identifierades för första gången i D.calycina, såväl som i släktet Diclinanona. Dessutom undersöktes cytotoxiciteten hos huvudföreningarna mot B16-F10, HepG2, K562 och HL{{ 4}} tumörcellinjer med Alamar blue-analysen.

2. Resultat och diskussion

2.1. Strukturell belysning av föreningarna

Efter att ha upptäckt närvaron av kvävehaltiga föreningar i metanolextraktet med hjälp av Dragendorffs reagens, utsattes det för syra-basbehandling enligt metodiken enligt Costa et al. [12] vilket resulterar i alkaloidala och neutrala fraktioner. En hög koncentration av kvävehaltiga föreningar observerades i den alkaloidala fraktionen som utsattes för kromatografisk analys. De successiva kromatografiska separationerna, som beskrivs i avsnittet Extraktion och isolering, ledde till isolering och identifiering av tretton kemiska beståndsdelar (1-13, figur 1), nio isokinolin-härledda alkaloider 1-9 och fyra bensylerade dihydroflavoner 10-13. Strukturerna för dessa isolerade föreningar (Figur 1) fastställdes genom omfattande analys med användning av 1D och 2D NMR-spektroskopi i kombination med MS (Supplementary Data), såväl som jämförelse med data från litteraturen.

Förening 5 erhölls som ett brunt amorft pulver och testades positivt för Dragendorffs reagens. Den visade en protonerad molekyl vid m/z328 [M plus H]' i LR-ESI(plus)MS-kompatibel med molekylformeln C18H1NO5. 'H- och 13C-NMR-spektra för 5 (tabell 1) överensstämde med de för retikulin (4)[27, förutom frånvaron av den kvävebundna metylgruppen (CH3-N) och signalen från metingruppen i position 1, som ersattes av en signal vid δc 165,1 i det typiska 13C-NMR-spektrumet för imingruppen konjugerad till en karbonylgrupp vid bc 192,8. I 'H-NMR-spektrumet, tre nedfältsväten vid δH 6,88（1H,d, J=8.4 Hz, H-5'）,5H7.57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H-2'）och δH 7,60(1H, dd, J=8.4 och 2.0 Hz, H-6'） , avslöjade närvaron av ett ABX-kopplingssystem. Två singlettsignaler vid 6H 6,90(1H,s, H-8) och 6,71(1H, s, H-5) indikerade närvaron av 1,2,4,5-tetrasubstituerad fenylring. Dessutom visade H-NMR-spektrumet av 5 också signaler för två metoxigrupper som resonerade vid bH 3,93 (3H, s) och 6H 3,95 (3H,s) och signaler för två metylengrupper som resonerade vid δμ 2,79 (2H,t, J=7.8 Hz） och 6H 3.89(2H,t,/=7.8 Hz), tillskrivna H-4 respektive H-3 (tabell 1) . Dessa data indikerade att alkaloid 5 har ett bensyltetrahydroisokinolinskelett [28-30].

Dessa grupper etablerades baserat på två- och trebindnings 'H-13-korrelationskartan från HMBC-NMR-experimentet (Figur 2 och Tabell 1). Denna analys avslöjade att vätet vid δH 3,89 （H-3） visade en trebands 'H-13C-korrelation med kolen vid 6c130.1(4a) och δc165.{ {42}}（C-1) och tvåbindnings-lH-13C-korrelation med kolet atδc 25.4(C-4), vilket bekräftar närvaron av imingrupp i molekylen. Å andra sidan visade signalerna vid δH 7.57 （H-2'） och δH 7.60（H-6') trebindnings lH-13C-korrelation med kolen vid δc 124.3（ C-6'）,5c 151,4（C-4')och δc192.8（C-7）,och5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4') respektive c 192.8(C-7'), vilket etablerar karbonylgruppen i molekylen (Figur 2 och Tabell 1). Därför, baserat på dessa NMR-data, förening 5

etablerades som bensyltetrahydroisokinolinalkaloiden 34-dihydro-7-hydroxi-6-metoxi-1-isokinolinyl)(3-hydroxi-4-metoxifenyl)-metanon, som var benämns dehydro-oxonorretikulin. Denna alkaloid beskrivs för första gången i litteraturen som en naturlig produkt. Dess första och enda uppteckning beskrevs av Dörnyei et al. 1982 【31】som en produkt av syntetiskt ursprung. Endast 'H-NMR-data beskrivs med några obestämda multipliciteter. Således fastställdes de fullständiga tilldelningarna för alla 1H- och 13C-NMR kemiska skift genom enbindnings(HSOC) och två- och trebindnings (HMBC)' H-13C-NMR-korrelationsexperiment och beskrevs i Bord 1.

