Analys av aromkomponenter och differentiella metaboliter i Cistanche Musalais baserat på GC–MS och metabolomik
Nov 28, 2025
Abstrakt:Denna studie förberedde Cistanche Musalais med hjälp av traditionella tekniker med Xinjiang Hetian röda druvor och olika tillsatser av Cistanche. Optimala bearbetningsbetingelser bestämdes genom envägs ANOVA. GC–MS och oriktad metabolomik användes för att analysera aromkomponenter och differentiella metaboliter, och aktiva beståndsdelar som totala flavonoider och totala polyfenoler kvantifierades. De optimala förhållandena var: initialt sockerinnehåll på 32 grader Bx, jäsningstemperatur på 25 grader och 7% tillsats av Cistanche deserticola. Under dessa förhållanden nådde alkoholhalten, den totala surheten, totala mängden flavonoider och den totala mängden polyfenoler (12,6 ± 0,6) % vol, (3,82 ± 0,19) g/L, (0,80 ± 0,01) g/L respektive (0,60 ± 0,00) g/L. GC–MS upptäckte 38 aromföreningar, med estrar som den vanligaste klassen (24 föreningar), följt av 6 alkoholer, 2 ketoner och 2 aldehyder. Jämfört med Musalais gjord enbart av druvjuice, uppvisade Cistanche deserticola Musalais betydligt högre nivåer av nyckelestrar, inklusive etylacetat (6,42 % vs. 2.42%) och etylpalmitat (3,75 % vs. 1.18%), medan högre alkoholhalter, såsom isobutanol.{1}%, markant minskade ({1}% vs.{1}%). Metabolomics identifierade 230 differentiella metaboliter (VIP större än eller lika med 1, P < 0,05), berikade på vägar relaterade till ABC-transportörer och aminosyrabiosyntes. Komponenter som trigonellin och crocin var signifikant förhöjda. Aminosyrametabolism bidrog till bildandet av den karakteristiska smakprofilen. Denna studie ger en teoretisk och teknisk grund för utveckling och kvalitetsförbättring av Cistanche Musalais. Framtida forskning bör införliva molekylära sensoriska tekniker, såsom GC-O, för att bättre identifiera de viktigaste aktiva föreningarna som är ansvariga för den övergripande smakprofilen.
Nyckelord: Cistanche;Musalais; GC-MS; metabolomik
CistancheMusalais
Information om Cistanche Musalais
Musalais (Msalais)är en traditionell fermenterad dryck unik för Xinjiang, framställd av röda Awati-druvor eller Hetian (Hotan) röda druvor. Den är gjord av juice, koncentrering och spontan jäsning, och karakteriseras som primitiv, naturlig och grön. Som en unik kinesisk naturligt fermenterad alkoholdryck uppvisar Musalais distinkta regionala egenskaper i sensoriska egenskaper, näringsvärde och funktionella aktiviteter. Alkoholer, estrar, aldehyder, syror, fenoler och terpener som genereras under jäsning ger inte bara en unik smak utan är också förknippade med fördelar som att främja blodcirkulationen, sänka blodlipider, tonifiera njurarna och stärka kroppen, reglera kolesterolet och bibehålla den kardiovaskulära hälsan för konsumenter [1].
Under de senaste åren, med växande konsumentefterfrågan på hälsosamma drycker, har marknaden för funktionell sprit expanderat snabbt. Baserat på traditionell bryggning innehåller funktionella likörer specifika funktionella komponenter för att möta behov av välbefinnande, hälsovård eller specifik fysiologisk reglering. Deras kvalitet påverkas av råvaror, processer, mikrobiella samhällen och stabiliteten hos funktionella komponenter [2]. I södra Xinjiang folkpraxis tillsätts ofta lokala tillsatser som gojibär, safflor, Cistanche och saffran under Musalais-beredning för att förbättra hälsofördelarna och berika smakmångfalden [3]. Bland dessa har Cistanche-rik på polysackarider, aminosyror, fenyletanoidglykosider, iridoidglykosider och alkaloider toniska effekter på njurens yang, modulerar neuroendokrina funktioner och bekämpar trötthet, vilket ger namnet "öknens ginseng" [4–5].
