Hur man studerar den genetiska mångfalden hos Herba Cistanches?
Mar 14, 2022
Studie om genetisk mångfald av Herba Cistanches av RAPD
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da
(Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medicine, Peking 100700)
Abstrakt
Ändamål:Att studera befolkningengenetisk mångfaldavCistanche deserticolaochCistanche tubulosa.
Metoder:Två vilda populationer avCistanche deserticolaoch fyra vilda populationer avCistanche tubulosaanalyserades av RAPD, ochgenetisk mångfaldav populationerna analyserades med mjukvaruversion 1.31 av POPGENE.
Resultat:Den genomsnittliga andelen polymorfa loci avCistanche deserticolavar 47,37 procent, de polymorfa ställena för de två populationerna var 39,47 procent och 35,53 procent, och den genomsnittliga Neis gendiversitet var 0.135 8. Shannons s var mer. Statusinformationsindexet är 0.207 2, och gendifferentieringskoefficienten Gst {{1{{20}}}}.254 6. Den genomsnittliga andelen polymorfa loci i Cistanche var 27,59 procent, och andelen polymorfa loci i varje population varierade från 19,54 procent till 25,29 procent, av vilka Andier-populationen hade den högsta 25,29 procent, och den genomsnittliga Neis gendiversitet var 0. { {21}}, Shannons polymorfisminformationsindex är 0,1258, gendifferentieringskoefficient Gst =0.175 5.
Slutsats:Cistanche deserticolaochCistanche tubulosahar en viss differentiering mellan populationer. Degenetisk mångfaldDesert Cistanche är betydligt högre än Cistanche tubulosa och har differentierats i två ekotyper.
Nyckelord: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; genetisk mångfald
[Chinese Library Classification Number] S 567 [Document Identification Code] A [Artikelnummer] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Cistanche är en parasitisk växt som tillhör släktet Cistanche i familjen Lidanaceae, även känd som Dayun, vilket är ett dyrbart kinesiskt läkemedelsmaterial. De viktigaste källorna till Cistanche deserticola i mitt land ärCistanche deserticolaYCMa och C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Värdväxterna i Cistanche deserticola är Haloxylon ammodendron och Haloxylon ammodendron, som huvudsakligen distribueras i Alashan League i Inre Mongoliet, norra Xinjiang, Qinghai, Gansu och andra platser. Fördelningen av Cistanche deserticola är densamma som för värdväxterna. I mitt land distribueras Cistanche cistanche endast i län runt Taklimakanöknen söder om Tianshanbergen i Xinjiang, och dess distribution är inte helt synkroniserad med värden Tamarix. Andra regioner som norra Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Inre Mongoliet, Shaanxi och andra platser i Tamarix Plants är inte parasitiska Cistanche Tubula[2]. På grund av den snabba ökningen av efterfrågan på Cistanche de senaste åren, vilket resulterat i att dess resurser har utrotats, har vilda cistancheresurser krympt till endast ett fåtal huvudproducerande områden. Båda har listats som hotade skyddade växtarter i mitt land [3], bland annatCistanche deserticolahar inkluderats i CITES bilaga II [4].
Efter flera års forskning har forskningen kring artificiell förädling av Cistanche varit framgångsrik, och den är i stadiet av storskalig marknadsföring och plantering. Men hur man förhindrar nedgången av Cistanche-arter under industriell produktion, hur man återställer den begränsade vilda populationen så snart som möjligt och bevarar värdefulla vilda groddplasmaresurser, är nycklarna för att uppnå dess hållbara användning. När det gäller det skyddade arvet från Cistanche [Mottaget datum], 2004-03-11 [Fondsprojekt] Ministeriet för vetenskap och teknik Socialt välfärdsprojekt (2001.109); Ministeriet för vetenskap och teknik "tionde femårsplanen"-projektet (2001BA701A09a) [Motsvarande författare] * Huang Luqi, tel:( 010) 64014411-2955, e-post: huangluqi @263.net Studiet av överföring pågår fortfarande tom. Denna studie använder RAPD-teknologi för att studera 2 vilda populationer avCistanche deserticolaoch 4 vilda populationer avCistanche tubulosa, och analysera båda Skillnaden igenetisk mångfaldförväntas ge en viktig experimentell genetisk grund för skyddet av Cistanche, en dyrbar kinesisk medicin.