Föreningarna 6 och 7 identifierades som bensyltetrahydroisokinolinalkaloiderna (plus )-1S,2R-retikulin-N-oxid respektive (plus )-1S,2S-retikulin-N-oxid. H-NMR-data för dessa alkaloider jämfördes med data som beskrivs av Lee et al. [28]med samma deutererade lösningsmedel (CD3OD) och vissa inkonsekvenser observerades (tabell 1), främst i förhållande till H-1, H-8 och H, C-NO. Det finns inga 13C-NMR-data beskrivna för dessa alkaloider i litteraturen. Baserat på de begränsade 1H- och 13C-NMR-data, såväl som de oklarheter som observerats för dessa molekyler, utfördes 'H och 13C 1D och 2D NMR-experiment för att bestämma deras korrekta tilldelningar och multipliciteter.

Den korrekta positionen för väte H{{0}} och H-1 i båda isomererna 6 och 7 fastställdes baserat på trebindnings 'H-13C-korrelationskartan från HMBC -NMR-experiment (Figur 2). För isomeren 6 visade analysen att vätet vid δH 5,78（H-8） visade trebindnings 'H-13C-korrelation med kolen vid 6c 79,8（C-1）,δc120 .6(4a) och δc 149,4 （C-6), medan vätet vid δH 4,13 （H-1） visade trebindnings 'H-13C-korrelation med kolen vid c 60,7 (C-3), 6c 115,7 (C-8), δc 120,6 (C-4a) och 131,2 (C-1'), vilket etablerar korrekta positioner för väteatomerna H-8 och H-1 för isomer 6. Denna tillskrivning kan bekräftas ytterligare genom analysen av vätet vid δH 6,76（H-5）som visade trebindningar H-13C-korrelation med kolen vidδc 27.0（C-4）,δc 127.1（C-8a) och δc 145.7 （C-7)））））. För isomeren7 visade analysen att vätet vid δH 6,30 （H-8) visade trebindnings 'H-13-korrelation med kolen vid δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a), och δc 148,9 （C-6), medan vätet vid δH 4,46 （H-1) visade trebindnings H-13C-korrelationer med kolen vid δc 62,9 （C {82}}）,5c 115.5（C-8）, bc 122.8（C-4a） och 131.4（C-1'）, vilket fastställer de korrekta positionerna för vätena H -8 och H-1 för isomer 7. Denna tillskrivning bekräftades också av analysen av vätet vid δH 6,71 （H-5) som visade trebindnings-lH-13C korrelationer med kolen vid δc26.3（C-4), δc 126.9（C-8a) och6c 146.1（C-7) (Figur 2). NOESY-experimentet utfördes också för att fastställa den korrekta stereokemin för isomers6 och 7. I detta experiment indikerade den starka NOE-korrelationen av H-1（δH 4.13) och H, CN(5 3}.15) -orientering av syret i isomeren 6. Å andra sidan kunde ingen uppenbar NOE-korrelation mellan H-1(6H 4.46) och HAC-N(5H 3.20) hittas i 2D-NOESY-experimentet för 7, vilket indikerar -orienteringen av syret i isomeren 7 (figur 2). Dessa små skillnader i de kemiska skiftningarna av dessa isomerer observeras tydligt på grund av stereokemin hos det kväve som påverkas av syre och positionerna. Jämförelser av H- och 13C-NMR-data som erhållits för föreningarna 6 och 7 med data för molekyler med nära strukturer såsom hexapetalin A och hexapetalin B [30] stödjer data som beskrivs i Tabell 1 utan tvetydighet.

Föreningarna 1-4 och 8-13 identifierades som talifolin (1) [32], anonain (2) [33]liriodenin (3)[10,34], (S)-( plus )-retikulin ( 4)[27], koreximin (8) [34,35], bisnorargemonin (9)[36], isochamanetin (10) [37], dikamanetin (11) [37] och en blandning av uvarinol (12) och isouvarinol (13) [37] baserat på deras spektroskopiska profiler och jämförelse med värden i litteraturen. lH- och 13C 1D- och 2D-NMR-spektra, såväl som masspektra för alla isolerade föreningar, finns tillgängliga som tilläggsmaterial.

