Cirkulärt RNA CircDVL1 hämmar clearcells njurcellskarcinomprogression genom MiR-412-3p/PCDH7-axeln

Abstrakt

Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) är en primär njurcancer med hög aggressiv fenotyp och extremt dålig prognos. Ackumulerande bevis tyder på att cirkulära RNA (circRNAs) spelar avgörande roller i förekomsten och utvecklingen av olika humana cancerformer. Men uttrycket, den kliniska betydelsen och den reglerande rollen för circRNAs i ccRCC förblir i stort sett oklara. Här rapporterar vi att circDVL1 reduceras i serum och vävnader hos ccRCC-patienter och korrelerar negativt med ccRCC maligna egenskaper. Överuttryck av circDVL1 hämmar proliferation, inducerar G1/S-stopp, utlöser apoptos och minskar migration och invasion i olika ccRCC-celler in vitro. På motsvarande sätt undertrycker circDVL1-överuttryck ccRCC-tumörgenicitet i en musxenograftmodell. Mekanistiskt fungerar circDVL1 som en svamp för onkogen miR-412-3p, och förhindrar därigenom miR-412-3p-medierad repression av dess målprotocadherin 7 (PCDH7) i ccRCC-celler. Sammantaget visar våra resultat att circDVL1 utövar tumörhämmande funktion under ccRCC-progression genom circDVL1/miR-412-3p/PCDH7-axeln, och antyder att circDVL1 kan vara en ny diagnostisk och prognostisk markör och terapeutiskt mål för ccRCC.

Nyckelord

circDVL1; Njurcellscancer; miR-412-3p; PCDH7; biomarkör

Klicka här för att se fördelarna med Cistanche

Introduktion

Njurcellscancer (RCC) är ett extremt dödligt malignt karcinom i det urologiska systemet och som allvarligt påverkar människors hälsa [1]. RCC-incidensen har ökat under de senaste decennierna, med 73 750 nya fall diagnostiserade i USA 2020 [2, 3]. Clear cell RCC (ccRCC), den vanligaste och mest aggressiva subtypen av RCC, står för 70–75 procent av RCC-fallen [4]. Viktigt är att mer än 30 procent av ccRCC-patienter är associerade med metastaser vid initial diagnos. Dessutom, även om radikal kirurgi är det huvudsakliga behandlingsalternativet för primär ccRCC, upplevde fortfarande cirka 40 procent av patienterna återfall och metastaser med 5-årsöverlevnad på mindre än 10 procent [5, 6]. Dessa dilemman understryker det akuta behovet av att utforska de molekylära mekanismerna bakom utvecklingen av ccRCC, både som diagnostiska och prognostiska biomarkörer och som potentiella terapeutiska mål.

Cirkulära RNA (circRNAs) är icke-kodande RNA med enkelkedjiga slutna slinga strukturer som gör dem mycket stabila [7, 8]. Nyligen genomförda studier har visat att circRNAs är rikliga i blod [9, 10], saliv [11] och exosomer [12], vilket indikerar att de kan fungera som nya diagnostiska biomarkörer [13]. Med tanke på att flytande biopsi är mindre invasiv än traditionell vävnadsbiopsi [14], har circRNA ansetts vara värdefulla prediktiva verktyg för precisionsmedicin [15-17]. Specifikt kan flera circRNAs, såsom cricNOX4, circEGLN3 och circPRRC2A, fungera som potentiella biomarkörer för RCC-diagnos och/eller prognos, vilket har sammanfattats i vår senaste översyn [18]. Dessutom fokuserar aktuell forskning huvudsakligen på växlingen av circRNA-uttryck i ccRCC-vävnader [19, 20], men deras nivåer i flytande biopsi förblir i stort sett okända, vilket hindrar utforskningen av potentiella biomarkörer. Dessutom, även om flera circRNAs, inklusive circHIAT1 [21], circ-AKT3 [22] och cRAPGEF5 [23], har visat sig spela viktiga roller i initieringen och progressionen av ccRCC [18], systematisk undersökning av circRNAs inblandade i ccRCC utveckling, liksom deras underliggande molekylära mekanismer, saknas fortfarande.

Här bestämde vi först uttrycket av circRNAs i serumprover från ccRCC-patienter och friska kontroller med hjälp av en circRNA-mikroarray. Betydligt nog identifierade vi en ny ccRCC-associerad circRNA circDVL1 (kadaver-ID: hsa_circ_ 0009267), som kodas i DVL1-genen. CircDVL1 reduceras signifikant i serum från ccRCC-patienter, och dess uttryck är omvänt korrelerat med ccRCC Fuhrman-gradering, vilket tyder på potentialen som en biomarkör. Dessutom minskar CircDVL1 i ccRCC-tumörvävnader. På motsvarande sätt kan circDVL1 hämma proliferation, inducera cellcykelstopp, utlösa apoptos och minska ccRCC-cellmigrering och invasion. Mekanistiskt fungerar circDVL1 som en miR-412-3p-svamp för att uppreglera PCDH7-uttryck. Sammantaget identifierar dessa fynd circDVL1 som en tumörsuppressor för ccRCC och föreslår dess potential som både en diagnostisk biomarkör och ett terapeutiskt mål.