1. Material och metoder
1.1 Material
Cistanche deserticolasamlades in från Jimsar County i Xinjiang och Jilantai-området i Ancient Alxa League i Inre Mongoliet. Cistanche-populationer samlades in från Minfeng County och Yutian County, Xinjiang. Minfeng County är för närvarande det område med den största avkastningen av Cistanche-cistanche, med den högsta tätheten och relativt kompletta samhällen av naturliga skogar. Provtagningspunkter Andil, Sawuzek, Yatongguz och Daheyan i Yutian County är de huvudsakliga produktionsområdena, som ligger i Andirfloden, Yeyikefloden, Yatongguzifloden och Kelaniya I flodens nedre delar är avståndet mellan populationerna mer än 50 km. Varje population tog slumpmässigt urval av 19-30 individer. Proverna torkades snabbt i silikagel och användes för DNA-extraktion (tabell 1).
Tabell 1 Provtagning av populationer och produktionsområden av Cistanche deserticola och Cistanche tubulosa
1.2 DNA-extraktion
Den totala DNA-extraktionsmetoden använder metoden med högt salt, lågt pH [5]. DNA-provet utsattes för en spektrofotometer för att detektera koncentrationen av DNA-mall, sedan användes 1 procent agarosgelelektrofores, EB-färgning, observation och fotografering under ultraviolett ljus, elektrofores-DNA med tydliga band och mindre svans för RAPD-analys.
1.3 Screening av RAPD-primrar
Eftersom experimentet fann att samma primer har en otillfredsställande effekt på den samtidiga amplifieringen av bådaCistanche deserticolaoch Cistanche tubulosa, screenades primrarna oberoende. 150 slumpmässiga primrar (10 bp), 25 μL reaktionssystem från Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. användes för amplifiering och screening; varje primer använde 2 populationsmallar och 1 steriliserat dubbeldestillerat vatten som en blank kontroll och erhöll 10 primers för amplifiering av Cistanche deserticola med tydliga band, stark polymorfism och god repeterbarhet: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 primers avCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 PCR-amplifiering och produktdetektion
De utvalda primrarna användes för att amplifiera mall-DNA:t förCistanche deserticolaochCistanche tubulosagenom PCR. Genomiskt DNA späddes till 50 ng·μL -1 enligt den uppmätta koncentrationen som en mall. Den totala reaktionsvolymen är 25 μL, varav 10 × PCR-buffert 2,5 μL, Mg2 plus 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP-blandning (vardera 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, mall-DNA 1 μL, steriliserat dubbeldestillerat vatten 18,8 μL, ovanstående PCR-amplifieringslösning är produkten av Shanghai Sangon. Amplifiering utfördes på en PTC-100 termisk cykler. Amplifieringsprogrammet var 94 graders fördenaturering under 5 minuter och sedan 40 cykler. Varje cykel inkluderade 94 grader 45 s, 34 grader 1 min, 72 grader 1 min 30 s, och slutligen förlänga vid 72 grader i 5 minuter. De amplifierade produkterna underkastades elektrofores på en 2,0 procent agarosgel (innehållande EB) i 1×TAE-buffert och observerades och fotograferades under SYNGENE-gelbildsystemet.
1.5 Statistik och analys av data
I elektroforesspektrumet jämförs motsvarande position för reaktionsprodukten på gelén enligt molekylviktsstandarden, och molekylvikten för den amplifierade produkten uppskattas. Bandet med bandet registreras som 1, och bandet utan band registreras som 0, bildar en 0/1-matrisgraf och matar in till datorn med POPGENE32 för att beräkna procentandelen polymorfa platser (PPL) för varje population, Neis gendiversitetsindex (H), Shannons polymorfisminformationsindex (I), gendifferentieringskoefficient (Gst), gendiversitet (Ht),Genetisk mångfald(Hs), Neis (1978) genetiska identitet (I) och genetiska avstånd (D) inom en population, och klusteranalys utfördes med UPGMA-metoden.
2. Resultat och analys
2.1 Genetisk mångfald av Cistanche
Alla prover erhöll band med en molekylvikt från 200 till 2 200 bp (Figur 1, 2). Totalt 76 loci upptäcktes i 60 prover från 2 populationer avCistanche deserticola, varav 36 var polymorfa loci, som står för 47,37 procent , H=0.135 8, I=0.207 2. Bland dem är Jimsars PPL 39,47 procent och Gilantys 35,53 procent. H är 0. 0 95 3 och 0.1 070 respektive, och jag är 0.15 12 respektive 0.163 7. Totalt 87 loci upptäcktes i {{20}} individer från 4 populationer av Cistanche, varav 24 var polymorfa loci, vilket motsvarar 27,59 procent , H=0.084 8, I=0.1278. Den högsta PPL var Andil på 25,29 procent, medan PPL var lägre i Savuzek och Yatungusi (båda på 19,54 procent). H är 0.062 1 -0.080 0, jag är 0.095 0 -0.116. Storleken på H och I överensstämmer med storlekstrenden för PPL för varje population, och koefficienterna är de största i Andier, följt av Dayan. I fallet med samma PPL, Savuzeks H=0.{{40}} Summan I=0.097 0 är något högre än 0.{{44 }} och 0.095 0 av Yatunguska (tabell 2).