Ur en kemofenetisk synvinkel (en ny term för växtkemosystematik/växtkemotaxonomi) är det viktigt att notera att förekomsten av C-bensylerade flavanoner och C-bensylerade dihydrochalkoner är en speciell typ av flavonoider som härrör från det välkända flavanon pinocembrin och har beskrivits särskilt i arter av släktet Uoaria som tillhör familjen Annonaceae [3,38-42]. Närvaron av dessa föreningar i D. calycina tyder på nära kemofenetiska samband med Uoaria. Å andra sidan bör ytterligare undersökningar utföras med andra delar av växten, såväl som andra arter av Diclinanona för att bekräfta detta kemofenetiska samband. Flavanoner och chalconer är utbredda i de högre växterna, men tillsatsen av bensylgrupper är ganska sällsynt och verkar vara begränsad i Annonaceae till släktet Uoaria [3,39-42] och nu till släktet Diclinanona. Bensylgrupper härrör förmodligen från en C6-C1-väg, men o-hydroxifunktionalitet är ovanlig. Frånvaron av substituenter i B-ringen i alla dessa flavonoider av Uoaria och Diclinanona kan kopplas till den tidigare observationen angående flavonoiderna i Popowia cauliflora [38].

De isokinolinhärledda alkaloiderna som isolerats och beskrivs i detta arbete har redan registrerats i flera arter av Annonaceae i olika släkten. Vissa av dessa, såsom liriodenin och anonain, anses vara kemofenetiska markörer, och närvaron av dessa alkaloider i D.calycina förstärker ytterligare förhållandet mellan dessa kemofenetiska markörer i familjen Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Det är värt att nämna att enligt Zidorn [44] definieras kemofenetiska studier som studier som syftar till att beskriva mängden specialiserade sekundära metaboliter i en given taxon, vilket redan observerats i flera publicerade arbeten [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Således bidrar kemofenetiska studier till den fenetiska beskrivningen av taxa, liknande anatomiska, morfologiska och karyologiska tillvägagångssätt, som redan har erkänts som av stor betydelse för etableringen av "naturliga" system, och som fortsätter att vara av extrem betydelse för beskrivning av klassificerade organismer med hjälp av moderna molekylära metoder [44].

2.2. Cytotoxisk analys

Den cytotoxiska aktiviteten in vitro hos de isolerade föreningarna (tabell 2), förutom föreningarna 2, 3, 5 och 8 (på grund av deras låga utbyte), utvärderades motcancercelllinjerna HL-60 (human promyelocytisk leukemi), MCF-7(humant bröstadenokarcinom), HepG2 (humant hepatocellulärt karcinom), HCT116 (humant kolonkarcinom) och icke-cancercellinje MRC{{5} }(human lungfibroblast) med Alamar blue-analysen efter 72 timmars inkubation.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetin (11) visade cytotoxisk aktivitet mot HL-60 och HCT116 med IC50-värden på 15,78 ug·mL-1(33,70 μmol·L-1） och 18,99 ug·mL-1(40,56 umol.L-1) respektive. Blandningen av uvarinol (12) och isouvarinol(13) visade cytotoxisk aktivitet mot HL-60, med ett ICs0-värde på 9,74 ug∶mL-1, och HCT116, med ICs0-värde på 17,31 ug∶mL{ {30}}. Bland de bensylerade dihydroflavonerna visade endast isorhamnetin (10) cytotoxisk aktivitet mot HepG2 med ett IC50-värde på 19,79 ug:mL-1(54,65 umol.L-1). Enligt litteraturen beskrivs bensylerade dihydroflavoner med cytotoxiska egenskaper [39-42]. Bland de som beskrivs i detta arbete beskrivs isorhamnetin (10), dikamanetin (11) och uvarinol (12) inom vitro cytotoxiska egenskaper mot humana tumörcellinjer av karcinom i nasofarynx (KB) och P-388 lymfatisk leukemi (PS) med IC50-värden på 5,3 och 4,1, 4,8 och 1,8 respektive 5,9 och 9,7, ug.mL-1 [39,40]. Dessa olika aktiviteter kan tillskrivas närvaron av en eller flera hydroxibensylgrupper närvarande i molekylerna såväl som den position i vilken dessa grupper är kopplade. Ytterligare utredning behövs dock för att bekräfta denna observation.

