Kapitel 2: Krϋppel-liknande faktor 15 undertrycker renal glomerulär mesangial cellproliferation via förbättrad P53 SUMO1-konjugering

För mer information. Kontakttina.xiang@wecistanche.com

3. RESULTAT

3.1|Screening av KLF15-bindande gener genom ChIP-Seq i primära renala glomerulära MC:er

För att identifiera de direkta bindande partnergenerna för KLF15 utförde vi ChlP-Seq-analys och screenade slutligen 2478 gener. GO-analys av dessa gener genom verktyget på webbplatsen www.uniprot.org (Figur 1A, B) avslöjade termer för molekylär funktion associerade med 1941-gener, cellkomponenttermer relaterade till 1662-gener och biologiska processtermer relaterade till 1766-gener. Eftersom vårt mål var att ta reda på hur KLF15 påverkar MC, fokuserade vi på cellprocessrelaterade gener. Bland de 1315 cellprocessrelaterade generna befanns 74 gener delta i cellcykelprocesser; specifikt deltog dessa gener i den mitotiska cellcykeln, cellcykelns fasövergång och andra processer (Figur 1C, D). Dessutom analyserade vi generna som var involverade i tillväxt och fann att de var relaterade till utvecklingstillväxt, celltillväxt och andra typer av tillväxt (Figur 1E).

3.2|Screening av differentiellt reglerade gener i KLF15-överuttryckande renala glomerulära MC:er med hjälp av SILAC och LC/MS

SILAC och LC/MS-analys av HRMC:er som överuttrycker KLF15 jämfört med föräldraceller ledde till identifieringen av 1357 proteiner. Vi använde DAVID och IPA för att förvärva GO-domänerna och berikade vägar för de kvantifierade proteinerna som identifierats av SILAC. Intressant nog var många proteiners biologiska funktionsrelaterade termer bland de topp 30 signifikant berikade GO-termerna, inklusive regleringen av den cellulära aminosyrametaboliska processen, proteasomkomplex, proteinbindning och transkriptions- och translationstermer, som alla är nära besläktade med ubiquitination (Figur 2A). Figur 2B visar topp 30 signifikant berikade vägtermer. Flera biologiska processtermer, inklusive termerna proteasom och neurodegenerativ sjukdom, var också relaterade till ubiquitination.

Klicka för att veta omcistanchetill salu med detaljer

3.3|Bioinformatisk analys av KLF15-bindande gener som potentiellt är associerade med renal glomerulär MC-proliferation

Att utforska de KLF15-bindande gener som potentiellt är associerade medrenal glomerulärMC-proliferation utförde vi en bioinformatisk analys av ChIP-Seq-data och SILAC-LC/MS-data. Femtiotvå gener screenades (tabell 2 och figur 2C), och fem av dessa gener, inklusive SUMO1, makrofagmigrationshämmande faktor (MIF), eukaryot initieringsfaktor (EIF), insulinliknande tillväxtfaktor (IGF) och retikulokalbin (RCN) ), var nära besläktade medcellproliferation. Eftersom GO- och väganalyserna av de differentiellt uttryckta proteinerna antydde att de screenade generna huvudsakligen var relaterade till ubiquitinationsprocessen, drog vi slutsatsen att SUMO1, en medlem av den ubiquitin-liknande (UBL) proteinfamiljen, deltar i posttranslationell modifiering liknande ubiquitination som målgenen för KLF15.

Ökande mängder bevis har visat att HG är en av de viktigaste faktorerna som inducerar utvecklingen av diabetisk nefropati, och det främjar MC-proliferation och ökad matrissyntes in vitro.25En tidigare studie har visat att PDGF-BB är avgörande för MC-proliferation som föregår utvecklingen. av glomeruloskleros vid experimentell glomerulonefrit.26 Efter att ha bekräftat att MC stimulerades av HG eller PDGF-BB in vitro, upptäckte vi förändringar i uttrycket av KLF15 och SUMO1 vid både RNA och protein

nivåer och fann att dessa molekyler hade liknande trender (Figur 2D-l). Slutligen bestämde vi att SUMO1 var målgenen för KLF15.

