Chaperone-medierad autofagi vid neurodegenerativa sjukdomar och akuta neurologiska förolämpningar i centrala nervsystemet del 2

4. Experimentella forskningsverktyg för att analysera CMA-aktivitet

I det här avsnittet beskriver vi de experimentella forskningsverktygen som är tillgängliga för analys av CMA-aktivitet in vitro och in vivo. De metoder som vanligtvis används för att erhålla information korrelerade med CMA-aktivitet såväl som CMA-funktionella analyser.

CMA (Certified Management Accountant) är en professionell management accountant certifiering, som syftar till att certifiera personer som har tillräckliga operativa färdigheter och yrkeskunskaper inom området management accounting. Minne, en mänsklig hjärnans förmåga, hänvisar till förmågan att komma ihåg information, kunskap eller erfarenhet.

Det finns ett visst samband mellan CMA och minne. Först och främst kräver CMA-provet att kandidaterna kommer ihåg ett stort antal kunskapspoäng och begrepp, och samtidigt kräver kandidaterna att de behärskar färdigheterna för att tillämpa dessa kunskapspoäng. Därför kommer utmärkt minne att spela en mycket viktig roll för att uppnå goda resultat i CMA-provet.

För det andra kan minnet förbättras genom inlärning och övning, vilket också hjälper till att studera till CMA-provet. Till exempel, genom att upprepade gånger granska kunskapspoäng, lära sig och memorera information på olika sätt, och använda minnestekniker, kan du förbättra minnet och hjälpa kandidaterna att bättre bemästra de kunskapspoäng och färdigheter som krävs för CMA-provet.

Slutligen, att studera CMA är inte bara ett prov, utan också en förbättring av professionell kvalitet. Inom karriärutveckling, om du vill utöva din professionella förmåga bättre, behöver du naturligtvis en viss minnesförmåga för att hjälpa dig själv att bättre slutföra dina arbetsuppgifter.

Kort sagt, det finns ett nära samband mellan CMA och minne. Att försöka förbättra ditt minne hjälper dig inte bara att få bra betyg utan hjälper dig också att slutföra dina arbetsuppgifter bättre och förverkliga ditt personliga värde och karriärprestationer när din karriär utvecklas. Det kan ses att vi behöver förbättra vårt minne, och Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt eftersom det har antioxiderande, antiinflammatoriska och anti-aging effekter, vilket kan bidra till att minska oxidation och inflammation i hjärnan och därigenom skydda hälsan hos nervsystemet. Dessutom kan Cistanche deserticola också främja tillväxt och reparation av nervceller, och därigenom förbättra anslutningen och funktionen hos det neurala nätverket. Dessa effekter kan bidra till att förbättra minnet, inlärningsförmågan och tankehastigheten, och kan också förhindra uppkomsten av kognitiv dysfunktion och neurodegenerativa sjukdomar.

Klicka på Know för att öka minnesstyrkan

4.1. Användbara analyser för att övervaka CMA-aktivitet

Att utvärdera förändringar i mängderna av de huvudsakliga molekylära komponenterna i CMA kan användas som ett indirekt sätt att bedöma CMA-aktivitet [46]. Dessutom kan antalet och distributionen av CMA-aktiva lysosomer analyseras för att härleda förändringar i CMA-aktivitet [46].

Dessa analyser ger dock endast data som är korrelerade med CMA-status. Därför bör dessa analyser kompletteras med funktionella analyser [47]. Immunoblotting och bildbehandling för att utvärdera förändringar i de viktigaste CMA-komponenterna är de mest använda metoderna för att bedöma CMA-aktivitet.

Eftersom lysosomnivåerna av LAMP2A är begränsade för CMA [48], korrelerar förändringar i förekomsten av LAMP2Aprotein i lysosomer vanligtvis med aktiviteten av CMA. Därför, i bildutvärderingar, bör närvaron av LAMP2A vid det lysosomala membranet analyseras [47].

Immunblotting för LAMP2A med lysosomberikade fraktioner eller åtminstone en membrancellsfraktion är mer informativ än den som använder totala helcellslysat [46]. Nivåer av lysosomal-hsc70 är också relaterade till CMA-aktivitet [49].

Men hsc70 är en av de vanligaste cellulära chaperonerna, och fraktionen som finns i lysosomer är en liten mängd. Därför är immunblotting för hsc70 i totala cellulära lysat inte informativt för CMA [46]. Kolokalisering av hsc70 med lysosomala markörer (t.ex. LAMP1) kan användas för att detektera CMA-aktiva lysosomer [49].