Den cytotoxiska aktiviteten in vitro hos de isokinolin-härledda alkaloiderna anonaine (2), liri-adenin (3) och (S)-( plus )-retikulin (4) har nyligen beskrivits av Menezes et al.[2{{16 }}], Souza et al. [6] och Costa et al. [43] med tonvikt på liriodenin, som visade potent cytotoxisk aktivitet mot cancercellinjer B{{10}}F10(musmelanom), HepG2(humant hepatocellulärt karcinom), HL{{13 }} (human promyelocytisk leukemi) och K562 (human kronisk myelocytisk leukemi) med IC5s0-värden under till 10,0 μmol.L-1【43】. Anonaine visade måttlig aktivitet mot B16-F10, HL602, HepG2, HepG2, , och K562 med IC50-värden låga än 19,0 umol.L-1[20]. (S)-(plus )-Reticuline visade endast måttlig aktivitet mot HepG2 med IC50-värden på 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Material och metoder

3.1. Allmänna experimentella förfaranden

Optiska rotationer i metanol (MeOH) registrerades med en P{{0}} polarimeter (Jasco, Tokyo, Japan) vid 589 nm. ID- och 2D-NMR-experiment förvärvades i CDCl. (kloroform-d) eller CDCl plus droppe CD, OD (metanol-du och CD, COCD3(aceton-d6) vid 298 K på en AVANCE I HD NMR-spektrometer (Bruker, Billerica, MA, USA) som arbetar vid 11,75 T (Hand 13C vid 500 respektive 125 MHz) och på en Bruker AVANCE I 600 NMR-spektrometer som arbetar vid 14,1 T('H och13Cat 60{ {63}} respektive 150 MHz). Alla lH- och 13C-NMR kemiska skift （δ） presenteras i ppm i förhållande till tetrametylsilansignalen vid 0.00 ppm som en intern referens, och kopplingskonstanterna (D) anges i Hz. NMR-spektrometern var utrustad med en 5-mm multinukleär invers detektionssond (1D och 2D NMR-experiment) med en z-gradient. Enbindning (HSQC) och två och trebindnings (HMBC)1H-13C-NMR-korrelationsexperiment optimerades för genomsnittlig kopplingskonstant' JcH och LRJ(cH på 140 respektive 8 Hz. För lågupplöst masspektrometri (LC-MS) analys prover av de isolerade föreningarna återsuspenderades i metanol (HPLC-kvalitet), vilket skapade stoc k-lösningar (1 mg·mL-1). Alikvoter (5 uL) av stamlösningarna späddes ytterligare till 5 ug·mL och analyserades genom direkt infusion i en trippel kvadrupol masspektrometer, modell TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA), utrustad med elektrosprayjonisering (ESI) eller kemisk jonisering vid atmosfärstryck (APCI) källor. ESI-MS-förhållanden: sprayspänning, 5kV; mantelgas, 10 godtyckliga enheter (arb); hjälpgas, 5arb;svepgas,0arb;kapillärtemp, 250 grader ; kapillärspänning,40 V;rörlins, 70 V;massomfång, m/z 100 till 1000.APCI-MS-förhållanden: urladdningsström,5 μA; förångarens temperatur, 350 grader; mantelgastryck, 25 godtycklig enhet (arb); jonsvepgastryck,0,0 arb; hjälpgastryck, 10 arb; kapillärtemperatur, 250 grader C; rörlinsförskjutning,70 V; skimmer offset,0 V; massintervall, m/z 100 till 1000. Argon användes som kollisionsgas och MS/MS-spektra erhölls med användning av kollisionsenergier från 25 till 30 eV. Silikagel60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, USA, 70-230 mesh) användes för kolonnkromatografin (CC), medan silikagel 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Tyskland, 0,25 mm, aluminium) användes för analytisk och preparativ med tunnvattenkromatografi (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, glas). Föreningar visualiserades genom exponering under UV254/365-ljus, genom sprayning med p-anisaldehydreagens följt av upphettning på en varm platta och genom sprayning av Dragendorffs reagens.

3.2. Växtmaterial

I denna undersökning samlades det botaniska materialet (barken) av D.calycina in den 27 maj 2017 på Adolpho Ducke-reservatet (geografiska koordinater: 02 grader 53'36.1S och 59 grader 58'28.9"W), Manaus, Amazonas State , Brasilien, och identifierad av Prof. Dr.Antonio Carlos Webber, en växttaxonom vid Institutionen för biologi vid Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM). Ett kupongexemplar nummer 10 810 deponerades på Herbarium of DB/UFAM. åtkomst (exemplar) registrerades i Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) med posten A70EDCD.

