Karakteristisk HPLC–MS-profil av Cistanche Deserticola Formula Granulat
Oct 13, 2025
Författare: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Anknytning: Shanghai Institute for Food and Drug Control; NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, Kina
Abstrakt
En karakteristisk kromatografisk profileringsmetod för Cistanche deserticola-formelgranulat etablerades baserat på HPLC-MS. Med användning av autentiserade Cistanche deserticola-avkoksbitar och en echinakosid-referenssubstans som referenser extraherades tio satser av prover direkt med 50 % metanol och analyserades med HPLC. Separation utfördes på en Phenomenex Luna C18-kolonn (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) med en gradient av acetonitril-0,1 % myrsyra vid 1,0 ml/min, 30 grader och UV-detektion vid 330 nm. Ett referenskarakteristiskt kromatogram med nio vanliga toppar konstruerades, bland vilka fem toppar identifierades med LC/Q-TOF-MS. De tio satserna visade likhet Större än eller lika med 0,981. Precisions-, stabilitets- och repeterbarhetsmått för den karakteristiska profilen var tillfredsställande. Metoden är enkel, identifierar effektivt Cistanche deserticola-formelgranulat och kan användas för kvalitetsutvärdering.
Nyckelord: Cistanche deserticola; formelgranulat; karakteristiskt kromatogram; echinakosid; verbaskosid (akteosid); HPLC; LC–Q‑TOF‑MS; cistanche fördelar; bästa cistanche till salu
Introduktion av Cistanche
Cistanche (Rou Cong Rong)är en välkänd tonic traditionell kinesisk medicin (TCM) med njurförstärkande, essens-närande och laxerande effekter. Det spelades först in i Shennongs Classic of Materia Medica och listades som ett läkemedel av överlägsen kvalitet. 2020-utgåvan av Folkrepubliken Kinas farmakopé (del I) definierar de autentiska källorna som de torkade, fjällande, köttiga stjälkarna från Cistanche deserticola YC Ma eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, med bearbetningsmetoder inklusive råprodukten och vinprodukten. Viktiga kemiska komponenter inkluderar fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner och sockerarter, som underbygger farmakologiska aktiviteter såsom neuroprotection, anti-aging, hepatoprotection och laxation; kliniska tillämpningsmöjligheter är breda. Bland dessa är PhGs de mest aktiva beståndsdelarna.
Cistanche deserticola formula granulat är enkelörtsgranuler framställda av bearbetad C. deserticola med modern tillverkningsteknik för användning i kliniska recept. Det finns för närvarande ingen nationell standard för deras kvalitetskontroll. Tidigare studier rapporterade innehållsbestämningsmetoder eller fingeravtryck för C. tubulosa formelgranulat, men ingen litteratur om karakteristiska kromatogram specifikt för C. deserticola formelgranulat. I denna studie samlades tio satser in för att för första gången fastställa en HPLC-karakteristisk profil för C. deserticola formelgranulat, med fem toppar identifierade av LC–MS. Denna profil ger en effektiv och vetenskaplig grund för rigorös kvalitetskontroll av C. deserticola formelgranulat.
Experimentell av cistanche
1.1 Instrument och reagens
Agilent 1100 HPLC med UV–Vis-detektor och ChemStation (Agilent, USA)
Agilent 1290 Infinity HPLC och Agilent 6530 Q-TOF MS med ESI-källa (Agilent, USA)
Sartorius elektronisk våg (Sartorius Scientific Instruments, Peking, Kina)
Elmasonic P ultraljudsrengörare (Elma, Tyskland)
Referensdekoktbitar av Cistanche deserticola och referensämnen av echinakosid och verbaskosid (akteosid) köptes från National Institutes for Food and Drug Control (batchnummer. 121101-201603, 111670-201907-201907-11120191). Cistanosid A, tubulosid A och isoverbascosid erhölls från Shanghai Tauto Biotech (satsnummer . 21040621, 20061231, 21040824). Acetonitril (HPLC-kvalitet) kom från Merck; andra reagens var analytisk kvalitet (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Tio satser av C. deserticola formelgranulat (PFKL1–PFKL10), tre satser av C. deserticola avkoksbitar (YP1–YP3) och tre satser av C. deserticola standarddekokter (BZTJ1–BZTJ3) levererades av Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Ltd.
1.2 Beredning av lösningar
1.2.1 Referenslösningar
Referensörtlösning: Väg upp 1 g autentiserade C. deserticola-avkoksbitar i en konisk kolv med propp, tillsätt 25 ml 50 % metanol, sonikera (250 W, 35 kHz) i 30 minuter, kyl, blanda och centrifugera. Använd supernatanten som referensörtlösning.
Referenssubstanslösning: Bered echinakosid med 0,2 mg/ml i 50 % metanol.
1.2.2 Testlösning
Mal provet; väg upp ca 1 g noggrant i en 100 ml bärnstensfärgad mätkolv. Tillsätt 50 ml 50 % metanol, propp, skaka, väg, blötlägg i 30 minuter och sonikera i 40 minuter (250 W, 35 kHz). Låt svalna, väg om och kompensera den förlorade vikten med 50 % metanol. Blanda, stå, filtrera och samla upp det efterföljande filtratet för analys.