Cistanche tillägg

Material och metoder

1. Kliniska prover

Den här studien godkändes av etikkommittén vid Zhejiang Universitys First Affiliated Hospital (2021-104). Arton matchade prover av ccRCC och intilliggande icke-tumörvävnader samlades in från ccRCC-patienter. Proverna bevarades snabbt i flytande kväve efter operationen och förvarades sedan i -80 grad tills vidare användning. Serumprover från 60 ccRCC-patienter och 66 friska kontroller samlades in. Därefter bearbetades proverna med hjälp av lämpliga metoder och det erhållna serumet lagrades i -80 grad tills vidare användning.

2. Cellinjer och cellodling

Alla cellinjer köptes från National Collection of Authenticated Cell Cultures (Kina). 786-O- och Caki-1-celler odlades i RPMI 1640 (HyClone), ACHN-celler odlades i MEM (HyClone) och 293T-celler odlades i DMEM (Gibco)-media. Alla cellodlingsmedier kompletterades med 10 procent fetalt bovint serum (Gibco) och 1 procent penicillin och streptomycinblandning (Gibco). Cellkulturer hölls i en fuktad inkubator vid 37 grader och 5 procent CO₂.

3. CircRNA-mikroarrayanalys

CircRNA-mikroarrayprofilering i serumprover utfördes med användning av en Arraystar human CircRNA Array V2 (Capital Biotechnology, Kina). GeneSpring programvara V13.0 (Agilent Technologies) användes för datasammanfattning, normalisering och kvalitetskontroll av mikroarrayer. CircRNA med ett tröskelvärde för veckändringen på större än eller lika med 2 och mindre än eller lika med -2 ​​och P-värde < 0.05 ansågs som statistiskt signifikanta. Hierarkisk klusteranalys utfördes med hjälp av standardiserat euklidiskt avstånd med fullständig koppling.

4. RNA-sekvensering (RNA-seq) och dataanalys

Nästa generations RNA-seq utfördes som tidigare beskrivits [24, 25]. miR-412-3p och kontrollmimiktransfekterade 786-0-celler användes för RNA-sekvensering. Bibliotekskonstruktion och bioinformatikanalyser av rådata utfördes av Novogene Co., Ltd. (Peking, Kina). RNA-sekvensdata deponerades i Gene Expression Omnibus (GEO) under accessionsnummer GSE175492.

5. RNA-extraktion och kvantitativ RT-PCR i realtid (RT-qPCR)

RT-qPCR utfördes som beskrivits tidigare [26, 27]. Totalt RNA isolerades från serum, celler och tumörvävnader med användning av AG RNAex Pro Reagent (AG, Hunan, Kina). För circRNA-detektion spjälkades 1 ug totalt RNA med RNase R (3 U/ug, Epicenter Technologies, Madison, USA, Cat#RNR07250) vid 37 grader i 10 minuter, och komplementärt DNA (cDNA) genererades med användning av HiScript II 1:a Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme). CircRNA- och mRNA-expressionsnivåer normaliserades till -aktin. För att bestämma miRNA-uttryck utfördes omvänd transkription med ett miR-XTM miRNA First-strand Synthesis-kit (Takara Bio USA, CA, USA, Kat. #638313) med U6 (Rnu6–1) uttryck som en endogen kontroll. Den relativa RNA-expressionsnivån bestämdes med 2-ΔΔCt-metoden. Alla QRT-PCR-analysprimersekvenser visas i Tabell S2.

6. Plasmidkonstruktion och stabil transfektion

För att konstruera circDVL1- och circDVL1-MUT-överexpressionsvektorn, klonades circDVL1- och den muterade circDVL1-sekvensen in i pcDNA 3.1(plus) Laccase 2 MCS Exon-vektorn, som beställdes från Addgene (#69893) [28]. ACHN- och 786-O-celler transfekterades med circRNA och negativa kontrollvektorer med användning av Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Efter 48 timmar selekterades stabilt transfekterade celler som uttrycker circDVL1 genom tillsats av 800 ug/ml G418 till odlingsmediet.