Figur 1 RAPD-förstärkta band av några prover av ökenCistanche deserticola, primer S490 1-10. garantiprover; 11-20. Jimpster samplar M-DNA-markör (200 - 2 000 bp)
Figur 2 RAPD-amplifierade band av några prover av Cistanche Tubulosa, primer S2 042 1-20. Xinjiang Andier prov M-DNA-markör (200 - 2 000 bp)
Tabell 2 Dengenetisk mångfaldavCistanche deserticolaochCistanche tubulosabefolkningar
2.2 Genetisk variationsanalys av Cistanche
Enligt nivån pågenetisk mångfaldi populationer (Hs), differentiering mellan populationer (Dst) och andelen genetiska skillnader mellan populationer i totala genetiska skillnader (Gst), kan man se att den totala genetiska mångfalden av Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, där Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, varav Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabell 3). Ovanstående resultat indikerar att det finns en viss grad av genetisk variation bland populationerna. Variationen mellan ökenpopulationerna i Cistanche deserticola stod för 25,46 procent av den totala variationen, och variationen av populationerna av Cistanche tubulosa stod för 17,55 procent av den totala variationen.
Tabell 3 Genetisk variationsanalys avCistanche deserticolaochCistanche tubulosa.
2.3 Genetisk avstånds- och klusteranalys bland Cistanche deserticola-populationer
Det genetiska avståndet mellan de två populationerna avCistanche deserticolaär {{0}}.080 0, och den genetiska identiteten är 0.9231. Det genetiska avståndet för de fyra populationerna av Cistanche var 0.012 0-0.031 5, och den genetiska identiteten var 0.9690-0.988 1 (tabell 4) . Grupperingen av Cistanche deserticola och cistanche tubulosa-individer visar att Cistanche deserticola kan grupperas i två distinkta grupper beroende på populationen, medan de olika individerna av cistanche tubulosa inte kan grupperas efter population, vilket också indikerar att den genetiska differentieringen mellan Cistanche deserticola befolkningen är relativt hög. Stor, men den genetiska differentieringen mellan populationer av Cistanche tubulosa är liten.
Tabell 4 Genetisk identitet (nederst till vänster) och genetiskt avstånd (överst till höger) förcistanche tubulosa.
3. Diskussion
3.1 Genetisk mångfald av Cistanche
Nivån avgenetisk mångfaldav växter är oskiljaktig från deras biologiska egenskaper, livsmiljöer, ursprung och evolution. Bland dem är det avelssystem, utbredningsområde, livsform och metoder för spridning av pollen och frön som har störst inflytande [6]. Enligt de statistiska resultaten av allozymdata för 499 växtarter i 165 släkten av Ge Song et al. [7], polymorfismen hos Cistanche på artnivån bör vara cirka 50 procent och polymorfismen på populationsnivån bör vara cirka 40 procent . Runt 0,17. Polymorfismnivåerna som erhölls i detta experiment är alla lägre än dessa medelvärden. Samtidigt, jämfört med nivåerna av polymorfa loci som erhålls med RAPD-metoder för flera vanliga utrotningshotade växter, såsom 32 procent av den hotade arten Silvergran[18], 22,5 procent av dvärgpionen och 27,6 procent av lilapionen [9] ] Det kan ses att den genetiska mångfalden avCistanche deserticola är något lägre än medelnivån, medan den genetiska mångfalden hos Cistanche tubulosa redan är extremt låg.
3.2 Orsaker till låg genetisk mångfald av Cistanche
Cistanche är en specifik parasitisk växt, distribuerad i smala ökenområden samtidigt. Därför kan den unika livsstilen och relativt smala bostadsområdet vara den inneboende orsaken till attgenetisk mångfaldCistanche är i allmänhet lägre än för vanliga växter.
