Bioövervakning av mykotoxiner i plasma hos patienter med Alzheimers och Parkinsons sjukdomⅡ

2. Resultat och diskussion

2.1. LC-MS/MS-analys

På grund av deras olika fysikalisk-kemiska egenskaper, delades mykotoxiner upp för kromatografisk separation i två grupper (se avsnittet material och metoder). Följande figurer (figur 1–4) visar överlagrade extraherade kromatogram av mykotoxiner i kalibratorer och ett plasmaprov (kodifierat som prov 1–4), före och efter enzymatisk behandling. Som kan ses uppträder OTA i prover före och efter enzymatisk behandling (Figur 1; Figur 3); medan STER uppträder först efter enzymatisk behandling (Figur 3). Inga av de andra mykotoxinerna som analyserats har påvisats i plasmaproverna.

Var och en av kalibreringskurvorna som användes vid mykotoxinkvantifiering uppfyllde de kriterier som tidigare definierats under metodvalideringen. Exempel på de erhållna kalibreringskurvorna för varje mykotoxin presenteras i tabellerna S1 och S2. Föreningarnas identitet har också bedömts: kvalifikations- (q) och kvantifierings- (Q) övergångar för varje upptäckt mykotoxin observerades i var och en av individerna och positiva prover, och det erhållna relativa felet (RE) mellan q/Q-kvotvärden för varje mykotoxin i kalibratorer och i prover var mindre än 20 procent [32]. Dessutom skilde retentionstiderna inte i prover och kalibratorer med mer än 2,5 procent [33] (1,3 procent för OTA före och 1,6 procent efter enzymatisk behandling; 0,3 procent för OTB och 1,8 procent för STER).

2.2. Plasmaprover

Totalt 93 försökspersoner, inklusive 25 friska kontroller (CNT) och 68 patienter, rekryterades från den neurologiska tjänsten vid San Pedro-sjukhuset i La Rioja (Spanien). Kontrolldonatorer var obesläktade följeslagare till patienterna utan några uppenbara eller diagnostiserade neurologiska sjukdomar. Patienterna delades in efter patologier: 44 patienter med PD och 24 med AD.

Klicka för att cistanche tubulosa kapslar för Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom

Diagnosen och sjukdomsprogressionen för de rekryterade patienterna utfördes av expertneurologer enligt Hoehn och Yahr (HY) skalan för PD (tabell S3) och Global Deterioration Scale (GDS) för AD (tabell S4). Alla AD-patienter visade redan kliniska tecken på mild kognitiv försämring eller demens (från 3 till 7, GDS-skala). PD-patienterna delades in i två grupper eftersom sjukdomsprogressionen var olika bland patienter med individer som inte visade några försämrade posturala reflexer (1 och 2, HY-skala) och andra som redan uppvisade försämrade posturala reflexer (från 2,5 till 3, HY-skala).

På grund av det låga antalet prover utfördes den statistiska analysen av PD-patienterna som en enda grupp. Antalet inskrivna försökspersoner för varje grupp och undergrupp redovisas, tillsammans med kön, åldersintervall och sjukdomsförlopp, i tabell 1. Fullständig individuell information om de försökspersoner som rekryterats till studien ges i tilläggsmaterialet (tabellerna S5 och S6).

2.3. Förekomst av mykotoxiner

Av de 19 utvärderade mykotoxinerna upptäcktes endast OTA, OTB och STER i proverna. OTA var närvarande före och efter behandlingen med blandningen av glukuronidas/arylsulfatas, medan OTB endast var detekterbar före och STER uppträdde först efter den enzymatiska behandlingen. Det bör noteras att på grund av den begränsade volymen av vissa prover var utvärderingen efter enzymatisk behandling endast möjlig för 74 av de 93 insamlade proverna.

De analytiska resultaten som erhållits för OTA, OTB och STER sammanfattas i tabell 2. På grund av bekräftelsen av identifieringskriterier (q- och Q-övergångar bör finnas och jämföras med kalibratorerna RE för båda, q/Q-förhållande och retentionstid, vilket bör vara < 20 procent respektive 2,5 procent), har prover med värden större än eller lika med LOD använts för datahanteringsanalys. Därför utfördes beräkningarna med en lägre bunden substitutionsmetod [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>LOD) i proverna som bearbetades före den enzymatiska behandlingen. När det gäller förekomsten av OTA, hittades prover under LOD i alla grupper. Den maximala nivån av OTA (8,81 ng/ml) motsvarade en 66-årig kvinna i kontrollgruppen. När det gäller kontrollpopulationen fanns OTA och OTB i 92 procent respektive 24 procent av proverna.