3.4|KLF15 uppreglerar SUMO-1-genexpression genom att binda till en 16 bp CACCCA-SUMO-1-promotorregion och ett C plus A-rikt motiv

Vi använde MEME-sviten (http://meme-suite.org/tools/meme) för att karakterisera KLF15-bindningsmotiven för de 52 screenade generna från KLF15 ChlP-Seq-data och identifierade det KLF-bindande motivet (Figur 3A). Dessutom analyserade vi ytterligare mer än tusen baser uppströms om SUMO1-promotom och fann att KLF15 kunde känna igen och binda till en 16 bp sekvens (nukleotider -205~-199) inklusive - CACCCA-(Figur 3B).ChIP-PCR bekräftade att KLF15 är bundet till SUMO1-promotorn, och resultaten visade signifikant högre uttryck av SUMO1 i anti-KLF15-antikroppsgruppen än i bakgrundskontrollgruppen (Figur 3C).

Dessutom utförde vi en dubbelluciferasreporteranalys för att bekräfta inriktningsförhållandet mellan SUMO1 och KLF15. Vildtyp SUMO1-promotorgruppen visade högre luciferasaktivitet än pGL3-vektorn och mutantgrupperna i HRMC:er, och aktiviteten ökade signifikant genom överuttryck av KLF15. Förbättringarna i luciferasaktivitet vändes genom transfektion med en plasmid som uttrycker den muterade promotorregionen (Figur 3D). Sammantaget tyder dessa data på att SUMO1 är ett direkt transkriptionsmål för KLF15.

3.5 |Screening av P53 som SUMOyleringssubstrat för SUMO1

SUMO-modifieringar är allmänt uttryckta post-translationella modifieringar i eukaryoter. Reversibel konjugering av dessa modifieringar till substratproteiner är också känd som SUMOylation, som spelar en viktig roll för att reglera målproteinernas funktioner och vidare deltar i olika biologiska processer, såsom nukleocytoplasmatisk transport, transkriptionell reglering, apoptos, proteinstabilisering, stressrespons och cellcykelprogression.27 För att utforska nedströms signalmolekyler direkt konjugerade av SUMO1, utförde vi en nätverksanalys av SUMO1 med hjälp av IPA-databasen, och data visade att SUMO1 direkt kunde konjugera till P53, APP, JUN och AKT, bland annat proteiner (Figur 4A-C). Vi valde initialt P53 som en nedströms molekyl av SUMO1 eftersom det är ett välkänt protein som är nära besläktat med cellproliferation.28.29 Dessutom använde vi SUMOsp-mjukvara för att förutsäga möjliga SUMOyleringssekvenser för P53invariiousspecies och fann att P53 hade SUMOyleringssekvensen（ Figur 4D). För att avgöra om P53 verkligen modifieras av SUMOylering, transfekterade vi HRMC:er övergående med en SUMO1-överuttrycksplasmid eller SUMO1-siRNA. Både IP- och Western blot-resultaten avslöjade trender i uttrycksförändringar av SUMO1-P53 och P53 som överensstämde med förändringarna i SUMO1 (Figur 4E-J). Dessa data indikerar att P53 är ett SUMOyleringssubstrat av SUMO1.

