Studien för Cistanche av kemiska profiler och metaboliter

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Zhe Li, Lkhaasuren Ryenchindorj, Bonan Liu, Ji Shi, Chao Zhang, Yue Hua, Pengpeng Liu, Guoshun Shan & Tianzhu Jia

Abstrakt

Bakgrund: Bearbetning av kinesisk materia medica är en framstående och unik farmaceutisk teknik inom traditionell kinesisk medicin (TCM) som används för att minska biverkningar och öka eller till och med ändra den terapeutiska effekten av de råa örterna. Förändringar i de väsentliga komponenterna som induceras av en optimerad processprocedur är primärt ansvariga för den ökade effekten av medicinalväxter. Den njure-yang uppiggande effekten av risvinsångad Cistancha deserticola (C. deserticola) var starkare än rå C. deserticola (CD). Metoder: En jämförelseanalys utfördes med hjälp av UPLC-Q-TOF-MSE med UNIFIs informatikplattform för att fastställa påverkan av bearbetning. In vitro-studier utfördes för karakterisering av beståndsdelar samtmetaboliterin vivo. Dekemiskkomponenter bestämdes i CD och dess bearbetade produkter. De multivariata statistiska analyserna utfördes för att utvärdera variationer mellan dem medan OPLS-DA användes för parvis jämförelse. Resultat: Resultaten av denna studie avslöjade betydande variationer i fenyletanoidglykosider (PhGs) och iridoider efter bearbetning. Totalt 97 föreningar upptäcktes i extrakten av CD och dess bearbetade produkt. PhG med 4'-O-kaffeoylgrupp i 8-O- -D-glukopyranosyldelen, som akteosid, cistanosid C, campneosid II, osmanthusid minskade efter att ha bearbetats, medan PhG med 6'-O- koffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen, såsom isoacetosid, isocistanosid C, isocampneosid I, isomartynosid ökade, särskilt i CD-NP-gruppen. Intensiteten av echinakosid och cistanosid B vars struktur har en 6'-O- -D-glukopyranosyldel ökade också. I in vivo-studie, 10 prototypkomponenter och 44metaboliterupptäcktes i råttplasma, avföring och urin. De erhållna resultaten visade att bearbetning leder till den avsevärda variationen ikemiskbeståndsdelar av CD och påverkade dispositionen av föreningarna in vivo, och fas II-metaboliska processer är nyckelkaskaderna för varje förening, och de flesta avmetaboliterär förknippade med echinakosid eller akteosid. Slutsatser: Detta är den första globala jämförelseforskningen av rå och bearbetad CD. Dessa resultat bidrar till vår förståelse av effekten av CD-bearbetning och ger viktiga data för framtida effektutredningar.

Studien för cistanche av kemiska profiler och metabolit

Introduktion

Bearbetning av kinesisk materia medica (CMM) har visat betydande tillämpbarhet i klinisk praxis för traditionell kinesisk medicin (TCM), och det har ansetts vara en hållbar behandling i flera århundraden. Detta är en unik läkemedelsteknologi som har härletts från teorin om TCM. Efter bearbetning, betydande skillnader i utseende,kemiskbeståndsdelar, egenskaper och medicinsk betydelse för alla typer av TCM har identifierats, vilket leder till antagandet att bearbetning kan förbättra effektiviteten eller minska TCM:s toxiska effekter.

I hundratals år,Cistanche deserticola(Roucongrong på kinesiska, CD) används ofta i TCM klinisk praxis för att komplettera njurens funktioner. Det hjälper också till att återfukta tarmen som leder till avslappnande tarm [1].Cistanchespelades först in i ShenNongBencaoJing. Det finns vanligtvis i torra och halvtorra livsmiljöer över Eurasien och Nordafrika, inklusive Iran, Kina, Indien och Mongoliet [2]. Bearbetningen av CD har utförts genom ångning med risvin under normalt tryck, vilket är en beredningsmetod dokumenterad i den kinesiska farmakopén (Jiucongrong på kinesiska, nedan kallad "CD-NP"). Och CD-ångning med risvin under högt tryck är en mer effektiv beredningsmetod (hädanefter kallad "CD-HP") [3, 4]. Flera studier har visat att de farmakologiska effekterna av CD skiljer sig från dess bearbetade produkter [5]. CD kan tonifiera njur-yang och slappna av tarmen, medan efter att ha ångats av risvin, effekten av att fylla på njur-yang skulle förstärkas. I vår tidigare studie har det visat sig att CD-NP kan förbättra tonifieringen av njuren och stödja yang, och lindra effekten av att fukta tarmarna och avföra avföring [6,7,8]. I klinisk praxis är bearbetade produkter den vanligaste formen.

Upp till datum har flera studier analyseratkemiskkomponenter i CD, följt av isolering och identifiering av mer än 100 föreningar [9,10,11], såsom fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner och oligosackarider som dess huvudsakliga kemiska beståndsdelar. Det har också rapporterats att det finns många farmakologiska aktiviteter hos PhG inklusive immunmodulerande, neuroprotektiva, hepatoskyddande, antiinflammatoriska, antioxidativa, etc. [12,13,14]. Iridoider har antiinflammatoriska aktiviteter [15, 16]. Det har också avslöjats av tidigare studier att vissa kemiska komponenter visade variationer under bearbetningen [17,18,19,20]. Utifrån dessa rapporter kan man anta att efterbehandlingen, variationerna ikemisksammansättningen leder till olika farmakologiska effekter, som behöver undersökas ytterligare.

