Effekter av cistanche på apoptos dopaminerga neuroner inducerade av neurotoxin 1-metyl-4 -fenylpyridinium (MPP)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Tian Jiyu, Chen Jianzong

(Traditionell kinesisk medicin och kinesisk materia Medica Research Center vid Xijing Hospital, FMMU, Xi'an 710032)

Abstrakt

Mål: För att undersöka effekterna avCistanche på primärkulturens dopaminerga neuron apoptoscell inducerad av 1-metyl-4-fenylpyridinium (MPP plus ). Metod: För att förbereda kaninens serum som består avCistancheanvänder metoden för serumfarmakologi. Analysera sedan effekterna av Cistanche på apoptoscell av DA-neuroner frånMPP plusinducerade modeller med användning av morfologisk, flödescytometri, TUNEL-färgning.Resultat: Behandling av 200μmol/LMPP plusunder 24 timmar eller längre inducerad apoptos i DA-neuroner. EfterMPP plusbehandlade, är apoptoskvoten för gruppen som innehåller en ekvivalent dos av serumet från Cistanche 6,3 procent, gruppen avMPP plusbehandlad ensam är 30,2 procent. Antalet apoptosceller i B- och C-gruppen är signifikant mindre än E-gruppen (P<0.05).>Slutsats: Serumet innehöllCistancheskyddade apoptos DA-neuroner inducerade avMPP plus.

Nyckelord: Cistanche;1-metyl-4-fenylpyridinium(MPP plus); dopaminerga neuroner; apoptos

För närvarande är den huvudsakliga terapin förParkinsons sjukdomär ersättningsterapi av sammansatta levodopa (L-dopa) preparat, som inte kan kontrollera utvecklingen av sjukdomen. När sjukdomen fortskrider ökas dosen och generellt sett minskar den botande effekten inom 3 till 5 år, motoriska symtom fluktuerar och läkemedelsinducerade dyskinesier uppträder. Nyligen genomförda studier har funnit att L-dopa har effekten att inducera apoptos på neuroner odlade in vitro[1, 2], och sedan har det föreslagits att den neurotoxiska effekten av endogent dopamin leder till förlust av dopaminerga neuroner iParkinsons sjukdom. En av anledningarna [3]. I långvarig klinisk praxis har vi använt kinesisk medicin förger näring till levern och njurarnakombinerat med levodopapreparat för att behandla PD och uppnådde goda resultat [4-6]. Detta experiment utforskade den skyddande effekten av traditionell kinesisk medicin på dopaminerga neuronapoptos och dess mekanism från molekylära och cellulära nivåer.

1. Material och metoder

1.1 Material

DMEM medium,1-metyl-4-fenylpyridinium, MPP plus, fetalt bovint serum köpt från Gibco company.Cytarabin, poly-l-lysin, PLLköptes från Sigma Company. 24-brunnsodlingsplatta, 25 cm2

Kulturkolvar av plastköptes från NUNC Company.Den kinesiska medicinenvi användes köptes från Xi'an Decoction Piece Factory. Djur vi använde tillhandahålls av skolans djurcenter.https://www.xjcistanche.com/products

1.2 Beredning och experimentell gruppering av medicinskt serum

Cistanche framställs som ett frystorkat pulver för konservering och späds ut med destillerat vatten när det används. Djurserumet framställdes från Nya Zeelands vita kanin med stor öronserum, som alla var friska män som vägde 2.5-3.0 kg. Den ekvivalenta dosen av djur omvandlas enligt kroppsytan och delas slumpmässigt upp i blank kontrollgruppsserum; 1/2 ekvivalent dosgruppserum (gavagedos av Cistanche-råläkemedelsmaterial 0,8g/kg); motsvarande dosgruppserum(Genagedosen är Cistanche cistanche originalläkemedelsmaterial 1,6 g/kg); 2 gånger motsvarande dos avserum(sondedosen är Cistanche originalläkemedelsmaterial 3,2 g/kg). Gavage två gånger om dagen i totalt 3 dagar, 1 timme efter den sista sondmatningen, karotisblodsläppning, över natten vid 4 grader, centrifugering vid 2500 r/min i 25 minuter, noggrann separering av serum, inaktivering vid 56 grad i 30 minuter och sug genom 0,22 μm filtermembran Filtrera bort bakterier och förvara vid -20 grad . Under samma betingelser framställdes ett blankt kaninkontrollserum genom sondmatning med en lika stor volym normal saltlösning. Experimentet delades in i 5 grupper. Grupp A var en tom kaninserumkulturkontrollgrupp; Grupp B var aserumkultur plus MPPbehandlingsgrupp innehållande 2 gånger den ekvivalenta dosen; Grupp C var enserumkultur plus MPPbehandlingsgrupp innehållande en ekvivalent dos; Grupp D var en serumkulturkontrollgrupp innehållande 1/2 ekvivalent dos av serumkultur plus MPP-behandlingsgrupp; E-gruppen är blank kaninserumkultur plus MPP-behandlingsgrupp.