3.3. Extraktion och isolering

Barken från D.calycina torkades först vid rumstemperatur i 24 timmar och torkades sedan i en luftcirkulerande ugn i 48 timmar vid en temperatur av 40 grader och pulveriserades därefter i en kvarn med fyra knivar (Marconi, Piracicaba, SP , Brasilien) för att erhålla det pulveriserade materialet (1340 g). Sedan utfördes en uttömmande maceration med hexan (8 × 4 L) följt av MeOH (8 × 4 L). De extraktionslösningar som erhölls koncentrerades i en rotationsindunstare vid reducerat tryck (40-50 grad) för att ge extrakten av hexan (24,85 g) respektive MeOH (199,43 g).

TLC-analys avslöjad med Dragendorffs reagens indikerade en hög närvaro av alkaloider i MeOH-extraktet. Därför utsattes en alikvot av MeOH-extrakt (188,3 0 g) initialt för en syra-basextraktion för att ge alkaloidala (5,46 g) och neutrala (4,47 g) fraktioner. Därefter utsattes en del av den alkaloidala fraktionen (5.0g) för silikagelkromatografikolonn (CC) som tidigare behandlats med en 10 procentig NaHCO3-lösning [12], eluerad med hexan (100 procent), hexan-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 och 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 procent), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, och 10:90,0/u), EtOAc (100 procent ),EtOAc-MeOH(95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 och 10:90, v/o), och slutligen MeOH vilket ger 250 fraktioner (30 ml vardera). Efter TLC-utvärdering med en blandning av CH2Cl2-MeOH i proportionerna 95:05, 90:10, 85:15 och 80:20 som eluentsystem (v/o), slogs liknande prover samman för att ge 16 fraktioner (Fl till F16).

Fraktion F5 (181,2 mg) från initial CC eluerad med hexan-CH,Cl2 (50:50 till 10:90, v/o) utsattes för en ny silikagel C med användning av samma metod som ovan eluerad med hexan (100 procent), hexan -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 och 10:90,v/o), CH,Cl ,(100 procent ), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 och 10:90 ,o/), EtOAc (100 procent), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 och 15:85, /o), och MeOH (100 procent) vilket ger 118 fraktioner ( 15 mL vardera) som slogs samman i 12 subfraktioner (F5.1 till F5.12), enligt TLC-analysutvärdering med användning av en blandning av CH2Cl2-MeOH i proportionerna 95:05 och 90:10. Subfraktion F5 .1 (28,9 mg) eluerad med hexan (100 procent) utsattes för en preparativ TLCeluerad med CH,Cl-MeOH (95:05, v/v, två elueringar) vilket gav 2 (1,4 mg) och 3 (1,7 mg), respektive. Subfraktioner F5.4 (21,5 mg) eluerade med hexan-CH,C(80:20,vo), F5.5 (16,7 mg)eluerade med hexan-CH,Cl(80:20,70:30,60;40. och 50:50 , v/), och F5,6 (15,4 mg) eluerad med hexan-CHCl2 (50:50, 40:60 och 30:70, v/o) slogs samman (53,6 mg) och utsattes även för en preparativ TLC som eluerades med CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, två elueringar) vilket gav 3 (8,9 mg).