Antalet av dessa lysosomer colokaliserade medhsc70 i proportion till hela lysosompoolen ökar när CMA aktiveras [12]. Dessutom kan en elektronmikroskopisk analys med immunogoldfärgning för hsc70 också ge information om poolen av CMA-aktiva lysosomer [49].

I analyser med isolerade lysosomer från celler eller vävnader kan ökade nivåer av välkända CMA-substrat (t.ex. GAPDH) indikera en minskad aktivitet av CMA [46].

Generellt bryts CMA-substrat snabbt ned efter translokation [6]. Således möjliggör en jämförelse av de lysosomala nivåerna av CMA-substrat i celler eller djur mellan modeller behandlade eller obehandlade med hämmare av lysosomala proteaser (dvs. leupeptin) för mätning av flödet i CMA-värden [24].

4.2. Funktionella analyser

Flera funktionella analyser möjliggör spårning av CMA-aktivitet över tid i celler, vävnader och isolerade organeller.

4.2.1. Bedömning av intracellulär proteinnedbrytning

Cirka 30% av totala cytosoliska proteiner kan brytas ned av CMA [9]. Men den faktiska andelen av det cytosoliska proteinet som bryts ned av CMA varierar beroende på celltyp och cellulära förhållanden [6].

Därför är mätning av poolen av cellulära proteiner som genomgår nedbrytning genom CMA en vanlig metod för att bestämma den totala aktiviteten hos CMA-vägen [46].

Puls- och jaktexperiment med användning av en radiomärkt aminosyra och hämmare av antingen lysosomala proteaser eller andra autofagiska vägar kan användas för att skilja proteiner som genomgår CMA-nedbrytning från de som hanteras av andra vägar [50].

4.2.2. Photoconvertible CMA Reporters

Dessutom skulle en metod för att övervaka den lysosomala associationen av artificiella fluorescerande CMA-reportrar också vara användbar för att spåra substratleverans och nedbrytning genom CMA [51].

Med hjälp av fotokonverterbara fluorescerande reportrar [51] är det möjligt att spåra associationen av det fotokonverterade proteinet med lysosomer i en annan fluorescenskanal. En ökning av antalet fluorescerande puncta per cell skulle vara en bra indikator på CMA-aktivering [46].

4.2.3. In vitro-analyser av CMA med hjälp av isolerade lysosomer

Överhörningen mellan olika autofagiska vägar gör det svårt att noggrant bedöma CMA-aktivitet i intakta celler [41]. Därför måste vi separat analysera alla funktionella steg som är involverade i den dynamiska nedbrytningsprocessen av CMA-vägar [46,49].

Den mest pålitliga metoden för att analysera CMA-aktivitet erhålls genom in vitro-rekonstitution av CMA med isolerade lysosomer [52]. Isolering av den specifika fraktionen av lysosomer som är aktiva i CMA möjliggör en analys av innehållet av endogena CMA-substrat i CMA-avdelningarna [47].

Isolerade lysosomer tillåter också rekonstitutionen av CMA in vitro för att följa stegen som är involverade i CMA-processens substratbindning, lysosomalt upptag och lysosomal nedbrytning [50].

Behandling med lysosomala proteashämmare följt av inkubation med CMA-substratet kommer att möjliggöra mätning av substratbundet och translokerat till lysosomer (bindning och upptag) [39].

Genom att diskontera mängden substrat bundet till lysosomesin som proteolys inte har förhindrats, skulle det då vara möjligt att beräkna upptaget [39,53].

De isolerade lysosomala fraktionerna möjliggör också direkt jämförelse av förändringar i innehållet, posttranslationell modifiering och organisation av CMA-komponenter vid det lysosomala membranet. Minskning av lysosomala LAMP2A- eller lys-hsc70-nivåer i isolerade lysosomer tyder på minskad CMA-aktivitet [54,55], medan ökningar i LAMP2Alevels tyder på uppreglering av CMA-aktivitet [56].

Dessutom kan förhållandet mellan lysosomalt LAMP2A sammansatt till ett multimert komplex vid en given tidpunkt bestämmas med hjälp av blånativ elektrofores av isolerade lysosomer och immunoblot för LAMP-2A [57].

5. Neurodegenerativa sjukdomar och CMA

Neuroner är postmitotiska celler och kräver effektiva maskiner för proteinnedbrytning för att upprätthålla cellulär homeostas under stressförhållanden [58,59]. Försämring av proteinnedbrytningsprocessen i CNS orsakar aggregering av avvikande eller skadade proteiner, vilket är en distinkt egenskap hos många neurodegenerativa sjukdomar.

Betydande bevis har samlats på att dysfunktion av CMA är associerad med olika patologier i olika neurodegenerativa sjukdomar som påverkar CNS [1,14].