3.6 |KLF15 hämmar MC-proliferation genom att främja SUMO1-uttryck och P53 SUMOylering

För att fastställa regleringen av P53 SUMOylation och MC-proliferation av KLF15 och SUMO1, ingrep vi med KLF15 eller SUMO1 uttryck i HRMCs och behandlade HRMCs med PDGF-BB. Bland PDGF-BB-behandlade HRMC:er uppvisade celler transfekterade med KLF15-överexpressionsplasmiden högre uttryck av SUMO1-P53, P53, KLF15 och SUMO1 än celler transfekterade med KLF15-kontrollplasmiden. Samma förändringar i SUMO1-P53, P53 och SUMO1 hittades i SUMO1-överuttrycksplasmidtransfekterade celler, medan KLF15-uttryck var oförändrat i dessa celler (Figur 5A-F). PDGF-BB är en av de mest effektiva tillväxtfaktorerna för MC som beskrivits hittills, och proliferativ respons från HRMC på PDGF-BB observerades. Som visas i figur 5G, H, ökades procentandelen av EdU-positiva celler signifikant genom administrering av rekombinant PDGF-BB. EdU-färgningsresultaten indikerade att både KLF15 och SUMO1 överuttryck hämmade PDGF-BB-inducerad cellproliferation (Figur 5G, H).

För att få ytterligare insikt i rollerna för KLF15 och SUMO1 i prolifererande HRMC, transfekterade vi celler med endast SUMO1 siRNA eller samtransfekterade dem med SUMO1 siRNA och en KLF15 överuttrycksplasmid. Nedreglering av SUMO1 påverkade inte uttrycket av KLF15, men uttrycksnivåerna för SUMO1-P53 och P53 minskade uppenbarligen efter SUMO1 siRNA-transfektion (Figur 6A-C). Dessutom, när uttrycket av SUMO1 hämmades, undertrycktes SUMO1-P53- och P53-uttrycksnivåerna även i celler som överuttrycker KLF15 (Figur 6D-F). Därefter utvärderades MC-proliferation med användning av en EdU-färgningsanalys. SUMO1 RNAi förstärkte den proliferativa effekten av PDGF-BBon HRMCs, och gruppen samtransfekterade med KLF15 överexpressionsplasmiden och SUMO1 siRNA hade fler EdU-positiva celler än gruppen samtransfekterade med överexpressionsplasmiden och hybridsekvenskontroll siRNA (Figur 6G, H) . Vi drar därför slutsatsen att KLF15 undertrycker MC-proliferation genom att förbättra P53 SUMOylation.

3.7|Globalt SUMO1- och P53-uttryck i glomerulära MC är negativt korrelerat med MC-proliferation i Thy-1-nefrit från råtta

Anti-Thy1 nefrit är en klassisk modell av självbegränsad mesangial proliferativ glomerulonefrit med en proliferativ fas och en återhämtningsfas. Vi injicerade en Thy1-antikropp i Wistar-råttor för att skapa denna modell. Både serumureakväve och kreatinin har ingen signifikant förändring mellan kontrollråttor och modellråttorna (Figur S1). Markerad mesangial proliferation och ECM-ackumulering observerades under den proliferativa fasen (dagarna 5 och 7) hos modellråttorna, och antalet MC minskade under återhämtningsfasen på dag 10 (Figur 7A). Vi upptäckte också uttrycksförändringarna i cellproliferationsmarkören PCNA av IHC (Figur 7A, B). PCNA-nivåer ökade på dag 5, toppade på dag 7 och minskade på dag 10 (Figur 7F). Western blot-analys visade att proteinuttrycket av P53, SUMO1 och KLF15 i isolerade glomeruli var lägre i modellgrupperna än i kontrollgruppen (Figur 7C, D), i överensstämmelse med de immunhistokemiska resultaten (Figur 7E, F). Dessa resultat indikerar att den onormala proliferationen av MCs i anti-Thy1-modellråttor är relaterad till lågnivåuttrycket av KLF15 och SUMO1. Att interferera med uttrycket av dessa molekyler förväntas lindra den patologiska fenotypen hos råttor.