Fraktion F6(2099,1 mg) från initial CC eluerad med hexan-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100 procent), och CH,Cl2-EtOAc (90:10 till 10:90, o/o) utsattes för en ny kiselgel CC med användning av samma metod som ovan eluerad med samma lösningsmedelssystem vilket gav 140 fraktioner (30 ml vardera). Efter TLC-utvärdering med en blandning av CH2Cl2-MeOH i proportionerna 95:05, 90:10 och 85:15 som eluentsystem (o/o), slogs liknande prover samman för att ge 13 subfraktioner (F6) .1 till F6.13). Subfraktion F6.6 (1541,3 mg) utsattes för en ny silikagel CC med användning av samma metod som ovan eluerad med samma lösningsmedelssystem vilket gav 120 fraktioner (30 ml vardera) som analyserades med TLC (med användning av samma metod ovan) vilket gav 12 nya subfraktioner (F6.6.1 till F6.6.12). Subfraktion F6.6.2 (17,0 mg) eluerad med hexan-CH,Cl, (60:40 och 50:50, v/v) utsattes för en preparativ TLCeluerad med CH2Cl2-MeOH (90:10, v/o,en eluering) resulterande i 3 (1,4 mg). Subfraktion F6.6.3 (643,3 mg) eluerad med hexan-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 och 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 procent) och CH2Cl2-EtOAc(90:10 och 80:20,o/o) utsattes för en preparativ TLCeluerad med CH2Cl2-MeOH (90) :10, vfo, en eluering) vilket gav en ny subfraktion F6.6.3.1 (161,8 mg) som utsattes för en ny preparativ TLC eluerad med EtOAc-MeOH (90:10, v/o, en eluering) vilket gav 4(148,2) mg). Subfraktion F6.6.4 (90,2 mg) eluerad med CH2Cl2-EtOAc (70:30 och 60:40,o/o) utsattes för en preparativ TLCeluerad med CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, en eluering) vilket gav 1 (1,4 mg) respektive 4 (50,1 mg). Subfraktion F6.6.5 (83,4 mg) eluerad med CH,Cl-EtOAc (60:40 och 50:50, o/o) utsattes också för en preparativ TLCeluerad med CH,Cl2-MeOH (90:10, ufo, en eluering) vilket igen gav 1 (1,5 mg) respektive 4 (45,5 mg). Subfraktion F6.6.6 (101,4 mg) eluerad med CH,Cl2-EtOAc (50:50 och 40:60, v/)) utsattes för en preparativ TLC eluerad med CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, en eluering) som gav 8(3,4 mg) och annan subfraktion F6.6.6.1 (48.8 mg). Denna subfraktion (F6.6.6.1) utsattes för en preparativ TLCeluerad initialt med EtOAc-MeOH (85) :15, vo, en eluering) och efteråt CHCl-MeOH (90:10, v/v, en eluering) vilket återigen resulterade i 4 (37,4 mg). För detta förfarande eluerades den kromatografiska plattan initialt med den mobila fasen EtOAc-MeOH (85:15, v/o, en eluering). Efter denna eluering torkades den kromatografiska plattan för att avlägsna lösningsmedlet och utsattes därefter för en ny eluering med den mobila fasen CH,Cl,-MeOH(90:10,vf,en eluering) vilket gav 4.Subfraktion F6.6.7 ( 109,0 mg) eluerad med CH,Cl2-EtOAc(40:60,30:70,20:80 och 10:90,vfo) utsattes för en preparativ TLC eluerad med CH,Cl2-MeOH (90:10,vo, en eluering) vilket gav en annan subfraktion F6.6.7.1 (24,8 mg) som utsattes för en ny preparativ TLC eluerad initialt med EtOAc-MeOH (85:15, v/o, en eluering) och posteriort CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, en eluering) resulterande i 9 (11,1 mg). Isoleringsproceduren som användes för 9 var densamma som tidigare beskrivits för 4. Subfraktion F6.6.10 (92,0 mg) eluerad med EtOAc-MeOH (60:40 och 50:50, v/o) utsattes för en preparativ TLCeluerad med CH, Cl,-MeOH (90:10, v/o, en eluering) vilket gav 5 (1,7 mg) respektive 6 (7,8 mg). Subfraktion F6.6.11 (326,0 mg) eluerad med EtOAc-MeOH (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 och 10:90, v/o) utsattes för en preparativ TLC eluerad med CHCl- MeOH (90:10, v/o, en eluering) med 1 (2,4 mg) respektive 7 (12,5 mg).

Fraktion F7 (692,4 mg) från initial CCeluerad med EtOAc (100 procent) och CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15 och 75:25,ofo) utsattes för en ny silikagel CAnvänder samma metod som beskrivits för initial CC med samma lösningsmedelssystem som ger 110 fraktioner (30 ml vardera). Efter TLC-utvärdering med en blandning av CH2Cl2-MeOH i proportionerna 95:05, 90:10 och 85 :15 som eluentsystem (o/o), slogs liknande prover samman för att ge 12 subfraktioner (F7.1 till F7.12). F7.8 (147.4 mg) eluerades med CH,Cl 2- EtOAc (50:50, 40:60 och 30:70, v/o procent) utsattes för en preparativ TLC eluerad med CHCl-MeOH (95:05, vfo, en eluering) vilket gav 10 (5,4 mg) och 11( 120,6 mg). F7.9 (144,2 mg) eluerad med CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 och 10:90, v/o procent) utsattes också för en preparativ TLCeluerad med CH,Cl,-MeOH( 95:05,vo, en eluering) vilket gav 11 (91,2 mg) och en blandning av 12 respektive 13 (39,4 mg).