7. Cellviabilitet

Cellviabilitetsanalys bestämdes med CCK8-kitet (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan, Kat # CK04), som tidigare beskrivits [29]. 786-O och ACHN circDVL1 överuttryckande och kontrollceller såddes i 96-brunnsplattor. CCK8-lösning (10 μL) tillsattes vid den angivna tiden och inkuberades vid 37 grader i 2 timmar, och absorbansen mättes med en spektrofotometer.

Herba Cistanche

8. Kolonibildning

Kolonibildningsanalyser utfördes som beskrivits tidigare [24]. ACHN (800 celler/brunn) och 786-O-celler (400 celler/brunn) odlades i 10 dagar och fixerades därefter med 4 procent paraformaldehyd i cirka 30 minuter, följt av färgning med 0,1 procent kristallviolett lösning i cirka 15 min. Kloner innehållande mer än 50 celler räknades som en enda koloni.

9. Cellcykelanalys

Celler synkroniserades i RPMI 1640-medium utan FBS över natten och byttes till medium med 10 procent FBS under de kommande 48 timmarna. Cellerna tvättades, återsuspenderades i 70 procent etanol i PBS och lagrades vid -20 grad över natten. Därefter färgades cellerna med propidiumjodid (PI) lösning innehållande RNas A för cellcykelanalys.

10. Apoptosanalys

ACHN- och 786-O-cellapoptosanalys utfördes med ett Annexin V-FITC/PI-apoptosdetektionskit (Beijing Biosea Biotechnology, Kina) enligt tillverkarens instruktioner.

11. Cellmigrerings- och invasionsanalyser

In vitro utvärderades cellmigrationskapacitet med användning av transwell-kammare med 8 μm pore polykarbonatmembran (Millipore, MA, USA). Cellinvasionsanalyser utfördes med transwell-kamrarna belagda med 100 μL Matrigel (BD Biosciences, USA). 786-O-celler (2×104) eller ACHN-celler (4×104) suspenderades i 200 μL RPMI 1640 utan serum och såddes i de övre transwell-kamrarna, och sedan tillsattes 600 μL medium innehållande 20 procent FBS in i de nedre kamrarna. Sedan odlades celler i 24 timmar för att mäta migrationen och i 48 timmar för att utvärdera invasionen. Celler i den övre kammaren skrapades försiktigt och cellerna i bottenfacket fixerades med 4 procent paraformaldehyd och färgades med kristallviolett. Bilder togs och celler räknades med ett mikroskop.

12. Västra blot

Totalt protein extraherades, kvantifierades och separerades på 10 procent SDS-PAGE-geler och överfördes sedan till polyvinylidendifluoridmembran (Millipore, MA, USA), som inkuberades med primärt antiglyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) (Proteinch, 60004-1-Ig), anti-PCDH7 (Abcam, ab139274) primära antikroppar vid 4 grader över natten.

13. Immunfluorescensfärgning

Celler såddes på täckglas i 24 timmar och fixerades med 4 procent paraformaldehyd, permeabiliserades med 0,2 procent Triton X-100 i 20 minuter och inkuberades med 5 procent bovint serumalbumin. Därefter inkuberades celler med en primär antikropp specifik för Ki67 (1:400, ab48027, Abcam) vid 4 grader över natten och inkuberades därefter med en 488-konjugerad get-anti-kanin IgG (1:150, D110088, Sangon) ) vid 37 grader i 1 timme. Cellerna färgades med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), och bilder erhölls med ett Leica-fluorescensmikroskop (DM4000).

14. In vivo tumörbildning och Ki67-färgning

Sex veckor gamla manliga BALB/c nakna möss (köpta från Shanghai SLAC) delades in i 2 grupper (n=5 för varje grupp). Möss inokulerades med ungefär 3x106 kontrollceller eller circDVL1-överuttryckande ACHN-celler genom subkutan injektion. Tumörstorleken mättes med ett glidmått var tredje dag, med start dag 6 efter injektionen. Tumörvolymen beräknades som längd × bredd × höjd/2. Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur (NIH-publikation 80-23, reviderad 1996) och godkändes av Animal Care Committee vid Zhejiang University, Hangzhou, Kina.

Cistanche kapslar

15. Fluorescens in situ hybridisering (FISH)

En circDVL1 dubbel-digoxigenin (DIG)-pepparrotsperoxidas (HRP) sond (Exon Biotechnology, Guangzhou, Kina) syntetiserades. Kontroll- och circDVL1-överuttryckande ACHN-celler odlades på täckglas och inkuberades med den märkta sonden vid 37 grader i 24 timmar. Efter tvättning inkuberades objektglasen i en anti-DIG sekundär antikropp vid 37 grader under 1 timme. En tyraminsignalförstärkningsmetod användes för att detektera circDVL1-signaler och celler motfärgades med DAPI. För co-FISH inkuberades täckglasen med DIG-märkt circDVL1 och biotinmärkt miR-412-3s.