Dessa resultat överensstämmer med en nyligen genomförd studie i Navarra, en angränsande region i Spanien. I den studien fanns OTA i 97,3 procent och OTB i 10 procent av proverna (n=438) [35] mätt med samma metod som den som tillämpades i den aktuella studien [36]. I den aktuella studien är medelhalten av OTA (2,15 ng/ml) något under de som uppmätts i Navarra (2,87 ng/ml). OTA-nivåerna varierade från LOD till 8,81 ng/mL, medan OTA-koncentrationen i proverna från Navarra varierade mellan LOD och 19,9 ng/ml (med ett prov som nådde 45,7 ng/ml hos en 66-årig kvinna).

När det gäller kön, och även i överensstämmelse med Navarra-studien [35], kunde det observeras att medelvärden för OTA före enzymatisk behandling tenderade att vara högre hos män än hos kvinnor i alla grupper. Även om andelen OTA-positiva prover stämmer överens med tidigare studier utförda i Spanien, är medel- och maximala OTA-nivåer i CNT-populationen i den aktuella studien och den nyligen genomförda Navarra-studien [35] högre än de i tidigare studier från Spanien .

Eftersom denna information erhölls före 2011 stöder våra data behovet av att fortsätta bioövervakning av mykotoxinnivåer i den allmänna befolkningen. Som tidigare observerats [35] var OTB närvarande i ett fåtal prover och förekom alltid samtidigt med OTA (förutom en CNT-man). Överraskande nog upptäcktes inte OTB i AD-gruppen. OTB är den deklorerade analogen av OTA och har inte mätts i de humana bioövervakningsstudier som hittills genomförts.

OTB kan förekomma i mänskliga prover eftersom det är känt att det finns i vissa matriser, såsom vin [37], men kan också vara en mänsklig metabolit av OTA [38]. Tyvärr är det i den aktuella studien omöjligt att skilja mellan möjliga källor till OTB eller att veta om frånvaron av OTB i AD-gruppen kan bero på ett annat konsumtionsmönster hos patienterna eller på en annan metabolism på grund av sjukdom, eller om det beror på det låga antalet analyserade prover. Analysen av data efter den enzymatiska behandlingen avslöjade att OTA fortfarande detekterades (89 procent av proverna).

Dessutom, som tidigare observerats hos de friska donatorerna av Navarra [35], förekom STER i majoriteten av proverna (88 procent), medan OTB inte längre upptäcktes. När man jämförde förekomsten av OTA före och efter den enzymatiska behandlingen var andelen positiva prover före enzymatisk behandling i CNT högre än hos patienter; Efter enzymatisk behandling minskade förekomsten av OTA för CNT medan den ökade hos AD- och PD-patienter. Vissa författare stöder hypotesen att OTA-konjugat kan bildas under mänsklig metabolism [39-41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>LOD) i 88 procent av de analyserade proverna. Dessa data stöder hypotesen att STER-glukuronider bildas under mänsklig metabolism [35,42].

2.4. Statistisk analys

Enligt analysresultaten utfördes de statistiska beräkningarna endast för OTA och STER. OTB ingick inte i den statistiska analysen eftersom endast 12 prover (13 procent) var större än eller lika med LOD. Hypotesen om normalitetsfördelning (Shapiro–Wilk-test) förkastades, sålunda användes icke-parametriska tester, som inte innebär något distributionsantagande, för den statistiska behandlingen. STER detekterades först efter enzymatisk behandling, därför utfördes den statistiska analysen för STER på de 74 tillgängliga resultaten erhållna efter enzymatisk nedbrytning. Å andra sidan, för OTA fanns två datauppsättningar med resultat tillgängliga, den som erhöll bearbetningsdata före den enzymatiska behandlingen och den som erhölls efter enzymatisk behandling (dvs. OTA före och efter).

På grund av ofullständigheten i OTA efter datamängden (74 poster), beslutades det att utföra statistiska beräkningar med endast hänsyn till OTA före datasetet (93 poster). För att bekräfta beslutet att utesluta OTA efter datamängden genomfördes ett Wilcoxon matchade par signerade rang-test för att utforska möjliga skillnader mellan parade resultat av OTA före och efter datamängder.

Testet visade inte någon signifikant skillnad när det tillämpades på OTAbefore- och OTAafter-värden för den totala befolkningsgruppen (n=74, z=−1,438, p-värde=0.1503), vilket bekräftar att hela OTAbefore-datauppsättningen passar de statistiska utvärderingarna. Som tidigare nämnts finns inga tidigare studier som övervakar mykotoxiner i plasmaprover från PD- eller AD-patienter tillgängliga. Därför, för att fånga alla möjliga skillnader och associationer av OTA- och STER-koncentrationsnivåer mellan grupper och undergrupper, kördes Wilcoxon rank-summetest eller Kruskal-Wallis-test för multivariabel jämförelse.