1.3 Instrumentella förhållanden
Kromatografiska förhållanden: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fas A: acetonitril; mobil fas B: 0,1% myrsyra i vatten; gradienteluering: 0–5 min, 12 % A; 5–15 min, 12 %→20 % A; 15–30 min, 20 %→30 % A. Flödeshastighet 1,0 ml/min; detektionsvåglängd 330 nm; kolonntemperatur 30 grader; injektionsvolym 10 μL. De teoretiska plattorna, beräknade på echinacoside-toppen, bör vara större än eller lika med 5000.
Obs: Den ursprungliga texten listar "15–30 min, 20%→30% A" två gånger; detta tolkas som ett enda steg.
Masspektrometriska förhållanden: ESI i positivt jonläge; skanningsområde m/z 50–1200. Källinställningar: nebulisator (N2) 35 psi; torkgas (N2) 15 L/min vid 200 grader; mantelgas (N2) 12 L/min vid 350 grader; kapillär 3,5 kV; fragmentator 125 V; MS/MS kollisionsenergier (CID) vid 10, 20 och 40 eV.
Resultat och diskussion
2.1 Provförbehandling och detektionsvåglängd
Extraktionslösningsmedel (metanol, 75 % metanol, 50 % metanol, 25 % metanol), extraktionssätt (ultraljudbehandling, återflöde) och tider (10, 20, 40, 60 min) jämfördes. Den optimala förbehandlingen var 50 % metanol med 40 min ultraljudsbehandling. Eftersom PhGs i C. deserticola visar maximal UV-absorption vid 330 nm valdes 330 nm ut för detektion.
2.2 Val av kromatografiska förhållanden
2.2.1 Kolumner
Zorbax SB‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100‑5-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) och Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) med tillräcklig separeringsförmåga och uppfyllt system; relativa retentionstider (RRT) för de karakteristiska topparna var inom ±10 % av specificerade värden. Laboratorier kan välja bland dessa.
2.2.2 Mobil fas
Metanol–0,1 % myrsyra gav dålig separation för de flesta toppar utom echinakosid; därför användes acetonitril-0,1 % myrsyra och optimerades till gradienten i avsnitt 1.3, vilket gav optimal upplösning, plattnummer och en stabil baslinje. Eftersom inga ytterligare toppar eluerades efter 30 minuter, påbörjades återutjämning vid den initiala sammansättningen.
2.3 Precision, repeterbarhet och stabilitet
Med användning av batch PFKL1 injicerades testlösningen framställd enligt avsnitt 1.2.2 sex gånger under avsnitt 1.3-förhållanden. RSD för RRT och relativa toppareor för de nio karakteristiska topparna var alla<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.
2.4 Fastställande av det karakteristiska kromatogrammet och tekniska parametrar
2.4.1 Referenskarakteristiskt kromatogram
Tio satser av C. deserticola-formelgranulat visade konsekvent nio karakteristiska toppar som i retentionstid motsvarade nio toppar i referensörtlösningen (figur 1–2). Fem toppar tilldelades av standarder som echinakosid, cistanosid A, tubulosid A, verbaskosid (akteosid) och isoverbaskosid. Echinakosidtoppen bidrog med en stor och stabil andel av den totala topparean och valdes som referensämne. Det kromatografiska beteendet över tio satser var väsentligen konsekvent.
A.Blanklösning;B.Echinacoside;C.Testlösning;D.Cistanchedeserticola;E.Referenskarakteristiskt kromatogram.
Specifikationslista för Cistanche Tubulosa
2.4.2 Toppidentifiering
Testlösningar (avsnitt 1.2.2) analyserades med LC–MS i både positiva och negativa ESI-lägen; det positiva läget gav rikare toppinformation och användes (Figur 3). Nio föreningar identifierades totalt; fem bekräftades genom exakt massa, retentionstid och MS/MS-fragment med användning av standarder (tabell 1). Med tanke på att PhG är de huvudsakliga aktiva substanserna i C. deserticola och att formelgranulerna framställs genom vattenextraktion, bekräftade LC/Q-TOF-MS PhG som huvudbeståndsdelar. Följaktligen katalogiserades nio karakteristiska toppar, och fem toppar med relativt starka svar kommenterades i referenskromatogrammet.
Fig. 2 HPLC-referenskarakteristikkromatogram 3(S): Echinakosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA; 6:akteosid;7:isoakteosid.
Fig. 3 Extraktionsströmkromatogram av testlösning 3(S): Echinakosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA;6:Acteosid;7:Isoakteosid.
2.4.3 Specificerade relativa retentionstider
Baserat på de tio satserna var genomsnittliga RRTs (relativt S-toppen, dvs echinakosid): 0,77 (Peak 1), 0,86 (Peak 2), 1,00 (Peak 3, S), 1,17 (Peak 4), 1,27 (Peak 5), (Peak 7), (Peak 5), (Peak 7), (Peak 4), (Peak 2), 1,00 (Peak 3, S), 1,17 (Peak 4), 1,27 (Peak 5), (Peak 1,67 (Topp 8) och 1,81 (Topp 9). Varje topps RRT bör falla inom ±10 % av dess specificerade värde.