Emellertid står industrialiseringen av Cistanche Musalais för närvarande inför utmaningar, inklusive bristande produktionsstandarder, ofullständig bearbetningsteknik och otillräcklig forskning om smakämnen, vilket begränsar dess marknadsfrämjande och kvalitetsförbättring. I denna studie användes Cistanche som ett komplement för att optimera Musalais jäsningsprocessen. GC–MS och oriktad metabolomik användes för att systematiskt lösa arombeståndsdelar och differentiella metaboliter, i syfte att tillhandahålla en teoretisk grund och tekniskt stöd för standardiserad produktion, smakmodulering och funktionell förbättring av Cistanche Musalais, och därigenom främja moderniseringen och värdeutvecklingen av denna traditionella dryck.
1 Material och metoder
1.1 Material och reagens
Cistanche tubulosa (rörformig Cistanche): förstklassiga kommersiella exemplar från Hetian (Hotan), Xinjiang, med fyllig konsistens och fria från mögel och föroreningar.
Hetian röda druvor: kommersiell frukt med intakt utseende och stark arom, hämtad från Hetian, Xinjiang.
Metanol och acetonitril: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Myrsyra: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.
L-2-klorfenylalanin: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrument och utrustning
08-2T magnetisk omrörare med konstant temperatur, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.
57330-U SPME-enhet och 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME-fiber, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.
6890N-5973 GC–MS-system, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.
5430R kyld centrifug, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.
TL-48R mjukpapperskvarn med hög genomströmning, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.
SCIENTZ-1LS vakuumkoncentrator, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.
Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
SDAJ-0.5 vinproduktionslinje i kinesisk stil, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.
1.3 Experimentella metoder
1.3.1 Processflöde
Cistanche ångades för senare användning. Hetian röda druvor tvättades och valdes ut, avstjälkades och krossades. Druvjuice extraherades med en press, upphettades sedan och koncentrerades för att justera juicekoncentrationsindikatorerna. Slutligen blandades den ångade Cistanche-produkten med koncentrerad druvjuice och fermenterades under kontrollerade temperatur- och tidsparametrar. Efter jäsning klargjordes produkten för att erhålla Cistanche Musalais.
1.3.2 Förberedelse av Cistanche
Med mindre modifieringar av Gong et al. [6], högkvalitativ, icke-försämrad torkad Cistanche skalades, skivades, slogs in i gasväv och ångades i 20 minuter för senare användning.
1.3.3 Beredning av druvjuice
Hetian röda druvor med ett initialt lösligt fast ämne (socker) på 18 grader Bx användes. Rutnade, försämrade och ojämnt mogna druvor togs bort. Efter tvätt och skalning pressades druvor. Juicen kokades (koncentrerades) vid hög temperatur och koncentrationen stoppades när sockret nådde 26, 29 eller 32 grader Bx. Juicen kyldes till rumstemperatur för senare användning.
1.3.4 Fermenteringsprocess för Cistanche Musalais
Ångad Cistanche tillsattes i definierade proportioner (3%, 5%, 7%) till 600 ml koncentrerad druvjuice i en fermentor. Restsocker mättes var 24:e timme under fermenteringen för att övervaka framstegen. När restsockret sjönk till 4 g/L avslutades jäsningen. Supernatanten uppsamlades och pastöriserades vid 85 grader under 30 minuter för att erhålla Cistanche Musalais.
1.3.5 Enfaktors experimentell design för Cistanche Musalais
Effekterna av Cistanche-tillsats (3%, 5%, 7%), initialt sockerinnehåll (26, 29, 32 grader Bx) och fermenteringstemperatur (22, 25, 28 grader) på fysikalisk-kemiska egenskaper och bioaktivitet undersöktes.