4. DISKUSSION

Deglomeruliär filtreringsenheterna förnjure. Störning av glomerulär funktion kan orsakas av primär glomerulär patologi eller kan vara sekundär till systemiska sjukdomar. Mesangiala förändringar sågs efter glomerulär skada inklusive hyperproliferation av MC följt av överdriven produktion av ECM (mesangial expansion) och produktion av kemoattraherande medel för inflammatoriska celler. Därför är modulering av MC-svar, särskilt onormal proliferation, ett nytt terapeutiskt tillvägagångssätt. KLF15 är ett protein som spelar en reglerande roll som transkriptionsfaktor genom att binda till specifika DNA-sekvenser. Många studier har rapporterat att KLF15 är involverat i regleringen av cellproliferation. Till exempel har det visat sig att KLF15 deltar i hämningen av MC-proliferationsrelaterade signalvägar,15,30 men dess direkta målgen har inte rapporterats i litteraturen. Därför involverade denna studie huvudsakligen gemensam screening av transkriptions- och translationsnivåer för att identifiera den direkta målgenen för KLF15.

KLF15 reglerar olika gener i olika arter och i olika vävnader och organ. I processen att reglera proliferationen av MC påverkar KLF15 uttrycket av flera gener och deltar i flera vägar.131,32 För att utforska de direkta målgenerna för KLF15 använde vi ChIP-Seg.Klein RH och hans kollegor använde ChlP-seq. teknologi för att studera regleringen av KLF7 på differentieringen av hornhinneepitelceller.33 Ying M et al använde denna teknik för att studera den hämmande effekten av KLF9 på pluripotensen av glioblastom.34Jämfört med ChlP-chip, möjliggör ChIP-Seq sann helgenomanalys med högre upplösning, högre detektionskänslighet och lägre efterfrågan på provstorlek.35 Vi använde ChP för att erhålla DNA-fragmenten direkt bundna av KLF15, och efter jämförelse och analys med GenBank screenade vi 2478 möjliga målgener. Genom GO- och väganalyser identifierade vi många målgener involverade i cellcykeln och proliferationsprocesser.

ChlP-Seq-experiment kräver PCR för amplifiering av detektionssignalen, och en viss grad av förspänning under amplifieringsprocessen är oundviklig. Dessutom erhåller ChIP-Seq endast de gener som KLF15 kan binda och indikerar inte de förändringar som sker i uttrycket av dessa gener när uttrycket av KLF15 förändras. Vi använde SILAC-LC/MS proteomikanalys för att kompensera för dessa brister. Denna teknik ger information om alla proteiner vars uttryck förändras vid reglering av KLF15, inklusive de proteiner som direkt regleras av KLF15 och de proteiner som är indirekt reglerade eller posttranslationellt modifierade. HRMCs odlades med användning av SILAC och KLF15 överuttrycktes i cellerna genom plasmidtransfektion. Proteinerna samlades in för LC/MS-detektion och 1357 differentiellt uttryckta proteiner erhölls. GO- och väganalyser visade att några av de differentiellt uttryckta proteinerna var involverade i ubiquitination. Gen- och proteindata korsades. De gener som inte var relaterade till forskningsändamålet och gener som inte direkt reglerades av KLF15 togs bort; slutligen screenades 52 gener. Bland dessa valdes de fem gener med de mest uppenbara uttrycksskillnaderna som var närmast relaterade till proliferation. Med tanke på de kombinerade resultaten av väganalys, SUMO1 och KLF15 expressionsanalys i prolifererande HRMCs, ChlP-PCR och dubbelluciferasreporteranalyser, valdes proteinet SUMO1 ut som målgenen för KLF15.