Cistanche förmån

1.3 Odling av mellanhjärnans dopaminerga neuroner

Tre SD-råttor av 14 dagars dräktighet valdes ut och dödades genom direkt injektion av luftemboli i hjärtat; de embryonala råttorna togs ut under aseptiska förhållanden och placerades i en petriskål fylld med is-D-Hanks-lösning. Den fetala råtthjärnvävnaden dissekerades och separerades under ett stereomikroskop. Referensmetoden [7] förbättrades något. Hjärnhinnorna och kärlvävnaden skalades av och vävnaderna i A8-, A9- och A10-områdena i den ventrala mitthjärnan separerades. Tillsätt 1 ml 0,125 procent pankreatin och placera det i en 37 graders inkubator i cirka 20 minuter, tillsätt en lämplig mängd odlingsmedium innehållande 10 procent fetalt bovint serum för att avsluta matsmältningen och använd aspiration

Pipettera röret till en enhetlig cellsuspension, centrifugera vid 15 00r/min i 5 minuter vid rumstemperatur, avlägsna försiktigt supernatanten, pipettera 15 gånger med en tunnhalsad pipett och låt den stå i 5 minuter. I 24-brunnens odlingsplatta av lysin, tillsätt odlingsmedium till varje brunn för att justera celldensiteten till 2×105 celler/ml, tillsätt odlingsmedium till 0,5 ml per brunn och tillsätt cytarabin efter 3 dagars odling ( slutkoncentrationen är 10μmol/L), hämmar tillväxten av icke-neuroner.

1.4 Tyrosinhydroxylas (TH) immuncytokemisk färgning

Med hjälp av SABC-metoden innehåller antikroppsspädningsmedlet bovint serumalbumin 1g/100mL (Boster Company, Wuhan), 0,3 procent Triton-100 (Sigma, USA), NaN3 80mg/ 100 ml, utspädd med PBS till 100 ml, justera pH till 7,6. Odlingen avslutades på den 7:e dagen, tvättades med D-PBS i 5 minuter 3 gånger, nyberedd 4 procent paraformaldehyd fixerades vid rumstemperatur under 30 minuter och tvättades med D-PBS i 5 minuter 3 gånger; med 1:1:8 väteperoxid, metanol och PBS-lösning Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur, skölj med D-PBS i 5 minuter, tillsätt 5 procent blockerande getserum i 30 minuter vid rumstemperatur, skölj med D-PBS i 5 minuter, och tillsätt get-anti-mus TH-antikropp utspädd med antikroppsspädningsmedel (1:1000 spädning, Calbiochem) ), över natten vid 4 grader, skölj med D-PBS i 3 minuter 3 gånger, tillsätt biotinylerad mus-anti-rått-IgG utspädd med antikropp spädningsmedel (utspädd 1:200, Sigma USA), agera vid rumstemperatur i 4 timmar, skölj med D-PBS i 3 minuter 3 gånger, tillsätt HRP-komplexet utspätt med antikroppsspädningsmedel i 2 timmar vid rumstemperatur, och skölj med D-PBS i 3 min 3 gånger. Skölj DAB-spädningsmedlet i 3 minuter, tillsätt det färdiga DAB-kromogena reagenset (Wuhan Boster Company) i cellerna och observera färgen under ett inverterat mikroskop.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Läkemedelshantering

De morfologiska observationerna av de odlade neuronerna utfördes under ett faskontrastmikroskop varje dag och förändringarna registrerades med fotografier. Efter odling i 12 timmar observerades cellerna under ett inverterat mikroskop och läkemedlen tillsattes strax före sammanflödet. Serumhalten i varje grupp var 10 procent. Efter odling i 3 dagar tillsattes MPP plus till slutkoncentrationen 200 μmol/L. Efter inkubering i en 37 graders, 5 procent CO2-inkubator i 24 timmar, utför olika inspektioner.