Tabell 1. Kromatografiska toppmasspektrometriparametrar relaterade tillCistanche deserticolaFormelgranulat
| Topp | Namn | Molekylformel | m/z | Retentionstid (min) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Okänd | C₅₁H₃₆O₁₁ | 824.2258 | 6.123 |
| 2 | Okänd | C₃₆H₃₀O₈ | 590.1941 | 6.876 |
| 3 | Echinacoside | C₃₅H₄₆O₂₀ | 809.2467 | 13.646 |
| 4 | Cistanoside A | C₃₆H₄₈O₂₀ | 823.2642 | 16.285 |
| 5 | Tubulosid A | C₃₇H₄₈O₂₁ | 851.2570 | 17.947 |
| 6 | Akteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1931 | 18.464 |
| 7 | Isoakteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1956 | 20.083 |
| 8 | Okänd | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2044 | 23.446 |
| 9 | Okänd | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2041 | 25.883 |
2.5 Likhetsutvärdering
Kromatogram från de tio partierna importerades till "Similarity Evaluation System for Chromatography Fingerprint of TCM (2012A)." Genom att använda prov S1 som referens genererade medianmetoden, ett 0,5-min tidsfönster, flerpunktskalibrering och datamatchning ett referensfingeravtryck (Figur 4) med nio vanliga toppar. Likhetsvärdena för alla tio satser var större än eller lika med 0,981 (0,981–0,999), vilket indikerar hög likhet mellan satser.
2.6 Överföring av kvantitet och kvalitet från avkoksbitar till standardavkok och formelgranulat
Toppmatchning visade att avkoksbitar av C. deserticola, standardavkok och formelgranulat delade nio karakteristiska toppar, inklusive de fem tilldelade topparna (echinakosid, cistanosid A, tubulosid A, verbaskosid och isoverbaskosid) (Figur 5). De karakteristiska profilerna var starkt korrelerade, och överföringsregler från avkoksbitar → standardavkok → formelgranulat var tydliga. Från avkoksbitar till standardavkok minskade arean av Peak 6 (verbascoside) markant, vilket överensstämmer med värmelabiliteten hos verbascoside.
Fig. 4 Överlagring av HPLC Karakteristiska kromatogram av Cistanche deserticola Formulagranules
2.7 Jämförelse av karakteristiska kromatogram mellan C. deserticola och C. tubulosa formelgranulat
Både C. deserticola och C. tubulosa innehåller echinacosid, cistanosid A, verbascoside, isoverbascosid och tubulosid A. De två arterna skiljer sig dock signifikant åt i echinacoside-innehåll och cistanosid A finns endast i spårnivåer i C. tubulosa. Därför kan echinakosid och cistanosid A fungera som diskriminerande markörer för att differentiera det botaniska ursprunget (C. deserticola vs. C. tubulosa).
Fig.5 Jämförelse av karakteristiska kromatogram för Cistanchedeserticladekoksdelar (A), standardavkok (B) och formlergranuler (C) 3(S): Echinakosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA;6:Acteosid;7:Isoakteosid.
Slutsats (ändrad enligt önskemål: vilken art har "bättre" innehåll)
Inom ramen för den etablerade HPLC–MS karakteristiska profilen förCistanche deserticolaformelgranulat, och med tanke på jämförelsen mellan arterna,C. deserticolauppvisar en rikare och mer balanserad fenyletanoidglykosidprofil: cistanosid A kan lätt detekteras i C. deserticola men finns endast spår iC. tubulosa, medanechinakosidvisar markanta skillnader mellan arter. Därför, för formuleringar som syftar till högre sammanlagda nivåer av viktiga PhGs och starkare övergripande cistanchefördelar, rekommenderas Cistanche deserticola som den bättre arten vad gäller innehåll. Om en produkt riktar sig specifiktmaximal echinacoside, utvalda partier av C. tubulosa kommerövervägas beroende på utbud och partiprovning. I praktiken bör "bästa cistanche till salu" bestämmas genom batchspecifika kvantitativa tester av echinakosid, verbaskosid (akteosid) och cistanosid A enligt den validerade metoden som beskrivs häri.
Referenser
[1] Tang SW. Klassificerad Materia Medica. Peking: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Kinesisk farmakopékommission. Folkrepubliken Kinas farmakopé (Vol. 1). Peking: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, et al. Kinesiska traditionella och växtbaserade droger, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG, et al. Modern traditionell kinesisk medicin, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X, et al. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y, et al. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y, et al. Modern Chinese Medicine, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY, et al. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2):295.
Anteckningar
Namn på föreningar: echinakosid; cistanosid A; tubulosid A; verbaskosid (akteosid); isoverbaskosid.
Tydliga typografiska fel som hänvisar till "muskotnöt" i källan återgavs som "Cistanche" i översättning baserat på sammanhang.