16. RNA-immunutfällningsanalys (RIP).

RIP-analyser utfördes med Magna RIP™ RNA-bindande protein Immunoprecipitation Kit (Millipore, MA, USA). 786-O-celler lyserades i komplett RIP-lysbuffert och inkuberades sedan med immunutfällningsbuffert innehållande magnetiska pärlor som konjugerades med AGO2 (Abcam, MA, USA) eller IgG-antikroppskomplex vid 4 grader över natten. Sedan testades immunutfällda RNA med RT-qPCR.

17. Dubbelluciferasreporteranalys

CircDVL1, PPM1H-3'UTR och PCDH7-3'UTR-sekvenser, som innehöll muterade miR-412-3p-bindningsställen och deras motsvarande muterade sekvenser, syntetiserades och subklonades sedan in i luciferasreportern vektor psiCHECK-2 (Promega) för att producera circDVL1-WT, circDVL1-Mut1, circDVL1-Mut2, PPM1H-3'UTR-WT, PCDH{ {14}}'UTRWT, PCDH7-3'UTR-Mut1 och PCDH7-3'UTR-Mut2 vektorer. De olika 3'UTR-sekvenserna av PPM1H och PCDH7 innehåller 500 bp-fragmentet innehållande potentiella miR-412-3p-bindningsställen (flankerade av 250 bp). Den relativa luciferasaktiviteten utvärderades med en dubbelluciferasreporteranalys (Promega, USA). Alla analyser utfördes i tre oberoende replikat.

18. Statistisk analys

Statistiska analyser utfördes med GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Skillnaderna mellan grupperna bedömdes med Students t-test eller envägsvariansanalys (ANOVA). Skillnader mellan grupper ansågs vara statistiskt signifikanta när P-värden var < 0.05.

Diskussion

Olika typer av ccRCC-biomarkörer har föreslagits och utvärderats experimentellt, inklusive mRNAs [32], miRNAs [33], lncRNAs [34] och circRNAs [35]. Ingen av dem har dock bekräftats som korrekta diagnostiska biomarkörer för rutinmässig klinisk användning hos ccRCC-patienter. Här illustrerade vår studie att circDVL1 spelar en viktig roll i ccRCC-progression. Först screenade vi serum från ccRCC-patienter och friska kontroller för att identifiera differentiellt uttryckta circRNAs med hjälp av en circRNA-mikroarray. RT-qPCR-data avslöjade att circDVL1 var dramatiskt nedreglerad i ccRCC-prover. Tidigare studier har visat att circRNA kan fungera som latenta serumbiomarkörer i olika cancerformer [36, 37]. Till exempel beskriver Bei et al. visade att exosomal has-circ-0004771 ökade i serum som samlats in från kolorektalcancerpatienter [38]. Ändå är forskningen om den specifika rollen av circRNA som en icke-invasiv biomarkör i ccRCC fortfarande begränsad. Vår studie visade att circDVL1 var signifikant nedreglerad i serum från ccRCC-patienter och att det minskade uttrycket av serum circDVL1 kan vara tumörhärledd. Dessutom hade circDVL1-nivån i serum signifikant diagnostiskt värde för att skilja mellan patienter med Fuhrman grad I-II och Fuhrman grad III-IV tumörer. Därför kan serum circDVL1 vara en lovande diagnostisk markör för ccRCC. Flera friska patienter visade dock låga nivåer av circDVL1 i sitt serum, vilket indikerar att patientövervakning enbart baserat på analysen av detta cirkulerande RNA kan resultera i falskt positiva resultat. Därför är värdet av circDVL1 som en enda diagnostisk markör något begränsat och en kombination av olika cirkulerande RNA kan behöva analyseras för att få en tillförlitlig förutsägelse för tumörutveckling och metastaser.

Som ett nyligen identifierat circRNA hade den biologiska och patologiska rollen för circDVL1 inte undersökts. I denna studie utvärderade vi rollen och regleringsmekanismen för circDVL1 i ccRCC. Funktionella analyser visade att överuttryckt circDVL1 kunde minska ccRCC-cellproliferation, kolonibildningsförmåga och tumörframkallande potential, troligtvis på grund av ökad cellapoptos in vitro och undertryckt tumörutveckling in vivo. Data antydde att circDVL1 kunde ha en tumörsuppressorfunktion i ccRCC.