I dessa sjukdomar har olika patogena proteiner identifierats som substrat för CMA, såsom -synuklein i PD [60], Tauprotein i AD [61], huntingtin (Htt) i HD [62,63] och TDP{{5} } i ALS och FTLD [64,65].

5.1. Parkinsons sjukdom

PD är en av de vanligaste neurodegenerativa sjukdomarna. De huvudsakliga patologiska egenskaperna hos PD är den gradvisa förlusten av dopaminerga neuroner inom substantia nigra och aggregation av proteinet -synuklein i Lewy-kroppar.

Många studier har visat att försämring av CMA är relaterad till den huvudsakliga patogenesen av PD [4,66]. Hos patienter med PD minskar nivån av LAMP2A-protein i hjärnan, vilket indikerar att CMA-aktiviteten är försvagad [67,68].

Många tidigare studier har föreslagit att hämning av CMA-nedbrytningsvägen orsakar ackumulering av -synuklein, vilket är associerat med den gradvisa förlusten av dopaminerga neuroner [8].

Viktigt är att mutantformerna A53T och A30P av -synuklein identifierade i familjär PD inte kan brytas ned av CMA. Dessutom binder dessa mutantformer tätt till LAMP2A vid det lysosomala membranet och hämmar följaktligen den normala nedbrytningen av andra CMA-substrat in vitro [60,69]. G2019S-mutation i leucinrikt repeterande kinas 2-protein (LRRK2) kan vara en patologisk orsak till familjär PD [70].

G2019S-mutanten hämmar den dynamiska sammansättningen av CMA-translokationskomplexet vid det lysosomala membranet, vilket orsakar dysfunktion av CMA i en musmodell av PD och hjärnorna hos mutanta LRRK2 PD-patienter [25]. Dessutom binder de patogena mutanta former av LRRK2 till cytosolisk Hsc70 och interagerar onormalt med CMA-komponenter, vilket blockerar nedbrytningen av andra CMA-substrat och neuronal proteinhomeostas in vitro [25,71].

Ubiquitin C-terminal hydrolas L1 (UCH-L1) interagerar fysiskt med LAMP-2A,Hsc70 och Hsp90 och är involverad i den reglerande mekanismen för CMA-vägen [72]. I en tidigare studie, I93M-mutantformen av UCH-L1 identifierades i en enda PD-familj [73].

Det har också rapporterats att I93M-mutationen i UCH-L1 onormalt förbättrade interaktionen med den cytosoliska regionen av LAMP2A, vilket hämmar CMA-vägen in vitro [74]. Dessutom inducerade uttrycket av I93M-mutantformen av UCH-L1-däggdjursceller den CMA-hämningsassocierade ökningen av mängden synuklein [74].

Dessa fynd tyder på att avvikande interaktion av I93M-mutantformen av UCH-L1 med CMA-maskineri kan ligga bakom patogenesen av PD associerad med aggregeringen av -synuklein. Parkinsons sjukdom protein 7 (PARK7), även känd som DJ-1, är en multifunktionellt protein involverat i en mängd olika cellulära aktiviteter, inklusive oxidationsresistens [75].

PARK7/DJ-1har en viktig roll för att upprätthålla mitokondriell homeostas [75]. Det har rapporterats att en mutation i DJ-1-genen förmedlar autosomal recessiv och tidiga former av PD [76]. DJ-1-brist påskyndade nedbrytningen av LAMP2A i lysosomer, vilket ledde till aggregering av -synuklein [77 ].

Däremot kunde DJ-1 hämma ackumuleringen av -synuklein genom att reglera CMA [78]. Sammantaget anses olika molekylära mekanismer som orsakar dysfunktion av CMA ligga till grund för patogenesen av PD.

De patologiska mekanismerna förknippade med CMA förblir dock i stort sett oklara. Ytterligare forskning kommer att behövas för att klargöra sambandet mellan CMA-processen och de faktiska patologierna vid PD.

5.2. Alzheimers sjukdom

AD är den vanligaste neurodegenerativa sjukdomen hos äldre. Den huvudsakliga patogenesen av AD är amyloidplackbildning och Tau-aggregation orsakad av försämring av proteinhomeostas. Flera proteiner relaterade till AD har identifierats som CMA-substrat. CMA-nedbrytningen av dessa proteinsubstrat visade sig vara försämrad hos patienter med AD [45,61,79].

Den progressiva ackumuleringen av amyloidoligomerer är en centraltoxisk händelse i AD [80,81]. En nyligen genomförd studie visade att märkning av amyloidoligomerer med flera KFERQ-motiv främjade deras inträde i endosomer och lysosomer, vilket skyddade mänskliga primärodlade kortikala neuroner från neurotoxicitet [82]. Amyloidprekursorprotein (APP) är en viktig patogen molekyl i AD eftersom det kan bearbetas för att producera amyloid- [83].