Thalifolin (1): Brunt amorft pulver;' H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen [32]; LR-ESI(plus )-MS [M plus H]* plus m/z 208.

Anonaine (2): Brunt amorft pulver; 1H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen [33]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 266.

Liriodenin (3): Gula kristaller (CH,Cl-MeOH 3:1);1H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen [10,34]; LR-ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 276.

(S)-( plus )-Reticuline(4): Brunt amorft pulver; []p25 plus 71,60(c 0,05 g/100 ml, MeOH); 1H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen [27;LR-ESI(plus )-MS [M plus H] plus m/z 30.

3,4-dihydro-7-hydroxi-6-metoxi-1-isokinolinyl)(3-hydroxi-4-metoxifenyl)-metanon (dehydro-oxonorretikulin)(5 ): Brunt amorft pulver; 'H- och 13C-NMR-data, se tabell 1; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.

( plus ){{0}}S,2R-Reticuline N-oxid(6): Brunt amorft pulver; [lp25 plus 136,4 (c0,146 g/100 ml, MeOH); 1Hand 13C-NMR-data, se tabell 1; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/2346

( plus ){{0}}S,2S-Reticuline N.-oxid (7): Brunt amorft pulver; []p25 plus 394,5 (c 0,03 g/100 ml, MeOH);'H och 13C-NMR-data, se tabell 1; LR-APCI(plus)-MS [M plus H] plus m/z346.

Coreximin (8): Ljusgult amorft pulver;[]p25 plus 201,1(c 0,08g/100mL, MeOH)'H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen[34,35]; LR- ESI(plus)-MS [M plus H] plus m/z 328.

Bisnorargemonin (9): Brunt amorft pulver; 1H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen [36]; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.

Isochamanetin (10):Ljusgult amorft pulver; [p25-12.4(c 0,5 g/100 ml, MeOH)'H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetin (11):Gult amorft pulver;[]D25-10.7(c 0.5g/100 ml, MeOH);1H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

En blandning av uvarinol(12) och isouvarinol(13): Gult amorft pulver; H-NMR och 13C-NMR i enlighet med litteraturen [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z 573.

3.4. In vitro cytotoxisk analys

3.4.1.Celler

HL-60 (human promyelocytisk leukemi), MCF-7 (humant bröstadenokarcinom), HepG2 (humant hepatocellulärt karcinom), HCT116 (humant kolonkarcinom) och MRC-5 (humant lungfibroblast) cellinjer erhölls från American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) och odlades enligt rekommendationerna av ATCCs guide för djurcellsodling. Alla cellinjer testades för mykoplasma med användning av ett mykoplasmafärgningskit (Sigma-Aldrich) för att validera användningen av celler fria från kontaminering.

3.4.2. Cytotoxicitetsanalys

För cytotoxicitetsanalys kvantifierades cellviabiliteten med Alamar blue-metoden, som tidigare beskrivits [{{0}}]. För alla experiment ströks celler i 96-brunnsplattor. Kemiska beståndsdelar löstes i dimetylsulfoxid (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brasilien) och sattes till varje brunn och inkuberades i 72 timmar. Doxorubicin (doxorubicinhydroklorid, renhet större än eller lika med 95 procent, Laboratory IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) användes som en positiv kontroll. Vid slutet av behandlingen, 20 μL av en stamlösning (0,312 mg/ml) resazurin (Sigma-Aldrich Co.) tillsattes till varje brunn. Absorbanser vid 570 nm och 600 nm mättes med en SpectraMax190 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) Halvhämmande koncentration (IC50) erhölls genom ickelinjär regression med 95 procents konfidensintervall (CI95 procent) med programvaran GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, USA).