1.3.6 Analyser och mätningar
Alkoholhalt, lösliga fasta ämnen och total surhet: bestäms enligt GB/T 15038-2006 "Allmänna analysmetoder för vin och fruktvin."
Totalt antal flavonoider: bestämt med hänvisning till Xu et al. [7]. En kalibreringskurva framställdes med rutinkoncentration (X) som abskissan och absorbans (Y) vid 510 nm som ordinatan, vilket ger Y=0.8043X - 0,0278, R2=0.9999, vilket indikerar god linjäritet.
Totalt antal polyfenoler: bestämt med Folin-Ciocalteu-metoden [8]. En kalibreringskurva framställdes med gallussyrahalt (X) som abskissan och absorbans (Y) vid 760 nm som ordinatan, vilket ger Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, vilket indikerar god linjäritet.
1.3.7 GC–MS-analys
Prover från två grupper - experimentella (32 grader Bx, 25 grader, 7% Cistanche) och kontroll utan Cistanche - utsattes för GC-MS.
Provförbehandling: Prov placerades i en 20 ml extraktionsflaska; 100 μL 50 ug/ml isoamylfenylacetat tillsattes som intern standard. Flaskan förseglades och ekvilibrerades i ett 60 graders vattenbad med magnetisk omrörning vid 250 r/min under 20 min. SPME-fibern sattes sedan in för 30 min extraktion. Före användning konditionerades SPME-fibern vid GC-inloppet vid 250 grader under 20 minuter.
GC–MS-förhållanden: HP-INNOWax-kolonn (60 m × 250 μm × 0,25 μm); inlopp 250 grader; överföringsledning 250 grader; bärargasflöde 1,5 ml/min; delad 4:1. Ugnsprogram: 40 grader (5 min), ramp 5 grader /min till 250 grader, håll 10 min. Jonkälla 230 grader; fyrpol 150 grader ; EI 70 eV; full scan 35–550 Da.
1.3.8 Oriktad metabolomik
1.3.8.1 Provberedning
Två grupper testades: experimentella (32 grader Bx, 25 grader, 7 % Cistanche) och kontroll utan Cistanche; n=3 biologiska replikat per grupp, totalt 6 prover. Efter upptining och vortexning överfördes 300 μL av varje prov till ett 1,5 ml rör och centrifugerades vid 12 000 r/min, 4 grader i 15 minuter. Sedan flyttades 100 μL supernatant till ett 2 ml rör, snabbfrystes i flytande kväve och lyofiliserades. Tillsätt 1 ml förkyld metanol:acetonitril (1:1, v/v), vortexa 30 s; frys vid -20 grader i 30 minuter; centrifugera vid 12 000 r/min, 4 grader i 10 min; Samla upp 850 μL supernatant och vakuumtorka tills det är fullständigt; rekonstituera i 150 μL 50 % metanol (med 5 ppm 2-klorfenylalanin), vortexa 30 s; centrifugera 12 000 r/min, 4 grader i 10 min; filtrera genom 0,22 μm membran och överför filtratet till flaskor. Kombinera 10–20 μL från varje prov för att skapa ett QC-prov för att utvärdera instrumentets stabilitet och datatillförlitlighet; QC utelämnas om färre än 5 prover ingår.
1.3.8.2 Analytiska förhållanden
Kromatografi: ACQUITY UPLC HSS T3-kolonn (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); flöde 0,4 ml/min; kolumn 40 grader; autosampler 8 grader ; injektion 2 μL. Mobil fas A: vatten med 0,1% (v/v) myrsyra; mobil fas B: acetonitril med 0,1% (v/v) myrsyra.
Masspektrometri: sprayspänning +3.5 kV/−3,0 kV; mantelgas 40 arb; hjälpgas 10 arb; kapillär 320 grader; hjälpgas temp 300 grader; MS1-upplösning 60 000; skanningsområde m/z 70–1 000; AGC Target Standard; Max IT 100 ms; databeroende MS/MS på topp 4 joner med dynamisk uteslutning 4 s; MS2-upplösning 15 000; HCD kollisionsenergi 30%.