Cistanche

1.6 Flödescytometridetektion

Läkemedelsbehandlingen var densamma som tidigare. Efter att varje grupp behandlats spjälkades de vidhäftande PC12-cellerna med 0.125 procent trypsin, och cellerna togs cirka 1×106 PBS. Cellerna tvättades två gånger och 490 μL bindningsbuffert tillsattes, och cellerna blandades noggrant och 5 μL annexin V tillsattes. FITC och 10 μL löst PI i cellsuspensionen, blanda försiktigt, sätt provröret vid 4 grader, inkubera i 10 minuter i mörker och testa på COULTER EPICS flödescytometer (Beckman Coulter, USA).

1.7 In situ ändmärkning (TUNEL) för att detektera cellapoptos

DNA in situ-ändmärkningen av odlade neuroner använder Bosters apoptosdetektionskit (MK1022), och stegen är som följer: Ta de dopaminerga neuroncellerna från varje grupp efter MPP plus-behandling (objektglaset före den primära odlingen är förodlad med polymerlysinbehandling), fixerad med 4{{30}}g/L paraformaldehyd i 1 timme, färsk 3 procent ättiksyra (pH2,5) vid rumstemperatur i 10 minuter, neutralisera alkaliskt fosfatas, tillsätt 0,1mol/L TBS (pH7,5) 1:200 nyspädd proteinas K-spjälkning vid 37 grader i 20s, tillsätt 1μL TdT och DIG-d-UTP till varje objektglas och 18μL buffertlösning under 2 timmar vid 37 grader; tillsätt 50 μL blockerande lösning till varje objektglas, vid rumstemperatur i 30 minuter; Tillsätt 50 μL biotinylerad anti-digoxigenin-antikropp utspädd med blockerande lösning; reagera i 30 min i en våt låda vid 37 grader; tillsätt 50 μL SABC-AP utspädd med 0,1 mol/L TBS till varje objektglas; BCIP/NBT (0,1 mol pH 9,5/L TBS utspädd 1:20) sattes till provet för att utveckla färg under 30 minuter; samtidigt, en alternativ kontroll (TdT-buffert användes istället för TdT/biotin-dUTP-blandning) för fotomikrografi och inverterad faskontrastmikroskop (200×) Observera de apoptotiska cellerna. Räkna positiva celler under ett faskontrastmikroskop, räkna 5 fält per brunn i varje grupp, för totalt 6 brunnar.

2. Experimentella resultat

2.1 Morfologisk observation av odlade neuroner

Observerad av OlympusIX70 faskontrastmikroskop: 5 timmar efter inokulering fäster de flesta cellerna vid väggen, cellerna är utspridda, cellkroppen är rund, kärnan är osynlig och brytningsindexet är starkt. Efter odling i 24 timmar växte cellutsprången och förlängdes gradvis. Vid 48 timmar stack de flesta av cellerna ut med grenade filamentösa utsprång. Cellmorfologin var diversifierad, som var bipolär, tripolär och multipolär, och bildade gradvis ett gles nätverk. Cellkroppen var förstorad, rund och elliptisk. Efter MPP plus skada svällde cellerna först, brytningsindexet ökade, cellerna var i ett degenerativt tillstånd och cellerna krympte slutligen och föll av. Olika doser av sammansatt serum som innehåller kinesisk medicin har skyddande effekter på MPP plus skada. Efter att kulturen färgats med TH-immunceller, sågs det att TH-positiva celler var bruna med neuritutväxt. Efter tillsats av motsvarande dos av traditionell kinesisk medicin serum, andelen TH-positivneuronerkan nå 55 procent -60 procent .

2.2 Analys av flödescytometritestresultat (se figur 1)

Fosfatidylserin (PS) lokaliserat inuti cellmembranet i det tidiga skedet av apoptos migrerar till utsidan av cellmembranet. Fosfatidylbindande protein V (Annexin V) är ett kalciumberoende fosfolipidbindande protein, som har hög affinitet för PS. Därför kan Annexin V användas som en sond för att detektera PS exponerad på cellmembranytan. Samtidigt, kombinerat med PI-uteslutningsmetoden för dubbelfärgningav apoptotiska celler kan apoptotiska celler detekteras med flödescytometri. I den nedre högra kvadranten i Fig. 1 (FITC plus /PI-), visas apoptosdetaljerna för varje grupp. Andelen celler, apoptosfrekvensen för varje grupp var 4,1 procent, 5,8 procent, 6,3 procent, 28,6 procent, 30,2 procent.