APP innehåller ett KFERQ-liknande motiv vid dess Cterminus. Detta motiv är viktigt för normal bearbetning och nedbrytning av APP för att förhindra ackumulering av APP-C-terminala fragment [84]. En nyligen genomförd studie visade att APP är ett CMA-substrat som binder till Hsc70 [85].

Hämningen av CMA-nedbrytning av APP ökar dess cytotoxicitet. Dessutom reducerade aktivering av CMA av Hsc70-överuttryckare Metformin de ackumulerade amyloidplacknivåerna i hjärnan och vände de molekylära och beteendemässiga AD-fenotyperna i en musmodell av AD [85]. Tau är ett cytosoliskt protein som normalt stabiliserar mikrotubuli i neuronala celler.

Tauprotein har CMA-inriktade motiv och kan brytas ned av CMA-vägen [79]. Aggregering av mutanta Tau-proteiner som resulterar i Tau-hyperfosforylering och bildandet av neurofibrillära trassel är ett kännetecken för AD och relaterade tauopatier [86,87].

Dessutom kan themutant Tau-proteiner interagera onormalt med LAMP2A och hämma translokation till lysosomlumen, vilket försämrar CMA-aktivitet [79]. Regulatorn för calcineurin 1 (RCAN1) är ett substrat för CMA [45] och är förhöjd hos patienter med AD [88].

RCAN1 är en hämmare av kalcineurinberoende defosforylering av Tau-proteiner. Viktigt är att CMA-aktivitet kan hämmas genom att öka nivån av RCAN1, och därigenom försämra nedbrytningen av andra substrat av CMA [45].

5.3. Huntingtons sjukdom

HD är en sent debuterande neurodegenerativ störning som kännetecknas av okontrollerade rörelser, demens och känslomässiga störningar. HD är en dominant ärftlig sjukdom som orsakas av ackumulering och aggregering av mutant Htt-protein i striatala och kortikala neuroner.

Htt innehåller en onormalt expanderad N-terminal polyglutamin (polyQ)-kanal [62,63,89]. Dysfunktion av Htt-nedbrytning föreslås vara den huvudsakliga patogenesen av HD.

Tidigare studier har visat att CMA är involverad i nedbrytningen av mutant Htt i cellulära och musmodeller av HD [62]. Htt har ett förmodat KFERQ-motiv och interagerar med nyckelkomponenterna i CMA, Hsc70 och LAMP2A. Dessutom visar mutant Htt med en expansion av polyQ-kanalen ett försämrat upptag av CMA in vitro [89].

Inte bara CMA utan makroautofagi är involverad i nedbrytningen av Htt [90]. Htt kan binda till både LAMP2A och det makroautofagirelaterade proteinet Atg7 i nedbrytningsprocessen [89,91,92].

CMA-aktivitet är enligt uppgift uppreglerad i cellulära och djurmodeller av HD i det inledande skedet av sjukdomen. Men aktiviteten av CMA minskar under det sena stadiet av sjukdomen [91]. Dessa fynd tyder på att den tidiga ökningen av CMA-aktivitet kan vara en kompenserande reglering som svar på ineffektiviteten av makroautofagi. Nedgången i nivån av lysosomalt LAMP2A indikerar att det finns en förlust av CMA-funktion i den sena fasen av HD [91].

5.4. Amyotrofisk lateralskleros och frontotemporal lobar degeneration

ALS och FTLD är neurodegenerativa sjukdomar med många liknande kliniska och patologiska egenskaper [93]. Transaktiveringssvar DNA-bindande protein 43 kDa (TDP-43) är ett ribonukleärt protein som reglerar många aspekter av RNA-metabolism.

Ackumuleringen av TDP-43 C-terminala fragment i neuronala celler detekteras ofta hos patienter med ALS och FTLD [65]. TDP-43-ackumulering anses därför allmänt vara ett kännetecken för dessa sjukdomar.

TDP-43-protein innehåller ett KFERQ-liknande motiv som binder till Hsc70 och kan brytas ned av CMA-processen [94,95]. Hsc70-uttryck minskade enligt uppgift i lymfomonocyter hos sporadiska ALS-patienter och bidrog till TDP-43-ackumulering [64].

En mutation i det KFERQ-liknande motivet i TDP-43 kan störa dess nedbrytning via CMA, vilket inducerar ackumulering av TDP-43 och inhibering av CMA i odlade celler [94]. CMA kan hjälpa till att kontrollera omsättningen av de fysiologiska och patologiska formerna av TDP-43 [94].

For more information:1950477648nn@gmail.com