Skillnaden igenetisk mångfaldmellan Cistanche deserticola och Cistanche tubulosa kan relateras till skillnaden i distributionsområdet för de två och om de är synkroniserade med värddistributionen. Utbredningsområdet för Cistanche tubulosa är betydligt mindre än det för Cistanche deserticola, och dess utbredning är extremt osynkroniserad med värdväxten. Studier har visat att det finns en stor mångfald bland Tamarix-arter. Till exempel, Zhang Juan et al. rapporterade att den genetiska mångfalden av Tamarix sibiricus var så hög som 98,7 procent [10], medan den genetiska mångfalden i Cistanche är extremt dålig, vilket indikerar den långsiktiga utvecklingen. Cistanche tubulosa kan ha upplevt allvarliga flaskhalsar i historien, vilket resulterat i förlust av en stor mängdgenetisk mångfald.
Samtidigt konstaterades det enligt utredningar att ingen av deCistanche deserticolainom 20 km från de mänskliga bosättningarna kunde grävas fram och blommade normalt. De stora och små groparna i Cistanche grävdes ut, särskilt i de huvudsakliga produktionsområdena för Cistanche-rörblomman. Därför orsakades det av en stor mängd utgrävningar. Bristen på proveniens och förstörelse av livsmiljöer kan vara de främsta orsakerna till den låga människangenetisk mångfaldav Cistanche.
3.3 Genetisk differentiering av Cistanche
På grund av det geografiska avståndet mellan Xinjiang och Inre Mongoliet orsakade den geografiska isoleringen differentieringen och isoleringen mellanCistanche deserticolapopulationer, och de två populationerna bildade olika genetiskt olika ekotyper på grund av deras anpassning till de lokala habitatförhållandena. På grund av dess smala utbredningsområde och frekventa genutbyten mellan populationer är den genetiska differentieringen mellan populationer mindre än den för Cistanche deserticola.
3.4 Rekommendationer för skydd av Cistanche
Genetisk mångfaldär förutsättningen för arternas långsiktiga överlevnad för att undvika utrotning. Minskningen avgenetisk mångfaldkommer att minska befolkningens förmåga att anpassa sig till miljöförändringar på både kort och lång sikt [11]. Därför är det mycket viktigt att skydda den genetiska mångfalden hos Cistanche för att skydda denna sällsynta och dyrbara kinesiska medicin. Eftersom Cistanche är en art med en speciell ekologisk typ bör den huvudsakligen skyddas in situ, och den naturliga skyddsbasen Cistanche bör etableras i enlighet med dess genetiska mångfald. Till exempel förCistanche tubulosa, eftersom den genetiska mångfalden huvudsakligen kommer inifrån befolkningen, kommer populationer med stor genetisk mångfald att vara de prioriterade skyddsobjekten [12], såsom Minfengs Angier och Yutians Daheyan kan vara Det är listat som en naturlig skyddsbas för Cistanche. När det gällerCistanche deserticola, befolkningarna i Inre Mongoliet och Xinjiang har genomgått betydande förändringar, så experimentell forskning bör stärkas ytterligare för att fastställa vilka populationer som prioriteras för skydd. Utför samtidigt grundläggande forskning om reproduktionsbiologi och pollineringsekologi i Cistanche för att ge information för dess fortsatta skydd.
Referenser
[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. Identifiering avCistancheoch undersökning av kommersiella medicinska material. Chinese Medicinal Materials, 1997, 20(3):117.
[2] Liu Mingting. Omfattande forskning och allmän tillämpning av Tamarix-växter. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.
[3] Fu Guoli. Röda boken av kinesiska växter. Peking: Science Press, 1992.
[4] Förvaltningskontoret för import och export av utrotningshotade arter i Folkrepubliken Kina, Vetenskapliga kommittén för utrotningshotade arter i Folkrepubliken Kina. Konventionen om internationell handel med utrotningshotade arter av vilda djur och växter (CITES), bilaga II. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. Extraktion och identifiering av totalt DNA från flera hotade växter och deras släktingar. Acta Botany, 1994, 36:528.
[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Växtförädlingssystem, genetisk struktur och skydd avgenetisk mångfald. Biodiversity, 1996, 4(2): 92.
[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Växts evolutionsbiologi. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.
[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. RAPD-analys av genetisk mångfald av silvergran. Chinese Science (C), 1997, 40(2): 145.
[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. En preliminär rapport om RAPD-analys av dvärgpion och lila pion. Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.
[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. En förstudie omGenetisk mångfaldav naturliga populationer av Tamarix lansettliknande. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.
[11] Ellstrand NC, Elam D R. Populationsgenetiska konsekvenser av liten populationsstorlek: Implikationer för växtbevarande. Årsöversikt Ecology and Systematics, 1993, 34:217.
[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Principen om populationsgenetik och dess tillämpning i skyddet av sällsynta och hotade växter. Biodiversity, 1999, 7(4): 340.
Från: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29, nummer 8 augusti 2004