CircRNA kan främja tumörinitiering och progression genom att fungera som miRNA-svampar. Därför undersökte vi om circDVL1 kunde reglera miRNA-biogenes under ccRCC-karcinogenes. Med hjälp av programvaran miRanda och miRWalk fann vi att circDVL1 hade en potentiell bindningsplats för miR-412-3s. Luciferasreporteranalyser visade en direkt koppling mellan circDVL1 och miR-412-3s. Tidigare studier har visat att miR-412-3p var involverad i patogenesen av olika cancerformer genom olika molekylära mekanismer [31, 39, 40]. Till exempel hade miR-412-3p en onkogen roll i tjocktarmscancer, vilket främjade migration, invasion och cellproliferation av cancerstamceller [31]. Dessutom uppreglerades miR-412-3p-uttryck i extracellulära vesiklar från patienter med oral skivepitelcancer (OSCC) [39]. På liknande sätt antydde våra resultat att miR-412-3p var en viktig tumörpromotor i ccRCC.

Cistanche pulver

Dessutom identifierades målet för circDVL1/miR-412-3p också. Protocadheriner (PCDH) är transmembranproteiner som tillhör superfamiljen cadherin, som spelar betydande roller i cellvidhäftning och signalvägar. PCDH7 är en medlem av PCDH-familjen och har väletablerade roller i cell-celligenkänning och celladhesion [41]. Det är allmänt känt att förlust av vidhäftning är ett tidigt steg i tumörcellsinvasion och metastasering. Nya bevis tyder på att PCDH7 är avvikande uttryckt i en mängd olika tumörtyper. Till exempel, i human icke-småcellig lungcancer, var PCDH7 ofta överuttryckt och fungerade som en onkogen för att inducera cellulär transformation och främja lungtumörbildning genom att potentiera MAPK-signalering [42]. Omvänt, PCDH7 hämmade migration och invasion av magcancerceller via E-cadherin [43]. Dessutom har minskat PCDH7-uttryck hittats i kolorektal [44] och urinblåsa cancer [45]. Dessa data indikerade att PCDH7 hade olika funktioner i distinkta tumörtyper. I denna studie visade vi att PCDH7-nivåer reducerades i ccRCC-tumörprover. Intressant nog visade funktionella räddningsexperiment att tumörsuppressoregenskaperna hos circDVL1 delvis beror på dess effekt på PCDH7. Vår studie tyder starkt på vikten av circDVL1/miR-412-3p/PCDH7 regleringsaxeln i ccRCC-progression.

Denna studie har flera begränsningar. Vi testade tre specifika siRNA för endogent circDVL1, men tyvärr misslyckades alla dessa siRNA att slå ner circDVL1 förmodligen på grund av den unika strukturen hos detta circRNA, såväl som dess låga basala uttryck i ccRCC-celler. Dessutom visade våra resultat att circDVL1 kan vara ett terapeutiskt mål hos ccRCC-patienter, kliniska studier med stora kohorter av patienter krävs för att ytterligare visa dess kliniska betydelse. I vår studie undersökte vi inte orsaken till nedregleringen av circDVL1 i ccRCC-lesioner. Det har rapporterats att RNA-bindande proteiner (RBP), inklusive quaking (QKI), epitelial-splicing regulatory protein 1 (ESRP1) och fused-in-sarcoma (FUS) är involverade i posttranskriptionell bildning av circRNAs [{{10 }}]. Dessutom är vissa transkriptionsfaktorer (t.ex. ZEB1, c-Myb och c-Jun) också inblandade i biogenesen av specifika circRNAs [49-52]. Studier har också visat att m6A-modifiering medierar circRNA-nedbrytning. Park et al. rapporterade att m6A-modifierade circRNAs också nedreglerades via en YTHDF2- HRSP12-RNase P/MRP-axel [53]. Huruvida dessa RBP, transkriptionsfaktorer och m6A-metylering är involverade i nedregleringen av circDVL1 är fortfarande osäkert. I vår framtida forskning kommer vi att försöka utforska den uppströms reglerande mekanismen för circDVL1 i ccRCC-utveckling och tumörbildning.

Sammanfattningsvis visade vi att circDVL1-nivån reducerades i serum från ccRCC-patienter. Noterbart undersökte vi ytterligare de reglerande mekanismerna för circDVL1 och visade att circDVL1 undertryckte ccRCC-tumörbildning genom att främja PCDH7-uttryck genom att sponga miR -412-3p. Därför visade vår studie att circDVL1 kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål för framtida ccRCC-behandlingar.

Referenser

1.Cheng SK, Chuah KL. Metastaserande njurcellscancer i bukspottkörteln: en recension. Arkiv för patologi och laboratoriemedicin. 2016; 140: 598-602.

2. Jonasch E, Walker CL, Rathmell WK. Clear cell renal cell carcinom ontogeni och mekanismer för dödlighet. Nat Rev Nephrol. 2021; 17: 245-61.

3. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancerstatistik, 2020. CA Cancer J Clin. 2020; 70.

4. Shuch B, Amin A, Armstrong AJ, Eble JN, Ficarra V, Lopez-Beltran A, et al. Förstå patologiska varianter av njurcellscancer: destillering av terapeutiska möjligheter från biologisk komplexitet. Europeisk urologi. 2015; 67: 85-97.

5. Koul H, Huh JS, Rove KO, Crompton L, Koul S, Meacham RB, et al. Molekylära aspekter av njurcellscancer: en översyn. Am J Cancer Res. 2011; 1: 240-54.

6. Sanchez-Gastaldo A, Kempf E, Gonzalez Del Alba A, Duran I. Systemisk behandling av njurcellscancer: En omfattande översyn. Cancer Treat Rev. 2017; 60: 77-89.

7. Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. Biogenes, biologi och karakterisering av cirkulära RNA. Naturrecensioner Genetik. 2019; 20: 675-91.

8. Patop IL, Wüst S, Kadener S. Tidigare, nutid och framtid för circRNAs. EMBO-tidningen. 2019; 38: e100836.

9. Perez de Acha O, Rossi M, Gorospe M. Circular RNAs in Blood Malignancies. Front Mol Biosci. 2020; 7:109.

10. Zhang SJ, Chen X, Li CP, Li XM, Liu C, Liu BH, et al. Identifiering och karakterisering av cirkulära RNA som en ny klass av förmodade biomarkörer vid diabetesretinopati. Undersökande oftalmologi & bildvetenskap. 2017; 58: 6500-9.

11. Bahn JH, Zhang Q, Li F, Chan TM, Lin X, Kim Y, et al. Landskapet av mikroRNA, Piwi-interagerande RNA och cirkulärt RNA i mänsklig saliv. Klinisk kemi. 2015; 61: 221-30.

12. Li Y, Zheng Q, Bao C, Li S, Guo W, Zhao J, et al. Cirkulärt RNA är berikat och stabilt i exosomer: en lovande biomarkör för cancerdiagnos. Cellforskning. 2015; 25: 981-4.

13. Li S, Han L. Cirkulära RNA som lovande biomarkörer i cancer: upptäckt, funktion och vidare. Genommedicin. 2019; 11:15.

14. Ye Q, Ling S, Zheng S, Xu X. Vätskebiopsi i hepatocellulärt karcinom: cirkulerande tumörceller och cirkulerande tumör-DNA. Mol Cancer. 2019; 18:114.

15. Wen G, Zhou T, Gu W. Potentialen med att använda blodcirkulärt RNA som en flytande biopsibiomarkör för mänskliga sjukdomar. Proteincell. 2020.

16. Zhang Z, Yang T, Xiao J. Cirkulära RNA: lovande biomarkörer för mänskliga sjukdomar. EBioMedicine. 2018; 34: 267-74.

17. Wang S, Zhang K, Tan S, Xin J, Yuan Q, Xu H, et al. Cirkulära RNA i kroppsvätskor som cancerbiomarkörer: den nya gränsen för flytande biopsier. Mol Cancer. 2021; 20:13.

18. Wang Y, Zhang Y, Wang P, Fu X, Lin W. Cirkulära RNA i njurcellscancer: implikationer för tumörbildning, diagnos och terapi. Mol Cancer. 2020; 19:149.

19. Chen D, Chen W, Xu Y, Zhu M, Xiao Y, Shen Y, et al. Uppreglerad immunkontrollpunkt HHLA2 i klarcellig njurcellscancer: en ny prognostisk biomarkör och potentiellt terapeutiskt mål. J Med Genet. 2019; 56: 43-9.

20. Lv Q, Wang G, Zhang Y, Shen A, Tang J, Sun Y, et al. CircAGAP1 främjar tumörprogression genom att sponga miR-15-5p i klarcellig njurcellscancer. J Exp Clin Cancer Res. 2021; 40:76.

21. Wang K, Sun Y, Tao W, Fei X, Chang C. Androgenreceptor (AR) främjar migration och invasion av njurcellscancer (ccRCC) genom att förändra circHIAT1/miR-195-5p/29a{{ 4}}p/29c-3p/CDC42-signaler. Cancer bokstäver. 2017; 394: 1-12.

22. Xue D, Wang H, Chen Y, Shen D, Lu J, Wang M, et al. Circ-AKT3 hämmar klarcellig njurcellscancermetastas genom att ändra miR-296-3p/E-cadherin-signaler. Molekylär cancer. 2019; 18:151.