Dessutom undersöktes möjliga skillnader med statistisk signifikans genom att dela upp grupper efter kön och sjukdom (patienter med PD och AD), även med hänsyn till sjukdomsstadiet (HY- eller GDS-skala). En sammanfattning av alla skillnader, som var statistiskt signifikanta (p-värde < 0.050) vid jämförelse av OTA- eller STER-fördelningar mellan grupper, mellan CNT och patientgrupp (som helhet och som PD- och AD-grupp), mellan kön och bland grupper i varje kön och könsvariabel, visas i tabell 3.

Skillnaderna mellan distributionsnivåer av OTA visade sig vara statistiskt signifikanta när man jämförde CNT-gruppen, PD och AD, men denna skillnad (p-värde=0.0447) styrs av jämförelsen PD/AD (p- värde=0.0114), vilket är PD patientgruppen som kännetecknas av högre värden. När man övervägde sjukdomsstadiet och jämförde distributioner av PD-undergrupp 1 och PD-undergrupp 2, observerades ingen skillnad, vilket tyder på att sjukdomsstadiet i PD-gruppen inte påverkar en skillnad i fördelningen. I könsjämförelsen gav mäns och kvinnors jämförda OTA-nivåer statistiska skillnader antingen i alla försökspersoner eller i patientgruppen (PD plus AD), med män som alltid visade högre nivåer än kvinnor.

Därför är fördelningarna av OTA inte olika jämfört med CNT och patientgrupper, men det verkar som att kön kan fungera som en drivkraft för skillnaderna i OTA-nivåfördelningar mer än diagnossjukdomen. Dessutom, vid testning av skillnaderna mellan OTA-fördelningar för män och kvinnor separat, bland grupperna (CNT, PD, AD) visade testet ingen skillnad.

Den statistiska analysen av STER-nivåer mellan CNT- och patientgruppen visade fördelningar statistiskt olika (p-värde < 0.0001), med CNT-värden lägre. CNT/PD/AD-gruppen visade statistiskt olika fördelningar (p-värde=0.0001) och skillnaden bekräftades också genom att jämföra CNT/PD och CNT/AD (p-värde < 0,0001 i båda fallen), med en median lägre värde i AD-gruppen.

Därför var fördelningen av CNT-gruppen alltid annorlunda i STER-nivåer i jämförelser med patienter och sjukdomsgrupper. Medan man jämförde könsfördelningar mellan män och kvinnor, framhävdes alla statistiska skillnader, STER-nivåer i individuella grupper för män och kvinnor var olika i alla jämförelser (CNT/PD/AD, CNT/patientgrupp, CNT/PD, CNT/AD), och män och kvinnor i CNT-gruppen var alltid lägre än i patientgrupper.

Detta tyder på att diagnosen sjukdom kan påverka STER-nivåfördelningarna. Skillnader mellan koncentrationsnivåer av OTA och STER undersöktes också genom att jämföra de två patientgruppernas (PD och AD) fördelningar i varje kön (hos män och kvinnor) och jämföra sjukdomsskalan, GDS i AD-patientgruppen och HY-skalan i AD-patientgruppen, och ingen statistisk skillnad ökade. Varken OTA- eller STER-distribution visade någon skillnad genom att även jämföra HY-skalan som den binära variabeln HY_d=0 (PD Sub-grupp 1, HY-skalan i intervallet 1–2) och HY{{6 }}d=1 (PD-undergrupp 2, HY-skalan i intervallet 2,5–3).

När man jämför OTA- och STER-distributionsbeteende, konstateras det att OTA-skillnader finns inom könet (med M > W) och inom patientgrupperna (PD > AD), och en markant statistisk skillnad kom fram i alla jämförelser. När det gäller STER registreras skillnader i fördelningarna för att jämföra CNT och patientgruppen (patientgrupp > CNT), och alla bedömningar testade alltid en statistisk skillnad. Å andra sidan betonade de två undersökta mykotoxinerna ingen skillnad genom utforskning inom patienternas undergrupper och/eller sjukdomsstadiet.

Så vitt vi vet finns inga andra studier tillgängliga för att jämföra mykotoxinnivåer hos patienter med neurodegenerativa sjukdomar. Vissa författare har dock föreslagit behovet av att ytterligare utvärdera rollen av mykotoxiner i försämringen av de kliniska manifestationerna av autismspektrumstörningar [43,44].