1.3.8.3 Metabolitidentifiering
Metabolitidentifiering baserades på PSNGM (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), som omfattar ett internt bibliotek av standarder, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.lab.camon/), Mouc.nafieee/), Mouc.nafiee/), Mouc. NIST_2020_MSMS och ett AI-förutsagt MS/MS-spektralbibliotek.
Anmärkning om externa databaser som används i anteckningar:
HMDB: En omfattande databas för mänskliga metabolomer (version 5.0) som innehåller detaljerad kemisk, klinisk och biokemisk information för 220 945 metaboliter, med omfattande tvärlänkar till KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt och GenBank, och stödjer avancerad text/sekvens/spektralsökning och MS/NMR-spektralsökning. Också associerad med DrugBank, T3DB, SMPDB och FooDB.
LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50 000 kurerade lipidstrukturer), spektra, vägar, verktyg för MS-analys, strukturritning och nomenklatur-/klassificeringsresurser.
mzCloud: Ett avancerat masspektralbibliotek som stöder spektrum, struktur, understruktur, träd och m/z-baserade sökningar, med 32 330 föreningar, 51 002 spektralträd och 16 531 567 spektra (med betydande tillägg under 2024), optimerat för Firefox/Chrome-skrivbordsåtkomst.
1.3.8.4 Multivariat statistisk analys
Multivariata analyser tillämpades på metabolitdata från de 6 proverna för att utföra PCA, vilket belyser metaboliska skillnader mellan Cistanche Musalais och Musalais. Differentiella metaboliter över grupper screenades med hjälp av OPLS-DA variabel betydelse i projektion (VIP), veckförändring och P-värden (VIP-tröskel och signifikans enligt ovan), följt av biologisk tolkning inklusive KEGG-väganrikning [9].
Referenser
[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ, et al. Kvalitativ analys av de viktigaste aromföreningarna förknippade med traditionell Musalais-bearbetning i Xinjiang Kina. Journal of the Institute of Brewing. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, et al. Moderna forskningsframsteg om fermenterad funktionell sprit. Sprittillverkning. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Diskussion om utvecklingsstrategier för druvvinet Xinjiang Msalais. Vetenskap och teknik för sprittillverkning. 2008(7):111–113.
[4] Song ZH, Lei L, Tu PF. Framsteg inom forskning om farmakologisk aktivitet i växter av Cistanche Hoffing. et länk. Traditionella kinesiska och växtbaserade droger. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Forskningsutvecklingen av Cistanche Hoffmg. Et länk. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY, et al. Studie om tekniken för ett nytt jäst Cistanche-vin. Modern mat. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ, et al. Antioxidant och antibakteriella aktiviteter av totala flavonoider från Nervilia fordii. Northern Horticulture. 2017(16):161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX, et al. Blandad jäsning av citrusskalsrester med Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae och Lactobacillus casei: processoptimering, antioxidantaktiviteter och icke-målinriktad metabolomikanalys. Food Bioscience. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ, et al. Comparison of widely targeted metabolomics and untargeted metabolomics of wild Ophiocordyceps sinensis. Molecules. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Forskning om teknologin för Rosa kwangsiensis var. sterilis fermenterat vin [Masteruppsats]. Chongqing: Southwest University; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX, et al. Forskning om produktutveckling och responsytoroptimering av Msalais-päron. Bearbetning av jordbruksprodukter. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Verifiering av anpassningsförmågan hos bestämningsmetoden för koppar i GB/T15038-2006 allmän analysmetod för vin och fruktvin. Sprittillverkning. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z, et al. Effekt av malolaktisk jäsningstemperatur på kvaliteten på Cabernet Sauvignon-vin. Zhejiang Agricultural Sciences. 2025;66(7):1724–1732.