23. Chen Q, Liu T, Bao Y, Zhao T, Wang J, Wang H, et al. CircRNA cRAPGEF5 hämmar tillväxten och metastaseringen av njurcellscancer via miR-27a-3p/TXNIP-vägen. Cancer bokstäver. 2019; 469: 68-77.

24. Guo X, Lin W, Wen W, Huyghe J, Bien S, Cai Q, et al. Identifiering av nya känslighetsgener för kolorektal cancerrisk från en transkriptomomfattande associationsstudie av 125 478 försökspersoner. Gastroenterologi. 2021; 160.

25. Wang J, Nie W, Xie X, Bai M, Ma Y, Jin L, et al. MicroRNA-874-3p/ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) 19 medierar makrofagaktivering och njurfibros efter akut njurskada. Hypertoni. 2021; 77: 1613-26.

26. Kun-Peng Z, Chun-Lin Z, Jian-Ping H, Lei Z. En ny cirkulerande hsa_cirkel_0081001 fungerar som en potentiell biomarkör för diagnos och prognos av osteosarkom. Int J Biol Sci. 2018; 14: 1513-20.

27. Yuan Y, Bao J, Chen Z, Villanueva AD, Wen W, Wang F, et al. Multi-omics analys för att identifiera känslighetsgener för kolorektal cancer. Hum Mol Genet. 2021.

28. Kramer MC, Liang D, Tatomer DC, Gold B, March ZM, Cherry S, et al. Kombinatorisk kontroll av Drosophila cirkulärt RNA-uttryck genom introniska upprepningar, hnRNPs och SR-proteiner. Genes Dev. 2015; 29: 2168-82.

29. Guo X, Lin W, Bao J, Cai Q, Pan X, Bai M, et al. En omfattande cis-eQTL-analys avslöjade målgener i känslighetslokaler för bröstcancer identifierade i genomomfattande associationsstudier. Am J Hum Genet. 2018; 102: 890-903.

30. Zhong S, Wang J, Zhang Q, Xu H, Feng J. CircPrimer: en programvara för att kommentera circRNA och bestämma specificiteten hos circRNA-primrar. BMC Bioinformatik. 2018; 19:292.

31. Zhu K, Wang Y, Liu L, Li S, Yu W. Långt icke-kodande RNA MBNL1-AS1 reglerar proliferation, migration och invasion av cancerstamceller i tjocktarmscancer genom att interagera med MYL9 via svampande mikroRNA -412-3s. Kliniker och forskning inom hepatologi och gastroenterologi. 2020; 44: 101-14.

32. Schrödter S, Braun M, Syring I, Klümper N, Deng M, Schmidt D, et al. Identifiering av dopamintransportören SLC6A3 som en biomarkör för patienter med njurcellscancer. Molekylär cancer. 2016; 15:10.

33. Ran L, Liang J, Deng X, Wu J. miRNAs i förutsägelse av prognos vid klarcellig njurcellscancer. Biomed Res Int. 2017; 2017: 4832931.

34. Li JK, Chen C, Liu JY, Shi JZ, Liu SP, Liu B, et al. Långt icke-kodande RNA MRCCAT1 främjar metastasering av klarcellig njurcellscancer genom att hämma NPR3 och aktivera p38-MAPK-signalering. Molekylär cancer. 2017; 16:111.

35. Sheng JQ, Liu L, Wang MR, Li PY. Cirkulära RNA vid cancer i matsmältningssystemet: potentiella biomarkörer och terapeutiska mål. Am J Cancer Res. 2018; 8: 1142-56.

36. Vea A, Llorente-Cortes V, de Gonzalo-Calvo D. Circular RNAs in Blood. Adv Exp Med Biol. 2018; 1087: 119-30.

37. Vo JN, Cieslik M, Zhang Y, Shukla S, Xiao L, Zhang Y, et al. Landskapet av cirkulärt RNA i cancer. Cell. 2019; 176.

38. Pan B, Qin J, Liu X, He B, Wang X, Pan Y, et al. Identifiering av serum Exosomal has-circ-0004771 som en ny diagnostisk biomarkör för kolorektal cancer. Främre Genet. 2019; 10:1096.

39. Gai C, Camussi F, Broccoletti R, Gambino A, Cabras M, Molinaro L, et al. Saliv extracellulära vesikelassocierade miRNA som potentiella biomarkörer i oral skivepitelcancer. BMC Cancer. 2018; 18:439.

40. Lenherr SM, Tsai S, Silva Neto B, Sullivan TB, Cimmino CB, Logvinenko T, et al. MicroRNA-uttrycksprofil identifierar höggradiga, icke-muskelinvasiva blåstumörer med förhöjd risk att utvecklas till en invasiv fenotyp. Gener (Basel). 2017; 8.

41. Yoshida K. Fibroblastcellsform och vidhäftning in vitro förändras genom överuttryck av 7a och 7b isoformerna av protokadherin 7, men inte 7c isoformen. Cell Mol Biol Lett. 2003; 8: 735-41.

42. Zhou X, Updegraff BL, Guo Y, Peyton M, Girard L, Larsen JE, et al. PROTOCADHERIN 7 Verkar genom SET och PP2A för att förstärka MAPK-signalering av EGFR och KRAS under lungtumörbildning. Cancer Res. 2017; 77: 187-97.

43. Chen HF, Ma RR, He JY, Zhang H, Liu XL, Guo XY, et al. Protocadherin 7 hämmar cellmigration och invasion genom E-cadherin vid magcancer. Tumör Biol. 2017; 39: 1010428317697551.

44. Bujko M, Kober P, Mikula M, Ligaj M, Ostrowski J, Siedlecki JA. Expressionsförändringar av cell-celladhesionsrelaterade gener i kolorektala tumörer. Oncol Lett. 2015; 9: 2463-70.

45. Lin YL, Wang YL, Fu XL, Li WP, Wang YH, Ma JG. Lågt uttryck av protocadherin7 (PCDH7) är en potentiell prognostisk biomarkör för primär icke-muskelinvasiv blåscancer. Oncotarget. 2016; 7: 28384-92.

46. ​​Conn SJ, Pillman KA, Toubia J, Conn VM, Salmanidis M, Phillips CA, et al. Det RNA-bindande proteinet quaking reglerar bildandet av circRNA. Cell. 2015; 160: 1125-34.

47. Errichelli L, Dini Modigliani S, Laneve P, Colantoni A, Legnini I, Capauto D, et al. FUS påverkar cirkulärt RNA-uttryck i murina embryonala stamcellshärledda motorneuroner. Nat Commun. 2017; 8: 14741.

48. Yu CY, Li TC, Wu YY, Yeh CH, Chiang W, Chuang CY, et al. Det cirkulära RNA:t circBIRC6 deltar i det molekylära kretssystemet som kontrollerar mänsklig pluripotens. Nat Commun. 2017; 8:1149.

49. Lee YH, Kim HS, Kim JS, Yu MK, Cho SD, Jeon JG, et al. C-my reglerar autofagi för pulpans vitalitet vid glukosoxidativ stress. J Dent Res. 2016; 95: 430-8.

50. Li Q, Wang Y, Wu S, Zhou Z, Ding X, Shi R, et al. CircACC1 Reglerar montering och aktivering av AMPK-komplex under metabol stress. Cell Metab. 2019; 30.

51. Ren C, Zhang Z, Wang S, Zhu W, Zheng P, Wang W. Cirkulärt RNA hsa_circ_0001178 underlättar invasionen och metastaseringen av kolorektal cancer genom att uppreglera ZEB1 genom att sponga flera miRNA. Biol Chem. 2020; 401: 487-96.

52. Zeng K, Chen X, Xu M, Liu X, Hu X, Xu T, et al. CircHIPK3 främjar tillväxt och metastasering av kolorektal cancer genom att sponga miR-7. Celldöd Dis. 2018; 9:417.

53. Park OH, Ha H, Lee Y, Boo SH, Kwon DH, Song HK, et al. Endoribonukleolytisk klyvning av mA-innehållande RNA genom RNase P/MRP-komplex. Mol Cell. 2019; 74.

Ying Wang1,2, Yunjing Zhang1,2, Xinwan Su3, Qiongzi Qiu4, Yuan Yuan2, Chunhua Weng2, Sailan Zou5, Yan Tian5, Weidong Han6, Pengyuan Liu4, Xingyi Guo7, Jianhua Mao8, Xianghui Pqing W5, Wei

1. The Fourth Affiliated Hospital och International Institutes of Medicine, Zhejiang University School of Medicine, Jinhua 322000, Zhejiang, Kina.

2. Kidney Disease Center, det första anslutna sjukhuset och Institutet för Translationell Medicin, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, Kina.

3. Urologiska avdelningen, det första anslutna sjukhuset, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, Kina.

4. Institutionen för andningsmedicin, Sir Run Run Shaw Hospital och Institute of Translational Medicine, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310016, Zhejiang, Kina.

5. Avdelningen för endokrinologi och metabolism, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University och Collaborative Innovation Center of Biotherapy, Chengdu 610041, Sichuan, Kina.

6. Institutionen för medicinsk onkologi, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310016, Zhejiang, Kina.

7. Avdelningen för epidemiologi, Institutionen för medicin, Vanderbilt Epidemiology Center och Vanderbilt-Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville 37203, TN, USA.

8. Department of Nephrology, National Clinical Research Center for Child Health, Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, Kina.