I den aktuella studien utfördes en känslig och effektiv metod, dvs ultrahögpresterande vätskekromatografi kopplad med TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) för jämförande analys, och in vitro-studier utfördes för att kvalitativt analysera extrakten av CD, CD-NP och CD-HP för att klargöra deras kemiska profiler. I allmänhet är det exogenakemikaliermed hög exponering i målorgan ansågs vara effektiva komponenter. Därför administrerades CD och dess bearbetade produkter oralt till råttor, följt av deras karakterisering. Den befintliga studien avslöjar en jämförande studie (både in vitro och in vivo) av rå och bearbetad CD för första gången. De erhållna resultaten skulle utöka vår förståelse angående effekten av CD-bearbetning, vilket kan vara till hjälp för ytterligare studier.

cistanche av kemiska profiler och metabolit

Material och metoder

Material

Standardföreningar av ajugol (180120) och 2'-aktylacetosid (M0601AS) tillhandahölls av Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Kina). Cistanoside F (MUST-17022620), echinacosid (D1105AS), cistanosid A (M0906AS) och isoacteosid (M0106AS) tillhandahölls av Must-företaget (Sichuan Kina); akteosid (O0618AS), salidrosid (J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposid (A0407AS) och geniposidsyra (MB6001-S) förvärvades från Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Kina). 8-epideoxylogansyra (B31123) erhölls från Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Kina. Metanol och acetonitril var av MS-kvalitet och erhölls från Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland. Metansyra (CH2O2) av HPLC-kvalitet tillhandahölls av Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland). Vattnet som användes i den befintliga studien bearbetades via Milli-Q-systemet (18,2 MΩ, Millipore, Ma, USA). Risvin levererades av Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).

Cistanch deserticola samlades in från Neimenggu wangyedicistancheCo. Ltd. Proverna identifierades av Prof. Yanjun Zhai (farmaceutskolan, Liaoning University of TCM). Proverna lämnades till Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.

Djur

Sprague–Dawley-råttor av hankön (SPF-klass) med 180–220 g total kroppsvikt tillhandahölls av Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center i Liaoning-provinsen, licensnummer: SCXK-2015–0001). Dessa råttor hölls i ett avelsrum med väl underhållen temperatur och luftfuktighet, dvs 20–26 grader, 50–70 procent under en vecka. Råttorna matades med vanlig labbmat och vatten före experiment. Djuren fastade över natten, men vattnet tillhandahölls ad libitum före experimentet. Råttorna avrättades med 10 procent kloralhydratbedövningsmedel. Den institutionella djuretiska kommittén vid Liaoning Provincial Hospital of Chinese Medicine godkände alla experimentella protokoll (2019.3.25, 2019015).

Framställning av CD-, CD-NP- och CD-HP-extrakt

CD-NP, CD-HP bearbetades från samma sats av Cistanch deserticola. För att förbereda CD-NP fuktades torra CD-bitar (5 mm tjocka, 100 g) med risvin (30 ml) och ångades vid 100 grader i 16 timmar, följt av torkning vid 55 grader via torkugn. Medan CD-HP framställdes via infiltration av torra CD-bitar (5 mm tjocka, 100 g) med risvin (30 ml), följt av ångning vid 1,25 atmosfärstryck i 4 timmar. och torkade sedan i torkugn på 55 grader .

I en 100 ml mätkolv siktades ett gram av pulvret via sikt #4, följt av tillsats av 50 procent metanol (50 ml) och täcktes sedan tätt och blandades. Denna blandning vägdes, följt av halva timmar. urlakning. Efter maceration ultraljudsbehandlades blandningen (effekt 250 W, frekvens 35 kHz) under 40 minuter, följt av kylning och vägning igen. Viktförlusten fylldes på med 50 % metanol, ordentligt blandad och fick stå, följt av filtrering av supernatanten och använde sedan det erhållna filtratet som testlösning.

MSE-analys av aktiva komponenter

Beredning av standardsubstanser: tubulosid-A (3.02 mg), echinakosid (3.00 mg), 2'-acetylakteosid (2,34 mg), acteosid (2,45 mg), isoacteosid (0,61) mg), cistanosid-F (2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), geniposid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catalpol (2,39 mg), geniposidinsyra (2,56 mg) och 8-epideoxylogansyra (2,34 mg) tillsattes till en 10 ml mätkolv, tillsattes metanol konstant volym i skala, konfigurerades till en motsvarande koncentrationsreferenslösning. Var och en av de 100 μL konfigurerades till en blandad referenslösning.

MS-analysvillkor: Massvärdet korrigerades före experimentet och negativ jonläget användes. Massintervallet var 50–1200 Da, och provet injicerades genom en flödesinsprutningspump. Konhastigheten var 100 L/h, lösningsmedelsflödeshastigheten sattes till 800 L/h. Kapillär- och konspänningarna var fixerade till 2500 och 40 V, i enlighet därmed. Temperaturen på jonkällan och lösningsmedelsgasen var 100 grader respektive 400 grader och signalupptagningsfrekvensen var 0,5 S−1.

cistanche av kemiska profiler och metabolit

UPLC-Q-TOF-MSE-analys av CD-extrakt

Kromatografiska utvärderingar utfördes i ett Waters ACQUITY I-CLASS UPLC-system (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Inklusive ACQUITY UPLC® BEH C18 kolumn (50 × 2,1 mm, 1,7 μm, vatten). Den mobila fasen bestod av vatten med 0,1 procent myrsyra (A) och acetonitril innehåller 0,1 procent myrsyra (B), elueringsvillkoret var följande: 97 procent till 85 procent A (0–5 min), 85 procent till 75 procent A (5–15 min), 75 procent till 65 procent A (15–16 min), 65 procent till 55 procent A (16–18 min) . Flödeshastigheten var 0,3 mL min−1, medan temperaturen i det automatiska provtagningsrummet och kolonnen var 30 grader och 8 grader separat. Injektionsvolymen var 1,0 μL.

Den masspektrometriska utvärderingen utfördes via Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), innefattande en ESI-källa. Flödeshastigheten för kvävgas fixerades till 800 L·hrs−1 med en temp på 400 grader , källtemperaturen var fixerad till 100 grader och kongasen var inställd på 50 L h−1. Spänningen för kon och kapillär justerades till 40 och 2000 V, i enlighet därmed. Rampens kollisionsenergi användes i intervallet 20–30 V. Centroiddata för alla prover erhölls från 50 till 1200 Da, med en 5-skanningstid på 0,5 s över en analystid på 10 minuter . LockSpray TM användes för validering av massprecisionen. [M–H]−jonen av leucinenkefalin (200 pg·μL−1 infusionsflödeshastighet 10 μL min−1) vid m/z 554,2615 användes som låsmassa. MassLynx V4.1-mjukvaran (Waters Co., Milford, USA) användes för den exakta massan, sammansättningen av prekursorjonerna och beräkningen av fragmentjonerna.

Dataanalys i Masslynx plattform

Dessutom skapades ett internt bibliotek med namnet på föreningen, dess struktur och molekylformeln (i mol) baserat på litteratur. Alla föreningar noterades i en speciell mall, gjord i Excel. Dessutom sparades mol-filerna (Chemdraw Ultra 8.0, Cambridge soft, USA) och Excel-filerna för alla individuella sammansatta strukturer på den lokala datorn. Det etablerade Excel-arket med viktiga data importerades direkt till det vetenskapliga biblioteket i UNIFI.

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Storbritannien användes för utvärdering av strukturella egenskaper, särskilt för de karakteristiska fragmenten och MS-fragmentering. En minsta topparea på 500 ställdes in för 2D-toppdetektering. Under avslöjande av 3D-toppar valdes en lågenergitoppintensitet på mer än 300 räkningar och förhöjd energitoppintensitet på mer än 80 räkningar. Massfelet befanns vara upp till ± 10 ppm för kända föreningar, och retentionstidstoleransen sattes inom intervallet ± 0,1 min. Vi valde de negativa addukterna innehållande –H plus HCOOH. Bearbetningen av rådata som erhållits från MS utfördes via strömlinjeformad UNIFI-programvara för att snabbt fastställakemiskkomponenter som uppfyllde standarderna med den egenbyggda databasen och det interna biblioteket för traditionell medicin.

Nästa, för att verifierakemiskstrukturen för varje målförening särskiljdes isomererna genom deras karakteristiska MS-fragmenteringsmönster som avslöjades i de rapporterade studierna och genom att jämföra retentionstiderna för referensstandarder.

Metabolomisk analys baserad på multivariat statistisk analys

Innan rådata bearbetades ställdes parametrarna in, såsom massa från 150 till 1200 Da, intervall för retentionstid (0 till 20 min), tröskelintensitet ( 2000 räkningar), masstolerans dvs 5 mDa, medan massan och retentionstidsfönstret var 0,20 min respektive 0,05 Da. I den efterföljande listan av databasen var identifieraren för joner RT-m/z-paren med avseende på deras elueringstider. Samma värden för RT och m/z i olika satser av prover ansågs vara samma förening.

Multivariat statistisk analys utfördes för att utvärdera effektiva biomarkörer som avsevärt bidrog till variationer mellan olika grupper. Under analysen användes principal komponentanalys (PCA) för att indikera maximala skillnader och mönsterigenkänning för att få en översikt och klassificering. OPLS-DA är ett modelleringsverktyg som tillhandahåller visualisering av OPLS-DA:s prediktiva komponentbelastning för att underlätta modellutvärdering. Variabel betydelse för projektionen (VIP) användes för att bedöma utvärderingen av olika komponenter, ochmetaboliterwith VIP values >1.0 och P-värde< 0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r2/q2="" values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

cistanche av kemiska profiler och metabolit

Djurförsök

Råttorna kategoriserades slumpmässigt i fyra grupper (n = 6 för varje grupp), följt av oral administrering av olika extrakt: (1) Blank kontrollgrupp: råttorna gavs normal saltlösning (2 ml/100 g); (2) CD-grupp: råttorna gavs CD-extrakt (2 ml/100 g); (3) CD-NP-grupp: råttorna gavs CD-NP-extrakt (2 ml/100 g); (4) CD-HP-grupp: råttorna gavs CD-HP-extrakt (2 ml/100 g). Den ytterligare kategoriseringen av alla grupper genomfördes i tre undergrupper för plasma, urin och avföring. Två timmar senare administrerades varje råtta oralt med samma och lika stora mängd extrakt.

Efter administrering utfördes insamlingen av blodprover vid 1.0 h, 2.0 h och 4.0 h i hepariniserade 1,5 ml polyetenrör (från orbitala vener) följt av centrifugering (vid 4500 rpm) av alla prover under 15 min.

För urin- och avföringsprover hölls råttorna i metabolismburar, och sedan utfördes insamlingen av urin- och avföringsprover i 24 timmar efter administrering. Centrifugeringen av urinprover utfördes vid 45 00 rpm i 15 minuter, medan avföringsprover torkades i skuggan, maldes till pulver, sedan togs 0,2 g och sattes till 0,5 ml saltlösning lösning, ultraljud i 5 minuter och centrifugeras vid 12,000 rpm i 15 minuter. Alla bioprover hölls vid -80 grader fram till analys.

Beredning av biologiska prover

Tillsatsen av plasma-, urin- och avföringsprover utfördes med 3 volymer metanol, följt av vortexning i 3 minuter. Därefter utfördes centrifugeringen (vid 12,000 rpm) av blandningarna under 10 minuter, följt av överföring av supernatant till EP-röret och torkades sedan med kväve vid 37 grader. Dessutom tillsattes 200 μL HCN–H2O (50 procent) lösning. Därefter användes virveln för blandning (1 min), följt av centrifugering (vid 12, 000 rpm) under 5 min. Supernatanten (5 μL) av de behandlade proverna injicerades i UPLC-Q-TOF-MSE-systemet.

Vätskekromatografiskt och masspektrometriskt tillstånd

Analysen förmetaboliterutfördes också av Waters UPLC-instrumentet genom ett ESI-gränssnitt. Separationer utfördes med användning av en Acquity UPLC HSS T3-kolonn (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), den mobila fasen var 0,1 procent myrsyra (A): Acetonitril (B), gradientelueringsvillkoret var 0–3 min (99,8 procent → 98 procent A), 3–5 min (98 procent → 95 procent A), 5–8 min (95 procent → 90 procent A), 8 –12 min (90 procent → 85 procent A), 12–17 min (85 procent → 70 procent A), 17–22 min (70 procent → 60 procent A), 22–23 min (60 procent → 58 procent A) , 23–25 min (58 procent A), 25–32 min (58 procent → 45 procent A) och 32–37 min (45 procent → 35 procent A), 0,4 mL min−1 var flödeshastigheten. Temperaturen för kolonnen och provrummet var inställd på 40 grader respektive 8 grader. De ovan nämnda masspektrometribetingelserna användes.

Strategi för systematisk analys av metaboliter i bioprover

UNIFI (1.8.2) programvara användes för databehandling. Funktionen Binary Compare användes för identifiering av effektiva metaboliter. Utvärderade metaboliter fanns inte i det ekvivalenta kontrollprovet eller existerade vid låga jonintensiteter. Den relativa intensitetströskeln sattes till 3 eller 5, ochmetabolitersom uppfyllde de understrukna kriterierna kunde utvärderas. Vanligt och förutsägbartmetaboliterfastställdes sedan av EIC. För sökning av tvåfasmetaboliter användes NLF-funktionen. Till exempel, i UNIFI-mjukvaran, kan parametrarna ställas in på 176.0321 för att söka efter möjliga glukuronsyrakonjugat. Efterbearbetning kan en neutral förlust ställas in i metoden eller identifieras. MassFragment användes för att bestämma eller karakterisera detekterademetaboliter' strukturer, är en UNIFIs spektrala tolkningsfunktion huvudfunktionen som används för att analysera sekundär fragmentering av överordnade komponenter. Denna funktion kan användas för snabb verifiering av fragmenteringsvägen oavsett om det är rimligt.

cistanche av kemiska profiler och metabolit

Resultat

Massfragmenteringsregel för fenyletanoidglykosider och iridoider

Fenyletanoidglykosider är de viktigastekemiskbeståndsdelar i CD. Standardlösningarna av isoakteosid, cistanosid F, tubulosid A, echinakosid, acteosid och 2'-aktylakteosid togs, följt av att tillhandahålla en annan nivå av kollisionsenergier (tabell 1), och sedan erhölls motsvarande MS2-kartor (Fig. 1). .

Fig. 1 Masspektrogram och klyvningsväg för fenyletanoidglykosider. A isoakteosid; B cistanosidF; C tubulosidA; D echinacteosid; E akteosid; F 2'-aktylakteosid

Tabell 1 Kollisionsenergi för standardämnen

Den masspektrometriska analysen avslöjade att fenyletanoidglykosider har liknande masspektrumfragmenteringsmönster, klyvningsvägarna i negativ-jonläget inkluderar huvudsakligen: (1) Esterbindningsklyvning: förlust av neutral koffeoylgrupp (C9H3O6, 162,03) och neutral acetylgrupp (C2H2O) , 42.00); (2) Glykosidklyvning: förlust av neutrala ramnosrester (C6H10O4, 146,05) och neutral glukosrester (C6H10O5, 162,05). Från högupplöst masspektrometri kunde kaffeoyl (162,03) och glukosrest (162,05) särskiljas.

Iridoiderna ajugol, catalpol, geniposidinsyra, geniposid och 8-epideoxylogansyra standardlösningar togs, följt av att tillhandahålla olika kollisionsenergier, och motsvarande MS2-kartor erhölls (Fig. 2).

Fig. 2 Masspektrogram och klyvningsväg för iridoidglykosider. A Ajugol, B catalpol, C geniposidinsyra, D geniposid, E 8-epideoxylogansyra

Iridoidglykosider har liknande masspektrumfragmenteringsmönster, klyvningsvägarna i negativ-jonläget inkluderar huvudsakligen (1) Glykosidklyvning: Förlust av neutral glukosrester (C6H10O5, 162,05); (2) Förlust av neutral CO2 (43,99) och H2O (18,01).

Identifiering av föreningarna i CD-, CD-NP- och CD-HP-extrakt

UPLC-QTOF-MS E-analys

Optimeringen av kromatografiska betingelser utfördes. Därefter föreningarna avCistancheHerba utvärderades i både negativa och positiva jonlägen med höga såväl som låga CE. De erhållna resultaten avslöjade att kompatibiliteten för det negativa sättet var högre i förhållande till det positiva sättet för dessa föreningar. Figur 3 visade MS basal peak ion (BPI) kromatogram spårat med numrerade toppar. Intensiteten för varje detekterad jon i UPLC-Q-TOF-MSE-analys normaliserades med avseende på hela jonräkningen för generering av en datamatris som bestod av m/z-värde, den normaliserade topparean och retentionstid.

Fig. 3 Bastoppintensiteten (BPI) för proverna. 1.CD, 2. CD-NP, 3. CD-HP

Utvärderingen av komponenter från CD och dess bearbetade produkter på UNIFI-plattformen

Totalt 97 föreningar identifierades med -SEM (n = 6)-mod från CD och dess bearbetade produkt (tabell 2), inklusive fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner och oligosackarider. Komponenterna 95, 91 och 94 detekterades i CD, CD-NP och CD-HP, i enlighet därmed. Bland dem var 64 fenyletanoider, 13 var iridoider och 20 andra typer av föreningar bestämdes. Det fanns en likhet ikemisksammansättningen av CD och dess bearbetade produkt visade sig dock mängden av komponenterna vara olika mellan CD och dess bearbetade produkt.

Tabell 2 Utvärdering av föreningar erhållna från CD och dess bearbetade produkter av UPLC-Q-TOF-MSE

Variationer ikemiskkomponenter i bearbetade produkter

Simca-P 13.0-mjukvaran användes för att analysera den multivariata datamatrisen. Före PCA var alla variabler medelcentrerade och pareto-skalade, följt av identifiering av potentiella diskriminantvariabler. I ett PCA-poängdiagram visade varje punkt ett individuellt prov. Prover som visade likhet i sinakemiskkomponenter var utspridda intill varandra, medan de som visade variationer i sina komponenter var uppdelade. Såsom framgår av PCA (fig. 4), separerades gruppen av CD-HP från grupperna av CD och CD-NP.

Fig. 4 PCA för CD och dess olika bearbetade produkter

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs. 5, 6, 7) The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP >1 och P< 0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Fig. 5 OPLS-DA/permutationstest/S-plot/värmekarta som indikerar intensiteten av potentiella biomarkörer mellan CD-NP och CD-HP-föreningar 9, 10, 14, 32, 59, 60, 68, 70, 74, 75, 80, 81, 82 och 84 är de differentiella komponenterna i CD-NP, medan föreningarna 11, 15, 16, 45, 48, 66 och 72 är de differentiella komponenterna i CD-HP.

Fig. 6 OPLS-DA/permutationstest/S-plot/värmekartor som indikerar intensiteten av effektiva biomarkörer mellan CD- och CD-NP-föreningar 13, 15, 16, 37, 49, 63, 66, 72, 74, 75 och 85 är de differentiella komponenterna i CD, medan föreningarna 10, 11, 32, 59, 60, 68, 70, 71, 80, 81 och 82 är de differentiella komponenterna i CD-NP.

Fig. 7 OPLS-DA/permutationstest/S-plot/värmekartor som avslöjar intensiteten hos effektiva biomarkörer mellan CD och CD-HP-föreningar 9, 14, 16, 59, 63, 66, 72, 74, 75, 80, 82 , 84, 85 och 94 är de differentiella komponenterna i CD, och 11, 15, 45, 49, 50, 60 och 71 är de differentiella komponenterna i CD-HP.

Från fig. 8 fann vi intensiteten av akteosid (54), cistanosid C (74), campneosid II (43), osmanthusid (75) och 2'-aktylakteosid (80) med 4'-O-kaffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen (se fig. 9) minskade efter att ha bearbetats med risvin, medan intensiteten av isoacetosid (60), isocistanosid (71), isocampneosid I (69) ökade isomartynosid (86) med 6'-O-kaffeoylgruppen (se fig. 9), speciellt för CD-NP-gruppen. Även om tubulosid B (72) har en 6'-O-kaffeoylgrupp, samma som isoakteosid, minskade intensiteten på grund av dess 2'-aktylgrupp. Intensiteten hos echinakosid (38) och cistanosid B med 6'-O- -D-glukopyranosylgruppgrupper ökade, men intensiteten hos tubulosid A (55) minskade också på grund av dess 2'-aktylgrupp.

Fig. 8 Intensiteten av främst PhG i CD och dess bearbetade produkter

Fig. 9KemiskStrukturer av främst PhGs i CD och dess bearbetade produkter.

Vårt forskarlag studerade också den termiska stabiliteten hos akteosid och isoakteosid och fann att akteosid var instabil i vatten, metanol och gul risvinlösning och kunde omvandlas till isoakteosid delvis under uppvärmning. Men värmestabiliteten hos isoakteosid var bättre, särskilt i gul risvinlösning. Figur 10 visade de möjliga förändringarna av PhGs i CD under bearbetning:

Fig. 10 Den möjliga reaktionen för PhGs under bearbetningen

Identifiering av metaboliterna hos råttor

Från högupplösta masspektrometridata, den exakta molekylvikten och grundämnessammansättningen förmetaboliteroch protomolekylföreningar analyserades och jämfördes. Eftersom samma typer av föreningar i TCM visade likheter i metaboliska modifieringar, kan korrelationerna mellan fytokemiska beståndsdelar in vitro sträcka sig till deras metaboliter in vivo. Under tiden, baserat på konventionella biotransformationsvägar, kunde man sluta sig till en rimlig förändring av molekylvikten. Slutligen, denmetaboliteridentifierades genom att analysera MSE-masspektra för metaboliterna och protoföreningarnas fragmenteringsväg i masspektrumet [21, 22]. Jämfört med blankprovet identifierades dess komponenter in vivo baserat på informationen från kromatogram-masspektrum, möjligheten till en metabolisk reaktion, egenskaperna hos föreningsstrukturen och fragmenteringsregeln för dess masspektrum. Se tabell 3.

Tabell 3 IdentifieradMetaboliteri plasma, urin och avföring av vattenhaltigt extrakt i CD och dess bearbetade produkter

Identifiering av fenyletanolglykosiderrelaterade metaboliter

UNIFI-plattformen användes för bearbetning. Figur 11 visade TIC-kromatografen av urin, avföring och plasma för CD och dess bearbetade produkter. Jämfört med blankprover identifierades totalt 54 metaboliter hos råttor, inklusive 10 prototypkomponenter och 44metaboliter, där 24, 49 och 6 var i avföring, urin och plasma, följaktligen.

Fig. 11 Kromatograf av TIC. Ett urinprov i BC-grupp; B Urinprov i CD-grupp; C Urinprov i CD-NP-grupp; D Urinprov i CD-HP-grupp; E Avföringsprov i BC-grupp; F Avföringsprov i CD-grupp; G Avföringsprov i CD-NP-grupp; H Avföringsprov i CD-HP-grupp; I Plasmaprov i BC-grupp; J Plasmaprov i CD-grupp; K Plasmaprov i CD-NP-grupp; M Plasmaprov i CD-HP-grupp

Baserat på exakt massa, fragmenteringskaskad och förutsägbara neutrala förluster genom biotransformation, totalt 35 fenyletanoidglykosider associerademetaboliterutvärderades preliminärt. De relaterade metaboliterna av fenyletanoidglykosider har liknande masspektrumfragmenteringsmönster, som det typiska koffeoylfragmentet m/z 461.1605, som sedan hydrolyseras ytterligare av glykosid- och esterbindningar in vivo och metaboliseras till hydroxityrosol (HT) (m/ z 153,0504, C8H10O3, 4,73 min) och koffeinsyra (CA) (m/z 179,0389, C9H7O4, 0,77 min), se fig. 12A.

M11 indikerade [M–H]− vid m/z 153,0504 med formeln dvs, C8H10O3, och identifierades som HT. M16 presenterade [M–H]− vid m/z 329,0851, vilket var 176 Da förhöjt än för HT, vilket avslöjade att det kan vara en glukuroniderad metabolit av HT. [M–H]− för M26 var vid m/z 343,1037, 14 Da högre än för HT-glukuronid. Därför identifierades M26 som HT-metylerad glukuronid. M17 identifierades som HT-sulfat baserat på dess [M–H]− vid m/z 233,0112, 80 Da över HT, som kunde metyleras ytterligare, producerade sedan M22, som visade m/z 247,0278, vilket indikerar att det var HT-metylerad sulfateradmetabolit. M7 (m/z 167,0335) och M5 (m/z 167,0762) betraktades som oxidationsprodukter respektive metylerad HT (Fig. 12B).

M1 indikerade [M–H]− vid m/z 179,0389, den belysta molekylformeln var C9H7O4 och identifierades som koffeinsyra (CA). M25 avslöjade [M–H]− vid m/z 355,0704, som var 176 Da förhöjda än för CA, visar att det kan vara en glukuronideradmetabolitav CA. M27 hade m/z 258,994, vilket var 80 Da högre än för CA, så vi klargjorde det som CA-sulfat, och det kunde producera M35 (m/z 273,0064). Eftersom M4 ger [M–H]− vid m/z 193,0524, 14 Da högre än CA, identifierades den som CA-metylerad metabolit. M39 var CA-dehydroxyleringmetabolitmed m/z 163,04, och den kunde sulfateras till M32 (m/z 242,9951).

M33 (m/z 181.0491, C9H10O4, 9,06 min) var reduktionsprodukten av CA, det vill säga 3,4-dihydroxibensenpropionsyra, som kunde metyleras till M19 (m/z 195.0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 skulle kunna dehydroxieras till M43, det vill säga 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min) och M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) och M29 (m/z,0120S,S 8,52 min) var de glukuroniderade och sulfaterade produkterna (Fig. 12C).

För de fenyletanoidglykosider-associerademetaboliter, var de viktigaste metaboliska kaskaderna fas II-metaboliska reaktioner, dvs glukuronidering, metylering och sulfatering. De föreslagna metaboliska kaskaderna av fenyletanoider är avbildade i fig. 13.

Fig. 12 Massspektrum för vissametaboliteri CD-skivor

Fig. 13 Möjlig metabolisk väg för fenyletanoider

Identifiering av iridoidrelaterade metaboliter

Genom att analysera den elementära sammansättningen avmetaboliter, MSE-fragmentering och tillhörande litteratur, totalt 19 iridoidassocierade metaboliter utvärderades preliminärt. Iridoidglykosider hydrolyserades av glykosidbindningar för att bilda deras motsvarande aglykoner. M/z 185,117 var för M8, 162 Da mindre än ajugol, vilket gavs genom förlust av glukosrest.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) var den deglykosylerade produkten av katalpol. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) var mindre än 30 Da den för katalpol-deglykosyleradmetabolit, och identifierades som avlägsnande av en molekyl av CH2O-metabolit. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), var ytterligare förlust av H2Ometabolit.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) var en deglykosylerad metabolit av geniposid, och M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) var deglykosylering av 8-epideoxylogansyra. Metaboliska reaktioner för iridoider kunde avslöjas som fas I-metabolism av deglykosylering (Fig. 12D).

Jämförelse av metabolisk profilering i plasma, urin och avföring mellan CD och dess bearbetade produkter

2 prototyper i plasma, 7 i urin och 3 i avföring jämfördes. Det fanns 7 prototyper absorberade i CD, 7 prototyper absorberade i CD-NP och 8 prototyper i CD-HP. M21 detekterades endast i avföringsgruppen av CD-NP, och M38 och M51 upptäcktes bara i uringrupper av CD-HP. Jämfört med metaboliter, identiskametaboliteri plasma, urin och avföring var 4, 42 respektive 21. Det absorberades 34 metaboliter i CD-gruppen, 39 i CD-NP och 40 i CD-HP-gruppen. M5, M7, M40 och M52 detekterades endast i CD-NP-grupper, medan M24, M41 och M48 just detekterades i CD-HP-grupper.

Variationer observerades i absorptionen och metabolismen av aktiva föreningar i olika bearbetade produkter av CD. Från fig. 14 fann vi att intensiteten av HT-sulfatkonjugering (M17) var den högsta i urinen, följt av 3-HPP-sulfatkonjugering (M29), metylerad HT-sulfatkonjugering (M22), dehydroxylerad CA-sulfat konjugering (M32) och 3,4-dihydroxibensenpropionsyrasulfatkonjugering (M19). Innehållet av metabola produkter i den bearbetade gruppen var högre än i CD-gruppen, särskilt för M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Deras prekursorföreningar, såsom hydroxityrosol, har antitumöregenskaper, antiinflammatoriska, antibakteriella, antivirala och svampdödande egenskaper [23]. Koffeinsyra har antiinflammatoriska, anticancer- och antivirala aktiviteter [24]. Det överensstämde med den kliniska användningen av CD och dess bearbetade produkter.

Diskussion

CD är en TCM, och dess viktigaste bioaktiva komponenter, inklusive PhGs, iridoider, polysackarider har dokumenterats av olika forskningsstudier. I TCM klinisk praxis har de bearbetade produkterna av CD använts i stor utsträckning jämfört med råa. Dekemisksammansättningen kommer att ändras under bearbetningen, vilket kan leda till förändringar i de medicinska effekterna (fig. 14).

Fig. 14 Intensitet för huvudmetaboliteri urin

PhG är en typ av fenolförening som kännetecknas av en -glukopyranosidstruktur som bär en hydroxifenyletyldel som aglykon. Dessa föreningar innefattar ofta koffeinsyra och ramnos bundna till glukosresten genom ester- respektive glykosidbindningar. I den aktuella studien utfördes de kvalitativa analyserna av CD, CD-NP och CD-HP, och totalt 97 föreningar, inklusive fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, etc. identifierades. De erhållna resultaten visade variationerna ikemisksammansättning före och efter bearbetning. Intensiteten hos PhG med 4'-O-caffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen, som akteosid, cistanosid C, campneosid II, osmanthusid minskade efter att ha bearbetats, medan PhGs med 6 '-O-kaffeoylgruppen i 8-O- -D-glukopyranosyldelen, såsom isoacetosid, isocistanosid, isocampneosid I, isomartynosid ökade, särskilt i CD-NP-gruppen. Intensiteten av echinakosid och cistanosid B vars struktur har en 6'-O- -D-glukopyranosyldel ökade också. PhG med 2'-aktylgrupp minskade ofta på grund av hydrosreaktion under processen, som tubulosid B, 2-acetylakteosid.

Utredning avmetaboliterabsorberad in vivo utfördes efter oral administrering av CD och dess bearbetade produkter. De metaboliska processerna i fas II var nyckelkaskaderna och de flesta av metaboliterna var sulfat, glukuronid och metylerade konjugat. Fenyletanolglykosider har låg oral absorption och användning. De är svåra att absorberas i blodet och fungerar som stamfader för att spela sina roller efter metabolisk aktivering in vivo. Fenyletanoider som produceras till fenyletanolaglykon, som hydroxityrosin (HT) och koffeinsyra (CA) och dess derivat 3-hydroxifenylpropionsyra (3-HPP), kan dessa metaboliter lättare absorberas i plasman och ha ett bättre läkemedel effekt.

De flesta avmetaboliterhittades i lägre koncentrationer eller inte upptäckts i råttplasma, men högre koncentration observerades i urinen, vilket tyder på att metaboliter lätt skulle elimineras via urin. Som visas i tabell 3 bestämdes samma föreningar i olika grupper, medan avsevärda variationer hittades i koncentrationerna avmetabolitersom kan associeras med den ojämlika effektiviteten hos CD och dess bearbetade produkter. HT-sulfatkonjugering (M17) har den högsta intensiteten i urinen, följt av 3-HPP-sulfatkonjugation (M29), metylerad HT-sulfatkonjugation (M22), dehydroxylerad CA-sulfatkonjugation (M32) och 3,{{ 7}}dihydroxibensenpropionsyrasulfatkonjugering (M19). Innehållet av metabola produkter i den bearbetade gruppen var högre än i CD-gruppen, särskilt för M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Generellt kan de komponenter som har hög exponering i målorgan vara effektiva. En tillräcklig mängd fenyletanoider och deras derivat har utvärderats och bestämts in vitro. Akteosid är de karakteristiska föreningarna, vars halt minskade efter att ha bearbetats med risvin, och innehållet av isoakteosid, isocistanosid C, isocampneosid I ökade i motsvarande grad. Nedbrytningsprodukterna av PhG, som CA- och HT-derivat kan utvärderas i bioproverna, och bearbetning av risvin kan förbättra absorptionen avmetaboliterin vivo.

Slutsats

I denna studie upptäcktes 97 föreningar i extrakten av CD och dess bearbetade produkt. Nedbrytningen av få glykosider skedde under en förhöjd temperatur och som ett resultat syntetiserades några nya isomerer och komplex. I in vivo-studie, prototypkomponenter (10) ochmetaboliter(44) bestämdes eller preliminärt utvärderades i råttplasma, avföring och urin. Fas II metaboliska processer var nyckelkaskaderna, de flesta av demetabolitervar associerade med echinakosid eller akteosid, som HT, CA och deras derivat 3-hydroxifenylpropionsyra 3-HPP. Dessa metaboliter kan lättare absorberas i plasman och ha en bättre medicinsk effekt. De erhållna resultaten visade attkemisksammansättningen av CD var annorlunda och påverkade dispositionen av föreningen in vitro och in vivo.

Tillgänglighet av data och material

Datauppsättningarna som används och/eller analyseras under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.

Förkortningar

PhG: Fenyletanoidglykosider

CD:Cistanche deserticola

CMM: Chinese Materia Medica

TCM: Traditionell kinesisk medicin

CD-NP:Cistanche deserticolaBearbetad genom ångning med risvin under normalt tryck

CD-HP:Cistanche deserticolaBearbetad genom ångning med risvin under högt tryck

UPLC-Q-TOF-MSE: Ultrahögpresterande vätskekromatografi kopplad med TOF-MSE

PCA: Huvudkomponentanalys

VIP: Variabel betydelse för projektionen

CA: Koffeinsyra

HA: Hydroxytyrosol

Studien för cistanche av kemiska profiler och metabolit

Referenser

1. Kinesisk farmakopékommission. Pharmacopeia of the People's Republic of China, vol. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. sid. 140.

2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. HerbaCistanche(Rou Cong-Rong): en av de bästa farmaceutiska gåvorna inom traditionell kinesisk medicin. Front Pharmacol. 2016;7:41.

3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Effekter av olika torkningsmetoder för FreshCistanche deserticolapå dess komponentinnehåll. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.

4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimering av högtrycksångningsprocessen för Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.

5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Effekter avCistancherherba före och efter bearbetning på anti-aging funktion och immunfunktion hos D-galaktos-inducerade åldrande råttor. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.

6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Studie av laxerande beståndsdelar i Cistanche deserticola YC Ma. Modern Chin Med. 2015;17(4):307–10.

7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Studie om den neuroendokrina-immuna funktionen hosCistanche deserticolaoch dess risvinsångande produkter i den glukokortikoidinducerade råttmodellen. Evid-baserat komplement Alternat Med. 2020;22:5321976.

8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Förbättring av njuruppfriskande funktion i musmodellen av Cistanches herba torkade snabbt vid en medelhög temperatur. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.

9. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desert ginseng": en recension. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.

10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: En översikt över dess kemi, farmakologi och farmakokinetiska egenskaper. J Etnopharmacol. 2018;219:233–47.

11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. HerbaCistanche(Rou Cong Rong): en genomgång av dess fytokemi och farmakologi. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.

12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektiva effekter av echinakosid i mus-MPTP-modellen av Parkinsons sjukdom. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Skyddande effekt av tubulosid B på TNF alfa-inducerad apoptos i neuronala celler. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.

14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Antiinflammatoriska iridoider från stjälkarna avCistanche deserticolaodlade i Tarimöknen. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.

15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Fenyletanoidglykosider med antiinflammatoriska aktiviteter från stjälkar av Cistanche deserticola odlade i Tarimöknen. Fitoterapia. 2013;89:167–74.

16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoid och acykliska monoterpenglykosider, kankanosider L, M, N, O och P frånCistanchetubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.

17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. En ny strategi för att snabbt utforska potentialenkemiskmarkörer för diskriminering mellan rå och bearbetad Radix Rehmanniae av UHPLC-TOF-MS med multivariat statistisk analys. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.

18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Förändringar i nivåer av fenyletanoidglykosider, antioxidantaktivitet och andra kvalitetsegenskaper iCistanche deserticolaskivor genom ångbearbetning. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.

19. Ma ZG, Tan YX. Innehållsförändringar av sex fenyletanoidglykosider under ångande tidsintervall med vin i Desertliving Cistanche. Chin Trad Patent Med. 2011;33(11):1951–4.

20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Effekten av ångningsprocessen på kvaliteten på efterskördcistanche deserticolaför medicinskt bruk under soltorkning. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.

21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W.Metaboliterav dietacteosid: profiler, isolering, identifiering och leverskyddande kapacitet. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Systematisk karakterisering avmetaboliterav echinakosid och acteosid frånCistanchetubulosa i råttplasma, galla, urin och avföring baserat på UPLC-ESI-Q-TOF-MS. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.

23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: en naturlig förening med lovande farmakologiska aktiviteter. J Biotechnol. 2020;309:29–33.

24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Caffeic Acid, en mångsidig farmakofor: en översikt. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.