Faktum är att författarna lyfte fram statistiskt signifikanta skillnader som jämförde mykotoxiner (DON, DOM-1 i urin och AFM1, OTA och FB1 i plasma) mellan autistiska och kontrollgrupper av barn. Resultaten av denna studie är också i linje med en nyare studie av vår grupp [45], där OTA-incidens och plasmakoncentrationer visade sig vara högre hos kontrollgruppsbarn än hos barn med autismspektrum eller hyperaktivitetsstörningar med uppmärksamhetsbrist.

När det gäller påverkan av sex, och enligt resultaten från denna studie, i de flesta av de publicerade studierna, var plasma OTA-nivåer för män högre än hos kvinnor [46]; även om Warensjö et al. (2020) hos svenska ungdomar [47], och Coronel et al. (2011) [48] hittade inga skillnader i OTA-plasmanivåer mellan män och kvinnor. Slutligen, för att bedöma sambandet mellan OTA- och STER-nivåer i plasma och åldersvariabeln, beräknades Spearmans rangkorrelationskoefficient (rho).

Alla rho med statistisk signifikans (p-värden < 0.050) är sammanfattade i tabell 4. Generellt fann man svaga negativa och positiva korrelationer: OTA och STER korrelerar svagt med åldern. I synnerhet minskar OTA-nivåerna med åldern (negativa korrelationer, rho < 0), och rho-värdet ökar när PD-gruppen eller mansgruppen väljs; dessutom är rho-värdet ännu högre när värdena för män i PD-gruppen väljs. Omvänt är STER-korrelationer positiva och är statistiskt signifikanta när kvinnogruppen väljs.

För att representera de observerade korrelationerna rapporteras spridningsdiagrammen OTA/män i PD-patientens grupp och STER/kvinnor i alla försökspersoner i figur 5. De visar spridningsdiagrammet med två variabler för toxiner och ålder, och den anpassade linjen hjälper till att visualisera korrelationen.

Mekanismen för Cistanches behandling av Parkinsons sjukdom och Alzheimers sjukdom

Cistanche är en traditionell kinesisk ört som har använts i många år för sina potentiella hälsofördelar. I nyare studier har det visat sig att Cistanche kan ha neuroprotektiva effekter och kan vara effektivt vid behandling av Alzheimers sjukdom (AD) och Parkinsons sjukdom (PD).

Mekanismen för Cistanche vid effektiv behandling av AD och PD tillskrivs dess aktiva komponenter, såsom echinakosid, acteosid och cistanosider. Dessa föreningar tros ha antioxiderande och antiinflammatoriska egenskaper som kan minska oxidativ stress och inflammation i hjärnan, som är förknippade med utveckling och progression av neurodegenerativa sjukdomar.

Cistanche kan också främja tillväxten av nervceller och förbättra kognitiv funktion genom att öka nivåerna av hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF), ett protein som spelar en avgörande roll i tillväxten och underhållet av neuroner. Dessutom har Cistanche visat sig minska -amyloidplack, som är kännetecknande för Alzheimers sjukdom, och minska ackumuleringen av -synuklein i hjärnan, som är associerad med Parkinsons sjukdom.

Sammantaget är de potentiella terapeutiska fördelarna med Cistanche vid behandling av AD och PD lovande, men ytterligare studier behövs för att klargöra dess exakta verkningsmekanismer och bekräfta dess effektivitet och säkerhet i kliniska sammanhang.

fortsättning följer...

Beatriz Arce-López 1 , Lydia Alvarez-Erviti 2 , Barbara De Santis 3 , María Izco 2 , Silvia López-Calvo 4 , Maria Eugenia Marzo-Sola 4 , Francesca Debegnach 3 , Elena Lizarraga 1 , Adela López 5, 6 Elena González-Peñas 1,† och Ariane Vettorazzi 5,6,* ,†

1 Institutionen för farmaceutisk teknologi och kemi, forskningsgruppen MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, ​​Spanien; barce@alumni.unav.es (BA-L.); elizarraga@unav.es (EL); mgpenas@unav.es (EG-P.)

2 Laboratory of Molecular Neurobiology, Centrum för biomedicinsk forskning i La Rioja (CIBIR), Piqueras 98, 3:e våningen, 26006 Logroño, Spanien; laerviti@riojasalud.es (LA-E.); mizco@riojasalud.es (MI)

3 Nationellt referenslaboratorium för mykotoxiner och växtgifter, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Roma, Italien; barbara.desantis@iss.it (BDS); francesca.debegnach@iss.it (FD)

4 Servicio de Neurología, Hospital San Pedro, Piqueras 98, 26006 Logroño, Spanien; slcalvo@riojasalud.es (SL-C.); memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain