Kemisk profil och metabolitstudie av rå och bearbetad Cistanche Deserticola hos råttor av UPLC-Q-TOF-MSE

Kontakt E-posttina.xiang@wecistanche.comför mer information

Abstrakt

Bakgrund: Bearbetning av kinesisk materia medica är en framstående och unik farmaceutisk teknik inom traditionell kinesisk medicin (TCM) som används för att minska biverkningar och öka eller till och med ändra den terapeutiska effekten av de råa örterna. Förändringar i de väsentliga komponenterna som induceras av en optimerad processprocedur är primärt ansvariga för den ökade effekten av medicinalväxterna. Den njure-yang uppiggande effekten av risvinsångadCistanche deserticola(C.deserticola) var starkare än rå C.deserticola (CD).

Metoder: En jämförelseanalys utfördes med användning av UPLC-Q-TOF-MS med UNIFls informatikplattform för att bestämma påverkan av bearbetning. In vitro-studier utfördes för karakterisering av beståndsdelar samtmetaboliterin vivo. De kemiska komponenterna bestämdes i CD och dess bearbetade produkter. De multivariata statistiska analyserna utfördes för att utvärdera variationer mellan dem medan OPLS-DA användes för parvis jämförelse.

Resultat: Resultaten av denna studie avslöjade avsevärda variationer i fenyletanoidglykosider (PhGs) ochiridoiderefter bearbetning. Totalt 97 föreningar upptäcktes i extrakten av CD och dess bearbetade produkt. PhG med 4-O-kaffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen, som akteosid, cistanosid C, campneosid Il, osmanthusid minskade efter att ha bearbetats, medan PhG med 6' -O-kaffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen, såsom isoacetosid, isocistanosid C, isocampneosid l, isomartynosid ökade, särskilt i CD-NP-gruppen. Intensiteten av echinakosid och cistanosid B vars struktur har 6'-O- -D-glukopyranosyldelen ökade också. I en in vivo-studie upptäcktes 10 prototypkomponenter och 44 metaboliter i råttplasma, avföring och urin. De erhållna resultaten avslöjade att bearbetning leder till den avsevärda variationen i de kemiska beståndsdelarna i CD och påverkade dispositionen av föreningarna in vivo, och fas Ⅱ metaboliska processer är nyckelkaskaderna för varje förening, och de flesta av metaboliterna är associerade med echinakosid eller akteosid.

Slutsatser: Detta är den första globala jämförelseforskningen av rå och bearbetad CD. Dessa resultat bidrar till vår förståelse av effekten av CD-bearbetning och ger viktiga data för framtida effektutredningar.

Nyckelord: Cistanche deserticola, Processing, UPLC-Q-TOF-MS5, Kemiska profiler, Metaboliter in vivo

Introduktion

Bearbetning av kinesisk materia medica (CMM) har visat betydande tillämpbarhet i klinisk praxis för traditionell kinesisk medicin (TCM), och det har ansetts vara en hållbar behandling i flera århundraden. Detta är en unik läkemedelsteknologi som har härletts från teorin om TCM. Efter bearbetning har betydande skillnader i utseende, kemiska beståndsdelar, egenskaper och medicinsk betydelse för alla typer av TCM identifierats, vilket leder till antagandet att bearbetning kan förbättra effektiviteten eller minska TCM:s toxiska effekter.

I hundratals år,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong på kinesiska, CD) används ofta i TCM klinisk praxis för att komplettera njurens funktioner. Det hjälper också till att återfukta tarmen som leder till avslappnande tarm [1].Cistanchespelades först in i ShenNongBencaoJing. Det finns vanligtvis i torra och halvtorra livsmiljöer över Eurasien och Nordafrika, inklusive Iran, Kina, Indien och Mongoliet [2]. Bearbetningen av CD har utförts genom ångning med risvin under normalt tryck, vilket är en beredningsmetod dokumenterad i den kinesiska farmakopén (Jiucongrong på kinesiska, nedan kallad "CD-NP"). Och CD-ångning med risvin under högt tryck är en mer effektiv beredningsmetod (nedan kallad "CD-HP") [3, 4]. Flera studier har visat att de farmakologiska effekterna av CD skiljer sig från dess bearbetade produkter [5]. CD kan tonifiera njur-yang och slappna av tarmen, medan efter att ha ångats av risvin, effekten av att fylla på njur-yang skulle förstärkas. I vår tidigare studie har det visat sig att CD-NP kan förbättra tonifkationen av njuren och stödja yang, och lindra effekten av att fukta tarmarna och avföra avföring [6–8]. I klinisk praxis är bearbetade produkter den vanligaste formen.

Upp till dags dato har flera studier analyserat de kemiska komponenterna i CD, följt av isolering och identifiering av mer än 100 föreningar [9–11], såsom fenyletanolglykosider (PhGs),iridoider, lignaner och oligosackarider som dess huvudsakliga kemiska beståndsdelar. Det har också rapporterats att det finns många farmakologiska aktiviteter av PhG inklusive immunmodulerande, neuroprotektiva, leverskyddande, antiinflammatoriska, antioxidativa, etc. [12–14]. Iridoider har antiinflammatoriska aktiviteter [15, 16]. Det har också avslöjats av tidigare studier att vissa kemiska komponenter visade variationer under bearbetningen [17–20]. Baserat på dessa rapporter kan det antas att efterbearbetning, variationerna i kemisk sammansättning leder till olika farmakologiska effekter, som behöver utforskas ytterligare.

I den aktuella studien utfördes en känslig och effektiv metod, dvs ultrahögpresterande vätskekromatografi kopplad med TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) för jämförande analys, och in vitro-studier utfördes för att kvalitativt analysera extrakten av CD, CD-NP och CD-HP för att belysa deras kemiska profiler. Generellt sett betraktades de exogena kemikalierna med hög exponering i målorgan som effektiva komponenter. Därför administrerades CD och dess bearbetade produkter oralt till råttor, följt av deras karakterisering. Den befintliga studien avslöjar en jämförande studie (både in vitro och in vivo) av rå och bearbetad CD för första gången. De erhållna resultaten skulle utöka vår förståelse angående effekten av CD-bearbetning, vilket kan vara till hjälp för ytterligare studier.

Material och metoder

Material

Standardföreningar av ajugol(180120) och 2'-acetylacetosid(M0601AS) tillhandahölls av Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Kina). Cistanoside F(MUST-17022620), echinacoside (D1105AS), cistano-sida A(M0906AS) och isoacteosid(M0106AS) tillhandahölls av Must-företaget (Sichuan Kina); acteosid (O0618AS), salidroside(J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposid(A0407AS) och geniposidinsyra (MB6001-S) förvärvades från Dalian Meilun Bio.Co.,Ltd(Dalian, Kina).8-epideoxylogansyra (B31123) var erhållen från Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Kina. Metanol och acetonitril var av MS-kvalitet och erhölls från Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland. Metansyra (CH, O,) av HPLC-kvalitet tillhandahölls av Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland). Vattnet, som användes i den befintliga studien, bearbetades via Milli-Q-systemet (18,2 MQ, Millipore, Ma, USA). Risvin levererades av Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).

Cistanch deserticola samlades in från Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Proverna identifierades av Prof. Yanjun Zhai (farmaceutskolan, Liaoning University of TCM). Proverna lämnades till Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.

Djur

Sprague–Dawley-råttor av hankön (SPF-klass) med 180–220 g total kroppsvikt tillhandahölls av Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center i Liaoning-provinsen, licensnummer: SCXK-2015–0001). Dessa råttor hölls i ett avelsrum med väl underhållen temperatur och luftfuktighet, dvs 20–26 grader, 50–70 procent under en vecka. Råttorna matades med vanlig labbmat och vatten före experiment. Djuren fastade över natten, men vattnet tillhandahölls ad libitum före experimentet. Råttorna avrättades med 10 procent kloralhydratbedövningsmedel. Den institutionella djuretiska kommittén vid Liaoning Provincial Hospital of Chinese Medicine godkände alla experimentella protokoll (2019.3.25, 2019015).

Beredning av CD-, CD-NP- och CD-HP-extrakt

CD-NP, CD-HP bearbetades från samma sats av Cistanch deserticola. För att förbereda CD-NP fuktades torra CD-bitar (5 mm tjocka, 100 g) med risvin (30 ml) och ångades vid 100 grader i 16 timmar, följt av torkning vid 55 grader via torkugn. Medan CD-HP framställdes via infiltration av torra CD-bitar (5 mm tjocka, 100 g) med risvin (30 ml), följt av ångning vid 1,25 atmosfärstryck i 4 timmar. och torkade sedan i torkugn på 55 grader .

I en 100 ml mätkolv siktades ett gram av pulvret via sikt #4, följt av tillsats av 50 procent metanol (50 ml) och täcktes sedan tätt och blandades. Denna blandning vägdes, följt av halva timmar. urlakning. Efter maceration ultraljudsbehandlades blandningen (effekt 250 W, frekvens 35 kHz) under 40 minuter, följt av kylning och vägning igen. Viktförlusten fylldes på med 50% metanol, ordentligt blandad och fick stå, följt av filtrering av supernatanten och sedan användning av det erhållna filtratet som testlösning.

MSE-analys av aktiva komponenter

Beredning av standardsubstanser: tubulosid-A (3.02 mg), echinakosid (3.00 mg), 2'-acetylakteosid (2,34 mg), acteosid (2,45 mg), isoacteosid (0,61) mg), cistanosid-F (2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), geniposid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catalpol (2,39 mg), geniposidinsyra (2,56 mg) och 8-epideoxyloganic syra (2,34 mg) tillsattes i en 10 ml volymetrisk behållare, tillsattes metanol konstant volym i skala, konfigurerades till en motsvarande koncentrationsreferenslösning. Var och en av de 100 μL konfigurerades till en blandad referenslösning.

MS-analysvillkor: Massvärdet korrigerades före experimentet, och negativ jonläget användes. Massintervallet var 50–1200 Da, och provet injicerades genom en flödesinsprutningspump. Konhastigheten var 100 L/h, lösningsmedelsflödeshastigheten sattes till 800 L/h. Kapillär- och konspänningarna var fixerade till 2500 och 40 V, i enlighet därmed. Temperaturen på jonkällan och lösningsmedelsgasen var 100 grader respektive 400 grader och signalupptagningsfrekvensen var 0,5 S−1.

UPLC-Q-TOF-MS analys av CD-extrakt (15–16 min), 65 procent till 55 procent A (16–18 min). Flödeshastigheten var 0,3 mL min−1, medan temperaturen i autosamplerrummet och kolonnen var 30 grader och 8 grader separat. Injektionsvolymen var 1,0 μL.

Den masspektrometriska utvärderingen utfördes via Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), innefattande en ESI-källa. Flödeshastigheten för kvävgas var fixerad till 800 L·hrs−1 med en temp på 400 grader , källtemperaturen var fixerad till 100 grader och kongasen var inställd på 50 L h−1. Spänningen för kon och kapillär justerades till 40 och 2000 V, i enlighet därmed. Rampens kollisionsenergi användes i intervallet 20–30 V. Centroiddata för alla prov erhölls från 50 till 1200 Da, med en 5-skanningstid på 0,5 s under en analystid på 10 minuter . LockSpray TM användes för validering av massprecisionen. Te [M–H]− jon av leucinenkefalin (200 pg·μL−1 infusionsflödeshastighet 10 μL min−1) vid m/z 554,2615 användes som låsmassa. MassLynx V4.1-mjukvaran (Waters Co., Milford, USA) användes för den exakta massan, sammansättningen av prekursorjonerna och beräkningen av fragmentjonerna.

Dataanalys i Masslynx plattform

Dessutom skapades ett internt bibliotek med namnet på föreningen, dess struktur och molekylformeln (i mol) baserat på litteratur. Alla föreningar noterades i en speciell mall, gjord i Excel. Dessutom sparades mol-filerna (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, USA) och Excel-filerna för alla individuella sammansatta strukturer på den lokala datorn. Det etablerade Excel-arket med viktiga data importerades direkt till det vetenskapliga biblioteket i UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Storbritannien användes för utvärdering av strukturella egenskaper, särskilt för de karakteristiska fragmenten och MS-fragmentering. En minsta topparea på 500 ställdes in för 2D-toppdetektering. Under avslöjande av 3D-toppar valdes en lågenergitoppintensitet på mer än 300 räkningar och förhöjd energitoppintensitet på mer än 80 räkningar. Massfelet befanns vara upp till ±10 ppm för kända föreningar, och retentionstidstoleransen sattes till intervallet ±0,1 min. Vi valde de negativa addukterna innehållande -H plus HCOOH. Bearbetningen av rådata som erhållits från MS utfördes via strömlinjeformad UNIFI-mjukvara för att snabbt lokalisera de kemiska komponenterna som uppfyllde standarderna med den egenbyggda databasen och det interna biblioteket för traditionell medicin.

Därefter, för att verifiera den kemiska strukturen för varje målförening, särskiljdes isomererna genom sina karakteristiska MS-fragmenteringsmönster som avslöjades i de rapporterade studierna och genom att jämföra retentionstiderna för referensstandarder.

Metabolomisk analys baserad på multivariat statistisk analys

Innan rådata bearbetades ställdes parametrarna in, såsom massa från 150 till 1200 Da, intervall för retentionstid (0 till 20 min), tröskelintensitet ( 2000 räkningar), masstolerans dvs 5 MDA, medan massan och retentionstidsfönstret var 0,20 min respektive 0,05 Da. I den efterföljande listan över databasen var jonernas identifierare RT-m/-paren med avseende på deras elueringstider. Samma värden för RT och m/z i olika satser av prover ansågs vara samma förening.

Multivariat statistisk analys utfördes för att utvärdera effektiva biomarkörer som avsevärt bidrog till variationer mellan olika grupper. Under analysen användes principal komponentanalys (PCA) för att indikera maximala skillnader och mönsterigenkänning för att få en överblick och klassificering. OPLS-DA är ett modelleringsverktyg som tillhandahåller visualisering av OPLS-DA:s prediktiva komponentbelastning för att underlätta modellutvärdering. Variabel betydelse för projektionen (VIP) användes för att bedöma utvärderingen av olika komponenter, ochmetaboliterwith VIP values>1.0 och P-värde<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Djurförsöksråttor kategoriserades slumpmässigt i fyra grupper (n=6 för varje grupp), följt av oral administrering av olika extrakt: (1) Blank kontrollgrupp: råttorna fick normal koksaltlösning (2 ml/100 g) ; (2) CD-grupp: råttorna gavs CD-extrakt (2 ml/100 g); (3) CD-NP-grupp: råttorna gavs CD-NP-extrakt (2 ml/100 g); (4) CD-HP-grupp: råttorna gavs CD-HP-extrakt (2 ml/100 g). Den ytterligare kategoriseringen av alla grupper genomfördes i tre undergrupper för plasma, urin och avföring. Två timmar senare administrerades varje råtta oralt med samma och lika stora mängd extrakt.

Efter administrering utfördes insamlingen av blodprover efter 1.0 h, 2.0 h och 4.0 h i hepariniserade 1,5 mL polyetenrör (från orbitala vener) följt av centrifugering (vid 4500 rpm) av alla prover under 15 min.

För urin- och avföringsprover hölls råttorna i metabolismburar, och sedan utfördes insamlingen av urin- och avföringsprover i 24 timmar efter administrering. Centrifugeringen av urinprover utfördes vid 45 00 rpm i 15 minuter, medan avföringsprover torkades i skuggan, maldes till pulver, sedan togs 0,2 g och sattes till 0,5 ml saltlösning lösning, ultraljud i 5 minuter och centrifugeras vid 12,000 rpm i 15 minuter. Alla bioprover hölls vid -80 grader fram till analys.

Beredning av biologiska prover. Tillsatsen av plasma-, urin- och avföringsprover utfördes med 3 volymer metanol, följt av vortexning i 3 minuter. Därefter utfördes centrifugeringen (vid 12,000 rpm) av blandningarna under 10 minuter, följt av överföring av supernatant till EP-röret och torkades sedan med kväve vid 37 grader. Dessutom tillsattes 200 μL HCN–H2O (50 procent) lösning. Tio användes virveln för blandning (1 min), följt av centrifugering (vid 12, 000 rpm) under 5 min. Supernatanten (5 μL) av de behandlade proverna injicerades i UPLC-Q-TOF-MSE-systemet.

Vätskekromatografiskt och masspektrometriskt tillstånd Analysen förmetaboliterutfördes också av Waters UPLC-instrumentet genom ett ESI-gränssnitt. Separationer utfördes med användning av en Acquity UPLC HSS T3-kolonn (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm), den mobila fasen var 0,1 procent myrsyra (A): acetonitril (B), gradientelueringsvillkoret var 0-3 min (99,8 procent →98 procent A).3-5 min(98 procent →95 procent A),5-8 min(95 procent →90 procent A), { {18}} min (90 procent →85 procent A),12-17 min(85 procent →70 procent A), 17-22 min (70 procent →60 procent A), 22-23 min (60 procent →58 procent A), 23-25 min (58 procent A),25-32 min (58 procent →45 procent A) och 32-37 min (45 procent →35 procent A) ),0,4 mL min-1 var flödeshastigheten. Temperaturen för kolonnen och provrummet var inställd på 40 grader respektive 8 grader. De ovan nämnda masspektrometribetingelserna användes.

Strategi för systematisk analys av metaboliter i bio-samplesUNIFI (1.8.2) programvara användes för databehandling. Funktionen Binary Compare användes för identifiering av effektiva metaboliter. Utvärderade metaboliter fanns inte i det ekvivalenta kontrollprovet eller existerade vid låga jonintensiteter. Den relativa intensitetströskeln sattes till 3 eller 5, och metaboliter som uppfyllde de understrukna kriterierna kunde utvärderas. Vanliga och förutsägbara metaboliter bestämdes sedan med EIC. För sökning av tvåfasmetaboliter användes NLF-funktionen. Till exempel, i UNIFI-mjukvaran, kan parametrarna ställas in på 176.0321 för att söka efter möjliga glukuronsyrakonjugat. Efterbearbetning kan en neutral förlust ställas in i metoden eller identifieras. MassFragment användes för att bestämma eller karakterisera detekterade metaboliters strukturer, UNIFIs spektrala tolkningsfunktion är den huvudsakliga funktionen som används för att analysera sekundär fragmentering av moderkomponenter. Denna funktion kan användas för snabb verifiering av fragmenteringsvägen oavsett om det är rimligt.

Resultat

Massfragmenteringsregel för fenyletanoidglykosider och iridoider

Fenyletanoidglykosider är de viktigaste kemiska beståndsdelarna i CD. Standardlösningarna av isoakteosid,

cistanosid F, tubulosid A, echinakosid, acteosid och 2'-acetyl-acteosid togs, följt av tillhandahållande av en annan nivå av kollisionsenergier (tabell 1), och sedan erhölls motsvarande MS2-kartor (fig. 1).

Den masspektrometriska analysen avslöjade att fenyletanoidglykosider har liknande masspektrumfragmenteringsmönster, klyvningsvägarna i negativ-jonläget inkluderar huvudsakligen (1) Esterbindningsklyvning: förlust av neutral koffeoylgrupp (C, H, O162.03) och neutral acetyl grupp (C, H, O,42.00);(2) Glykosidklyvning: förlust av neutrala ramnosrester (C.HIO, 146.05) och neutral glukosrest (CgHO, 162.05). Från högupplöst masspektrometri kunde kaffeoyl(162.03) och glukosrester (162.05) särskiljas.

Iridoiderna ajugol, catalpol, geniposidinsyra, geniposid och 8-epideoxylogansyrastandardlösningar togs, följt av att tillhandahålla olika kollisionsenergier, och motsvarande MS-kartor erhölls (Fig. 2).

Iridoidglykosider har liknande masspektrumfragmenteringsmönster, klyvningsvägarna i negativ-jonläget inkluderar huvudsakligen (1)Glykosidklyvning: Förlust av neutral glukosrester(CHoO,162,05);(2)Förlust av neutral CO,(43,99) och H 0 (18,01).

Identifiering av föreningarna i CD-, CD-NP- och CD-HP-extrakt

UPLC-QTOF-MSE-analys

Optimeringen av kromatografiska betingelser utfördes. Därefter utvärderades föreningarna av CistancheHerba i både negativa och positiva jonlägen med höga såväl som låga CE. De erhållna resultaten avslöjade att kompatibiliteten för det negativa sättet var högre i förhållande till det positiva sättet för dessa föreningar. Figur 3 visade MS basisk toppjon (BPI) kromatogram spårat med numrerade toppar. Intensiteten för varje detekterad jon i UPLC-Q-TOF-MS analys normaliserades med avseende på hela jontalet för generering av en datamatris som bestod av m/z-värde, den normaliserade topparean och retentionstid.

Utvärderingen av komponenter från CD och dess bearbetade produkter på UNIFl-plattformen

Totalt 97 föreningar identifierades med -SEM (n=6)-mod från CD och dess bearbetade produkt (tabell 2), inklusive fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner och oligosackarider. Komponenterna 95, 91 och 94 detekterades i CD, CD-NP och CD-HP i enlighet därmed. Bland dem var 64 fenyletanoider, 13 var iridoider och 20 andra typer av föreningar bestämdes. Det fanns en likhet i den kemiska sammansättningen av CD och dess bearbetade produkt, men mängden av komponenterna visade sig vara olika mellan CD och dess bearbetade produkt.

Variationer i kemiska komponenter i bearbetade produkter. Programvaran Simca-P 13.0 användes för att analysera den multivariata datamatrisen. Innan PCA var alla variabler medelcentrerade och Pareto-skalade, följt av identifiering av potentiella diskriminerande variabler. I ett PCA-poängdiagram visade varje punkt ett individuellt prov. Prover som visade likheter i sina kemiska komponenter var utspridda intill varandra, medan de som visade variationer i deras komponenter delades upp. Såsom framgår av PCA (fig. 4), separerades gruppen av CD-HP från grupperna av CD och CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 och P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Från fig. 8 fann vi intensiteten av akteosid(54), cistanosid C(74), campneosid I(43), osmanthusid (75) och 2'-aktylakteosid(80) som har 4'-O-kaffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen (se fig. 9) minskade efter att ha bearbetats med risvin, medan intensiteten av isoacetoside(60), är castanosid (71),iso-campneosid I (69), isomartynosid (86) med 6'-O-kaffeoylgruppen (se fig. 9) ökad, speciellt för CD-NP-gruppen. Även om tubulosid B (72) har en 6'-O-kaffeoylgrupp, samma som isoakteosid, minskade intensiteten på grund av dess 2'-acetylgrupp. Intensiteten av echinakosid(38) och cistanosid B som har 6'-O- -D-glukopyranosyldelgrupper ökade, men intensiteten av tubulosid A (55) minskade också på grund av dess 2'-acetylgrupp.

Vårt forskarteam studerade också den termiska stabiliteten hos akteosid och isoakteosid och fann att akteosid var instabil i vatten, metanol och gul risvinlösning och kunde omvandlas till isoakteosid delvis under uppvärmningsförhållanden. Men värmestabiliteten hos isoakteosid var bättre, särskilt i gul risvinlösning. Figur 10 visade de möjliga förändringarna av PhGs i CD under bearbetning:

Identifiering av metaboliterna hos råttor Från högupplösta masspektrometridata analyserades och jämfördes den exakta molekylvikten och grundämnessammansättningen för metaboliter och protomolekylföreningar. Eftersom samma typer av föreningar i TCM visade likheter i metaboliska modifieringar, kan korrelationerna mellan fytokemiska beståndsdelar in vitro sträcka sig till deras metaboliter in vivo. Under tiden, baserat på konventionella biotransformationsvägar, kunde man sluta sig till en rimlig förändring av molekylvikten. Slutligen identifierades metaboliterna genom att analysera MSE-masspektra för metaboliterna och protoföreningarnas fragmenteringsväg i masspektrumet [21, 22]. Jämfört med blankprovet identifierades dess komponenter in vivo baserat på informationen från kromatogram-masspektrum, möjligheten till en metabolisk reaktion, egenskaperna hos föreningsstrukturen och fragmenteringsregeln för dess masspektrum. Se tabell 3.

Identifiering av fenyletanolglykosiderrelaterade metaboliter

UNIFI-plattformen användes för bearbetning. Figur 11 visade TIC-kromatografen av urin, avföring och plasma för CD och dess bearbetade produkter. Jämfört med blankprover identifierades totalt 54 metaboliter hos råttor, inklusive 10 prototypkomponenter och 44 metaboliter, där 24, 49 och 6 fanns i avföring, urin och plasma, i enlighet därmed.

Baserat på exakt massa, fragmenteringskaskad och förutsägbara neutrala förluster genom biotransformation, utvärderades totalt 35 fenyletanoidglykosider-associerade metaboliter preliminärt. De relaterade metaboliterna av fenyletanoidglykosider har liknande masspektrumfragmenteringsmönster, som det typiska koffeoylfragmentet m/z 461.1605, som sedan hydrolyseras ytterligare av glykosid- och esterbindningar in vivo och metaboliseras till hydroxityrosol (HT)(m/ z153.0504, C.HO.4,73 min) och koffeinsyra (CA) (m/z179,0389, CH, 0,77 min), se Fig. 12A.

Mll indikerade [MH]~vid m/153,0504 med formeln dvs, C.HO, och identifierades som HT. M16 presenterade [MH]- vid m/z 329,0851, vilket var 176 Da förhöjt än det för HT, vilket avslöjade att det kan vara en glukuroniderad metabolit av HT. [MH]-för M26 var vid m/z 343.1037,14 Da högre än det för HT-glukuronid. Därför identifierades M26 som HT-metylerad glukuronid. M17 identifierades som HT-sulfat baserat på dess [MH]-vid m/z 233,0112,80 Da över HT, som kunde metyleras ytterligare, producerade sedan M22, som visade m/z 247,0278, vilket indikerar att det var HT- metylerad sulfaterad metabolit. M7 (m/167,0335) och M5 (m/z 167,0762) betraktades som oxidationsprodukter respektive metylerad HT (Fig. 12B).

M1 indikerade [MH]- vid m/z 179,0389, belyst molekylformel var CH-O och identifierades som koffeinsyra(CA). M25 visade [MH]- vid m/355,0704, som var 176 Da förhöjda än CA, visar att det kan vara en glukuroniderad metabolit av CA. M27 hade m/z 258.994, vilket var 80 Da högre än det för CA, så vi klargjorde det som CA-sulfat, och det kunde producera M35 (m/z 273.0064). Eftersom M4 ger [MH]7 vid m/z 193,0524,14 Da högre än CA, identifierades den som CA-metylerad metabolit. M39 var CA-dehydroxyleringsmetabolit, med m/z 163,04, och den kunde sulfateras till M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9,06 min) var reduktionsprodukten av CA, det vill säga 3,4-dihydroxibensenpropionsyra, som kunde metyleras till M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 skulle kunna dehydratiseras till M43, det vill säga 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min), och M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) och M29 (m/z,S,S,S,S) och M29 (m/z,S,S,S 8,52 min) var de glukuroniderade och sulfaterade produkterna (Fig. 12C).

För de fenyletanoidglykosider-associerade metaboliterna var de viktigaste metaboliska kaskaderna fas II-metaboliska reaktioner, dvs glukuronidering, metylering och sulfatering. De föreslagna metaboliska kaskaderna av fenyletanoider är avbildade i fig. 13.

Identifiering av iridoidrelaterade metaboliter

Genom att analysera metaboliternas elementära sammansättning, MSE-fragmentering och tillhörande litteratur, utvärderades totalt 19 iridoidassocierade metaboliter preliminärt. Iridoidglykosider hydrolyserades av glykosidbindningar för att bilda deras motsvarande aglykoner. M/z 185,117 var för M8, 162 Da mindre än ajugol, vilket gavs genom förlust av glukosrest.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) var den deglykosylerade produkten av katalpol. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) var mindre än 30 Da den för catalpol deglykosylerad metabolit, och identifierades som avlägsnande av en molekyl av CH,O-metabolit. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), var ytterligare förlust av H, O-metabolit.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) var en deglykosylerad metabolit av geniposid, och M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) var deglykosylering av 8-epideoxylogansyra. Metaboliska reaktioner för iridoider kunde avslöjas som fas I-metabolism av deglykosylering (Fig. 12D).

Jämförelse av metabolisk profilering i plasma, urin och avföring mellan CD och dess bearbetade produkter

2 prototyper i plasma, 7 i urin och 3 i avföring jämfördes. Det fanns 7 prototyper absorberade i CD, 7 prototyper absorberade i CD-NP och 8 prototyper i CD-HP. M21 detekterades endast i avföringsgruppen av CD-NP, och M38 och M51 upptäcktes bara i uringrupper av CD-HP. Jämfört med metaboliter var identiska metaboliter i plasma, urin och feces 4, 42 respektive 21. Det absorberades 34 metaboliter i CD-gruppen, 39 i CD-NP och 40 i CD-HP-gruppen. M5, M7, M40 och M52 detekterades endast i CD-NP-grupper, medan M24, M4l och M48 just detekterades i CD-HP-grupper.

Variationer observerades i absorptionen och metabolismen av aktiva föreningar i olika bearbetade produkter av CD. Från Fig.14 fann vi att intensiteten av HT-sulfatkonjugering (M17) var högst i urinen, följt av 3-HPP-sulfatkonjugering (M29), metylerad HT-sulfatkonjugering (M22), dehydroxylerad CA-sulfat konjugation(M32) och 3,4-dihydroxibensenpropionsyrasulfatkonjugering (M19). Innehållet av metabola produkter i den bearbetade gruppen var högre än i CD-gruppen, särskilt för M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Deras prekursor 6'-O-kaffeoylgrupp i 8-O- -D-glukopyranosyl-delen, föreningar, såsom hydroxityrosol har antitumör-, antiinflammatoriska, antibakteriella, antivirala och svampdödande egenskaper [ 23]. Koffeinsyra har antiinflammatoriska, anticancer- och antivirala aktiviteter [24]. Det överensstämde med den kliniska användningen av CD och dess bearbetade produkter.

Diskussion

CD är en TCM, och dess viktigaste bioaktiva komponenter, inklusive PhGs, iridoider, polysackarider har dokumenterats av olika forskningsstudier. I TCM klinisk praxis har de bearbetade produkterna av CD använts i stor utsträckning jämfört med råa. Den kemiska sammansättningen kommer att förändras under bearbetningen, vilket kan leda till förändringar i de medicinska effekterna (Fig. 14).

PhG är en typ av fenolförening som kännetecknas av en -glukopyranosidstruktur som bär en hydroxi-fenyletyldel som aglykon. Dessa föreningar innefattar ofta koffeinsyra och ramnos bundna till glukosresten genom ester- respektive glykosidbindningar. I den aktuella studien, de kvalitativa analyserna av CD, CD-NP. och CD-HP genomfördes, och totalt 97 föreningar, inklusive fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, etc. identifierades. De erhållna resultaten visade variationer i kemisk sammansättning före och efter bearbetning. Intensiteten hos PhGs med 4'-O-caffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen, som akteosid, cistanosid C, campneosid II, osmanthus-sidan minskade efter att ha bearbetats, medan PhGs med

såsom isoacetosid, issocistanosid, isocampneosid I, ökad isomartynosid, speciellt i CD-NP-gruppen. Intensiteten av echinakosid och cistanosid B vars struktur har 6'-O- -D-glukopyranosyldelen ökade också. PhG med en 2'-acetylgrupp minskade ofta på grund av hydrolysreaktionen under processen, som tubulosid B, 2-acetylakteosid.

Undersökning av metaboliter absorberade in vivo utfördes efter oral administrering av CD och dess bearbetade produkter. De metaboliska processerna i fas II var nyckelkaskaderna och de flesta av metaboliterna var sulfat, glukuronid och metylerade konjugat. Fenyletanolglykosider har låg oral absorption och användning. De är svåra att absorberas i blodet och fungerar som stamfader för att spela sina roller efter metabolisk aktivering in vivo. Fenyletanoider som produceras till fenyletanolaglykon, som hydroxityrosol (HT) och koffeinsyra (CA) och dess derivat 3-hydroxifenylpropionsyra (3-HPP), kan dessa metaboliter lättare absorberas i plasma och ha en bättre medicinsk effekt.

CD och dess bearbetade produkter. HT-sulfatkonjugering (M17) har den högsta intensiteten i urinen, följt av 3-HPP-sulfatkonjugation (M29), metylerad HT-sulfatkonjugation (M22), dehydroxylerad CA-sulfatkonjugation (M32) och 3,{{ 7}}dihydroxibensenpropionsyrasulfatkonjugering (M19). Innehållet av metabola produkter i den bearbetade gruppen var högre än i CD-gruppen, särskilt för M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Generellt kan de komponenter som har hög exponering i målorgan vara effektiva. En tillräcklig mängd fenyletanoider och deras derivat har utvärderats och bestämts in vitro. Akteosid är den karakteristiska föreningen, vars halt minskade efter att ha bearbetats med risvin, och halten av isoakteosid, isocistanosid C, isocampneosid I ökade i motsvarande grad. Nedbrytningsprodukterna av PhG, som CA- och HT-derivat, kan utvärderas i bioproverna, och bearbetning av risvin kan förbättra absorptionen av metaboliter in vivo.

Slutsats

I denna studie upptäcktes 97 föreningar i extrakten av CD och dess bearbetade produkt. Nedbrytningen av ett fåtal glykosider skedde under en förhöjd temperatur och som ett resultat syntetiserades några nya isomerer och komplex. I en in vivo-studie bestämdes prototypkomponenter (10) och metaboliter (44) eller utvärderades preliminärt i råttplasma, avföring och urin. Fas II metaboliska processer var nyckelkaskaderna, de flesta av metaboliterna var associerade med echinakosid eller akteosid, som HT, CA och deras derivat 3-hydroxifenylpropionsyra 3-HPP. Dessa metaboliter kan lättare absorberas i plasman och ha en bättre medicinsk effekt. De erhållna resultaten visade att den kemiska sammansättningen av CD var annorlunda och påverkade dispositionen av föreningen in vitro och in vivo.

Förkortningar

PhG: fenyletanoidglykosider; CD: Cistanche deserticola; CMM: Chinese Materia Medica; TCM: Traditionell kinesisk medicin; CD-NP: Gistanche deserticola Bearbetad genom ångning med risvin under normalt tryck; CD-HP: Cistanche deserticola Bearbetad genom ångning med risvin under högt tryck; UPLC-Q-TOF-MS: Ultrahögpresterande vätskekromatografi kopplad med TOF-MS; PCA: Huvudkomponentanalys; VIP: Variabel betydelse för projektionen;CA: Caffeicacid; HA: Hydroxytyrosol.

Erkännanden

Inte tillämpbar.

Författarnas bidrag

LZ, LBN, SJ deltog i utformningen och skrev manuskriptet. RJ, LPP hjälpte till med djurförsöken och utarbetade och färdigställde alla figurer och tabeller. ZC, HY. ITZ hjälpte till med designen och utförandet av denna studie och granskade manuskriptet. Alla författare läste och godkände det slutliga manuskriptet.

Finansiering

Detta arbete stöddes av Kinas National Natural Science Foundation (anslag nr: 81874345) och Natural Science Foundation i Liaoning-provinsen (anslagsnummer: 2020-MS-223).

Tillgänglighet av data och material

Datauppsättningarna som används och/eller analyseras under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.

Deklarationer

Etiskt godkännande och samtycke till att delta

Etiskt godkännande för användning av försöksdjur för denna studie hade erhållits från Medical Ethics Committee vid Liaoning University of Traditional Chinese Medicine (Godkännandenummer: 2018YS(DW)-044-01), Alla experimentella procedurer i denna studie var enligt etiska standarder för den medicinska etiska kommittén vid Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.

Samtycke till publicering

Inte tillämpbar.

Konkurrerande intressen

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter att avslöja.

Författarinformation

'Farmaceutiska avdelningen, Liaonings universitet för traditionell kinesisk medicin, Dalian, Liaoning, Kina.' Läkemedelsforskningsinstitutet vid Monos Group, Ulaanbaatar 14250, Mongoliet.

Mottaget:31 maj 2021 Godkänd:17 september 2021 Publicerad online: 28 september 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1* , Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 och Tianzhu Jia1

Referenser

1. Kinesisk farmakopékommission. Pharmacopeia of the People's Republic of China, vol. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. sid. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): en av de bästa farmaceutiska gåvorna inom traditionell kinesisk medicin. Front Pharmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Effekter av olika torkningsmetoder för Fresh Cistanche deserticola på dess komponentinnehåll. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimering av högtrycksångningsprocessen för Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Effekter av Cistanches herba före och efter bearbetning på anti-aging funktion och immunfunktion hos D-galaktos-inducerade åldrande råttor. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Studie av laxerande beståndsdelar i Cistanche deserticola YMCA. Modern Chin Med. 2015;17(4):307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Studie om den neuroendokrina-immuna funktionen hos Cistanche deserticola och dess risvinsångande produkter i den glukokortikoidinducerade råttmodellen. Evid-baserat komplement Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Förbättring av njuruppfriskande funktion i musmodellen av Cistanches herba torkade snabbt vid en medelhög temperatur. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Desert ginseng": en recension. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: En översikt över dess kemi, farmakologi och farmakokinetiska egenskaper. J Ethnopharmacol kol. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): en genomgång av dess fytokemi och farmakologi. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektiva effekter av echinakosid i mus-MPTP-modellen av Parkinsons sjukdom. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Skyddande effekt av tubulosid B på TNF alfa-inducerad apoptos i neuronala celler. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Antiinflammatoriska iridoider från stjälkar av Cistanche deserticola odlade i Tarimöknen. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Fenyletanoidglykosider med antiinflammatoriska aktiviteter från stjälkar av Cistanche deserticola odlade i Tarimöknen. Fitoterapia. 2013;89:167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoid och acykliska monoterpenglykosider, kankanosider L, M, N, O och P från Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. En ny strategi för att snabbt utforska potentiella kemiska markörer för diskriminering mellan rå och bearbetad Radix Rehmanniae av UHPLC-TOF-MS med multivariat statistisk analys. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Förändringar i nivåer av fenyletanoidglykosider, antioxidantaktivitet och andra kvalitetsegenskaper i Cistanche deserticola-skivor genom ångbearbetning. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Innehållsförändringar av sex fenyletanoidglykosider under ångande tidsintervall med vin i Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Effekten av ångprocessen på kvaliteten på cistanche deserticola efter skörd för medicinskt bruk under soltorkning. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metaboliter av dietacteosid: profiler, isolering, identifiering och hepatoskyddande kapacitet. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Systematisk karakterisering av metaboliterna av echinacoside och acteosid från Cistanche tubulosa i råttplasma, galla, urin och avföring baserat på UPLC-ESI-Q-TOF -FRÖKEN. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: en naturlig förening med lovande farmakologiska aktiviteter. J Biotechnol. 2020;309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, en mångsidig farmakofor: en översikt. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Förlagets anteckning

Springer Nature förblir neutral med avseende på jurisdiktionsanspråk i publicerade kartor och institutionella anknytningar.