2.3 Analys av TUNEL-färgningsresultat

De med blålila partiklar i kärnan är positiva celler, det vill säga apoptotiska celler. Andelen apoptotiska celler i varje grupp räknades under ett ljusmikroskop. Antalet apoptotiska celler per synfält i varje grupp var: Grupp A 2,13±0.34; Grupp B 4,92±0,67; Grupp C 6,20±1,47; Grupp D 10,33±1,51; Grupp E 12,74±2,51. Eftert-test analys,B- och C-grupperna jämfördes med E-gruppen (P<0.05). the="">resultatär i grunden förenliga medresultat av flödescytometri.

3. Diskussion

Parkinsons sjukdomtillhör kategorin "tremorsyndrom" inom kinesisk medicin. Traditionell kinesisk medicin tror att uppkomsten av PD mestadels är en serie av manifestationer av gradvis utarmning av lever och njure hos äldre och förlust av näring av hjärnmärgsmeridianen. Den huvudsakliga behandlingen är attger näring åt levern och njurarna, lugna levern och eliminera vind. Traditionell kinesisk medicin kan spela syftet med "minska toxiciteten och öka effektiviteten" i behandlingen avParkinsons, men dess verkningsmekanism är för närvarande inte särskilt tydlig. Ett stort antal experimentella bevis inom modern medicin indikerar att oxidativ stress är en av de faktorer som orsakar döden av PD-nervceller [3]. Studier har funnit att de totala glykosiderna i cistanche effektivt kan ta bort olika reaktiva fria syreradikaler och skydda DNA från oxidation orsakad av OH[8]. Cistancheextrakt tubulosid B kan dämpa den cytotoxicitet som induceras avMPP plus,försvagar ackumuleringen av reaktiva syrearter i cellen och har en antagonistisk effekt på apoptos och oxidativ stress inducerad avMPP plus[9]. Traditionell kinesisk medicin kan aktivera och stärka sin egen skyddande signalväg, motstå yttre skador och återställa balansen. Detta är ett av målen med moderniseringen av traditionell kinesisk medicin. Efter dopaminersättningsterapi värdesätter människor nu generellt neuroprotektiv terapi, som kallas den andra revolutionen i behandlingen avParkinsons sjukdom. I detta experiment odlades de isolerade mellanhjärnans dopaminerga nervcellerna med seruminnehållande kinesisk medicin, och man fann att Cistanche har en viss neuroprotektiv effekt. I detta experiment användes två detektionsmetoder för flödescytometri och TUNEL-färgning för att samtidigt finna att det ekvivalenta dosgruppserumet och det 2 gånger ekvivalenta dosgruppserumet från Cistanche-medicinerad serumkultur kan minska den primära odlade dopaminnerven i mellanhjärnan orsakad avMPP plusAntalet apoptotiska celler har en viss skyddande effekt på apoptotiska celler. Traditionell kinesisk medicin kan skydda dopaminerga neuroner från skador i ett tidigt skede, vilket är en viktigare åtgärd än andra terapier. I denna mening är holistisk behandling av kinesisk medicin botemedlet för grundorsaken, och det kan betraktas som en av de neuroprotektiva behandlingar som människor värdesätter för närvarande.

Referenser

1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Levodopa inducerar apoptos i odlade neuronala celler - en möjlig accelerator för nigrostriatal degeneration vid Parkinsons sjukdom? Mov Disord, 1997, 12(1):17

2. Jenner PG, Brin MF. Levodopa neurotoxicitet: experimentella studier kontra klinisk relevans. Neurology, 1998,50(6 Suppl 6): S39

3. Maruyama W, Naoi M. Celldöd vid Parkinsons sjukdom. J Neurol, 2002,249 (Suppl 2): ​​II6

4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian, et al. Klinisk observation om behandling av Parkinsons sjukdom med lever- och njurfunktion: en rapport med 60 fall. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 1999, 22(3): 14

5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang, etc. Klinisk observation av 40 fall av Parkinsons sjukdom som behandlats med metoden för näring av lever och njure. Research in Chinese Medicine, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et al. Pingchan nr 1 oral vätska vid behandling av 40 fall av Parkinsons sjukdom. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9

7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. Ett högt procentuellt utbyte av tyrosinhydroxylas-positiva celler från rått E14 mesencefalisk cellkultur. Brain Res, 1992,586 (2):319

8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, et al. In vitro-avskiljning av fria radikaler och skyddande effekter på OH·inducerad DNA-skada orsakad av de totala glykosiderna i cistanche. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubulosid B från Cistanche salsa räddar PC12-neuroncellerna från 1-Methyl-4-fenylpyridiniumjoninducerad apoptos och oxidativ.Stress.Planta Med,2002,68(11):966