Förutom ubiquitin, identifieras ett ökande antal UBLproteiner, 3637 inklusive SUMO,38 neurala prekursorcelluttryckta, utvecklingsmässigt nedreglerade 8(NEDD8)3940 och interferonstimulerade gen 15(ISG15),41. Dessa modifierande proteiner reglerar kraftfullt en mängd olika biologiska processer. Den kovalenta additionen av SUMO till substrat, kallad SUMOylation, är en post-translationell modifiering involverad i en serie cellulära processer, inklusive nukleär-cytosolisk transport, transkriptionell reglering, apoptos, proteinstabilitetskontroll, stressresponser och cellcykelprogression.27SUMO är typiskt sett fäst till acceptorlysinrester av proteinsubstrat som har en konsensussekvens och bidrar till regleringen av protein-proteininteraktioner såväl som till subcellulär kompartmentalisering och proteinstabilitet.2 sUMO1, som en medlem av SUMOS-familjen, kan påverka cellproliferation genom att modifiera substrat och stabilisering av cellcykelreglerande proteiner.43 Därför fokuserade vi, i kombination med litteraturrapporten och de omfattande screenings- och analysresultaten, på hur KLF15 reglerar effekten av SUMO1 på mesangial cellproliferation.

För att identifiera substraten för SUMO1 utförde vi en nätverksanalys av SUMO1 med hjälp av IPA-databasen och SUMOsp-programvaran. I kombination med publicerad forskning om P53 föreslog våra initiala screeningsdata P53 som en nedströmsmolekyl av SUMO1 med SUMOyleringssekvensen YKxD/E. Tidigare studier har visat att P53 var ett substrat för SUMOylation,45 och förbättrad P53 SUMO1-konjugering främjade stabiliteten och aktiviteten av P53 och inducerade se-nescens.46 I vår studie gav interferens med uttrycket av SUMO1 i HRMC:er samma förändringstrender i SUMO1-P53 och P53, vilket indikerar att P53 var ett SUMOyleringssubstrat för SUMO1.

Nya bevis har visat att SUMOylering och de-SUMOylering spelar roller i många nefropatiska sjukdomar, såsom njurdysgenes, njurkarcinom, glomerulär sjukdom, podocytapoptos och njurmärghypertonicitet, akut njurskada och nefrolithiasis.{1} förhållandet mellan KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation och MC-proliferation, utförde vi en serie transfektionsbehandlingar på celler som hade genomgått PDGF-BB-inducerad proliferation. Överuttryck av KLF15 uppreglerade uttrycket av SUMO1, medan överuttryck av SUMO1 inte påverkade uttrycket av KLF15. Antingen KLF15 eller SUMO1 överuttryck ökade SUMOyleringen av P53 och antagoniserade cellproliferationen inducerad av PDGF-BB. När uttrycket av SUMO1 hämmades, hämmades SUMOyleringen av P53 också, och KLF15 förlorade sin antagonistiska effekt på cellproliferation. In vivo. spridningen av MC ökade gradvis med förvärring av mesangial proliferativ nefrit, medan uttrycket av KLF15, SUMO1 och P53 minskade signifikant. Med tanke på de integrerade observationerna i celler och vävnader drar vi preliminärt slutsatsen att KLF15 reglerar SUMOyleringen av P53 genom SUMO1, och därigenom hämmar MC-proliferation.

5. SLUTSATSER

Vissa studier har visat att KLF15 spelar en viktig roll för att reglera spridningen av MC. I detta arbete undersökte vi mekanismerna för MC-proliferationsundertryckande medierad av denna transkriptionsfaktor. Vi identifierade SUMO1 som det primära målet för KLF15 i MCs via bioinformatikanalyser som involverade ChIP-Seq och SILAC-LC/MS. Dessutom, med hjälp av IPA-databasen och SUMOsp-mjukvaran, bestämde vi att P53 var ett direkt substrat för SUMO1. In vitro- och in vivo-experiment bekräftade att KLF15 kunde främja uttrycket av SUMO1 och SUMOyleringen av P53 och sedan hämma proliferationen av MCs (Figur S2). Dessa resultat bidrar till förståelsen av KLF15:s reglerande roll i MC-proliferation och ger en teoretisk grund för att hitta nya behandlingar för MC-proliferationsrelaterade njursjukdomar.