4. Sammanfattningar

Den fytokemiska undersökningen av barken av D.calycina ledde till isoleringen och identifieringen av tretton föreningar (1-13); nio isokinolin-härledda alkaloider (1-9) och fyraflavonoider(10-13). Alkaloiderna tillhör följande underklasser: enkel isokinolin, thali online(1);aporfin, anonain (2); oxoaporfin, liriodenin (3); bensyl-tetrahydroisokinoliner, (plus )-retikulin(4), dehydro-oxonorretikulin(3,4-dihydro-7-hydroxi-6-metoxi-1-isokinolinyl)({{13} }hydroxi-4-metoxifenyl)-metanon)(5), 1S,2R-retikulin-Ng-oxid(6) och 1S,2S-retikulin-N.-oxid (7); tetrahydroprotoberberin, coreximin (8); och pavin, bisnorargemonine(9). Medan flavonoiderna tillhör de bensylerade dihydroflavonerna, är isorhamnetin (10), dikamanetin (11) och en blandning av uvarinol (12) och isouvarinol (13). De isolerade föreningarna beskrivs för första gången i D.calycina såväl som i släktet Diclinanona.

Den cytotoxiska aktiviteten hos de isolerade föreningarna (förutom anonain, liriodenin, 1,2-dihydro-oxonorretikulin och coreximin) utvärderades mot cancer (HL-60, MCF-7, HepG2 och HCT116) och icke-cancerösa (MRC-5)cellinjer. Bland dem observerades de mest lovande resultaten för bensylerade dihydroflavoner dikamanetin (10), och

blandningen av uvarinol(12) och isouvarinol (13) som visade måttlig cytotoxisk aktivitet mot de testade cancercellinjerna （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetin (11) visade cytotoxisk aktivitet mot HL-60 och HCT116 med IC50-värden på 15,78 ug·mL-1 (33,70 μmol-L-1) och 18,99 ug·mL-I (40,56 ug·mL-I（40,56). .L-1) respektive medan blandningen av uvarinol (12) och isouvarinol (13) visade cytotoxisk aktivitet mot HL-60, med IC50-värde på 9,74 ug∶mL-I, och HCT116, med IC50 värde på 17,31 ug·mL-1. Dessa resultat på tumörcellinjerna beskrivs också för första gången för de bensylerade dihydroflavonerna. De cytotoxiska aktiviteterna av retikulin, anonain och liriodenin har tidigare etablerats, där liriodenin är den mest potenta föreningen.

Resultaten som erhållits i detta arbete indikerar att arterna i familjen Annonaceae är en lovande källa till biologiskt aktiva föreningar med cytotoxiska egenskaper, och föreslår en fortsättning av deras undersökning i andra modeller av biologiska analyser.

Referenser

1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Tidig evolutionär historia av blomväxtfamiljen Annonaceae: Stadig diversifiering och boreotropisk geodispersal. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brasilien, 1984.

3. Leboeuf, M.; Cave, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. Annonaceaens fytokemi. Phytochemistry 1982, 21, 2783-2813. [CrossRef]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Annonaceous acetogenins: En recension. J. Nat. Driva. 1990, 53, 237-278. [CrossRef]

5. Lúcio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Alkaloids of the Annonaceae: Förekomst och en sammanställning av deras biologiska aktiviteter. I Alkaloiderna; Knolker, H.-J., Ed.; Elsevier: Amsterdam, Nederländerna, 2015; Kapitel 5; Volym 74, s. 233–409. [CrossRef]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Chaar, JS; Koolen, HHF; et al. Asaron-härledda fenylpropanoider och isokinolin-härledda alkaloider från barken av Duguetia pycnastera (Annonaceae) och deras cytotoxicitet. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]

7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Isokinolin-härledda alkaloider från barken av Guatteria olivacea (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Happi, GM; Mbiantcha, M.; Tatuedom, OK; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Naturprodukter från medicinalväxten Duguetia staudtii (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]

9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kassuya, CAL; Cardoso, CAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Antioxidant, antireumatisk och antiinflammatorisk undersökning av extrakt och dicentrinon från Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Krok. f. J. Etnopharmacol. 2018, 211, 9–16. [CrossRef]

10. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, RH; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Trypanocidal aktivitet av oxoaporfin och pyrimidin- -karbolinealkaloider från grenarna av Annona foetida Mart. (Annonaceae). Molecules 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]

11. Silva, DB; Tulli, ECO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM De antitumorala, trypanocidala och antileishmaniala aktiviteterna av extrakt och alkaloider isolerade från Duguetia furacea. Fytomedicin 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; et al. En pyrimidin- -karbolin och andra alkaloider från Annona foetida med antileishmanial aktivitet. J. Nat. Driva. 2006, 69, 292–294. [CrossRef]