Cistanche Deserticola-polysackarider förbättrar tarmens åldrande genom att hämma NLRP3-inflammasomaktivering

 

 

Åldrande leder till en gradvis nedgång av flera fysiologiska funktioner och ökar risken för åldersrelaterade sjukdomar [1]. Studier har visat att åldrande har en betydande inverkan på tarmens struktur och funktion [2]. Som kärnorganet för matsmältning, ämnesomsättning och immunförsvar kan tarmens åldrande orsaka näringsmalabsorption, metabola störningar och nedsatt immunförsvar [3-4], och därigenom öka känsligheten för gastrointestinala sjukdomar [5]. Kronisk inflammation är ett kännetecken för tarmens åldrande, men dess molekylära mekanismer är ännu inte helt klarlagda. För närvarande inkluderar anti-aging medel främst beta-nikotinamidmononukleotid (NMN), rapamycin, dasatinib plus quercetin och andra [3]. Bland dessa är NMN en nyckelprekursor för det essentiella koenzymet NAD+, och flera studier har bekräftat att det signifikant fördröjer tarmens åldrande hos naturligt åldrade möss; det är allmänt erkänt inom fältet som en effektiv intervention [4–5]. Därför är det av stor betydelse att utforska relevanta mekanismer och interventionsstrategier.

Cistanche Oral Liquor för åldrande-relaterade sjukdomar

Kontakta nu lär känna cistanche-bönder i Kina

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

Den nukleotidbindande oligomeriseringsdomänliknande receptorfamiljen pyrindomäninnehållande 3 (NLRP3) inflammasom är en nyckelregulator för medfödd immunitet och spelar en viktig roll i åldranderelaterade sjukdomar. Dess aktivering kräver två signaler. Den första signalen: patogenassocierade molekylära mönster (PAMPs) och skadeassocierade molekylära mönster (DAMPs) inducerar uttryck av NLRP3 och prekursorn för interleukin-1 (pro-IL-1). Den andra signalen (som kaliumutflöde och mitokondriell skada) utlöser inflammasomsammansättning, aktiverar caspase-1 och klyver pro-IL-1 och pro-IL-18 för att generera mogna IL-1 och IL-18, vilket driver inflammation [6]. Under åldrandet störs intestinal homeostas, vilket leder till frisättning av pro-inflammatoriska faktorer såsom lipopolysackarid (LPS), som ihållande aktiverar NLRP3-inflammasomen och bildar kronisk låggradig inflammation. Detta förvärrar ytterligare tarmbarriärskada och dysbios, förändrar uttrycket av tight junction-proteiner, ökar tarmpermeabiliteten och påskyndar tarmens åldrande [7–10].

Cistanche deserticola, en uppskattad traditionell kinesisk medicinsk och mathomolog ört känd som "öknens ginseng", tonifierar njurens yang, ger näring till essens och blod och fuktar tarmarna för att lindra förstoppning. Dess aktiva polysackarider uppvisar anti-aging, antioxidant och tarmskyddande egenskaper [11–12]. När det gäller tarmskydd kan Cistanche deserticola polysaccharides (CDP) modulera tarmmikrobiotabalansen genom att hämma aktiveringen av den Toll-like receptor 4 (TLR4)/nukleär faktor-kappa B (NF-KB) vägen, och därigenom minska LPS-nivåerna och reparera tarmbarriärfunktionen [13–14]. CDP kan också förbättra mitokondriell funktion genom aktivering av det AMP-aktiverade proteinkinas (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1) vägen, fördröja cellulär åldrande, reglera lipidmetabolism och lindra lipotoxiska skador i tarmepitelceller [15].

Även om de intestinala skyddande effekterna av CDP har visats, är det fortfarande oklart om de förbättrar tarmens åldrande genom att undertrycka NLRP3-inflammasomvägen. Denna studie syftar till att undersöka mekanismen genom vilken CDP:er hämmar NLRP3-inflammasomaktivering tillförbättra tarmens åldrande.

Material

 

1.1 Försöksdjur

Femtio friska C57BL/6J-möss av hankön (10 vid 2 månaders ålder; 40 vid 20 månaders ålder) köptes från Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd. Produktionslicens: SYXK (Beijing) 2023-0011. Djuren hölls i en barriärmiljö vid den experimentella djuranläggningen vid Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine under följande förhållanden: temperatur 22 ± 2 grader, relativ luftfuktighet 50 % ± 10 % och en 12 h ljus/12 h mörk cykel. Alla möss acklimatiserades under 1 vecka. Denna studie godkändes av den institutionella kommittén för djurvård och användning vid Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine (IACUC-HPHCM-2025001).

 

1.2 Instrument och reagenser

 

Kryostat (Thermo Fisher; CryoStar NX50)

Laser scanning konfokalmikroskop (Nikon; AX)

PCR-system i realtid (Thermo Fisher; 7500)

Multimode plattläsare (Tecan; Spark)

Betanikotinamidmononukleotid (Bontac, Kina; Kat. BT05N120A005)

SA- -gal färgningssats (Solarbio, Beijing; Cat. 250003003)

Mus LPS ELISA-kit (CUSABIO/Huamei, Wuhan; Kat. CSB-E13066m)

TransZol Up Plus RNA-kit (TransGen Biotech, Beijing; Kat. ER501-01-V2)

MonAmp ChemoHS qPCR-blandning (Monad; Kat. MQ00501S)

Lgr5 polyklonal antikropp (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)

ZO-1 monoklonal antikropp, NLRP3 monoklonal antikropp, Caspase-1 monoklonal antikropp, ASC monoklonal antikropp, GAPDH monoklonal antikropp, Ki67 monoklonal antikropp (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab179545, ab510545, ab30545, ab30545, ab30545, ab30545, ab30545)

Metoder

 

2.1 Framställning av Cistanche deserticola polysackarider

Cistanche-material (50 g) extraherades två gånger genom avkok med 8-faldiga volymer vatten, 1 timme varje gång. Filtraten kombinerades och kyldes till rumstemperatur. Vattenfri etanol tillsattes till en slutlig koncentration av 80 % för utfällning. Efter centrifugering kasserades supernatanten. Fällningen löstes i vatten, dialyserades och lyofiliserades sedan för att erhålla provet.

 

2.2 Djurgruppering och administration

Efter acklimatisering tilldelades fyrtio 20 månader gamla C57BL/6J-möss slumpmässigt till: naturlig åldrande grupp, lågdos CDP-grupp (2,5 g·kg−1), högdos CDP-grupp (5,0 g·kg−1) och NMN-grupp (200 mg·kg−1). Ytterligare tio 2 månader gamla SPF C57BL/6J-möss fungerade som en ung kontrollgrupp. De låga och höga CDP-doserna gavs genom oral sondmatning vid 2,5 g·kg−1 respektive 5,0 g·kg−1. Om man använder kroppsytaomvandling och en människa-till-mus-omvandlingsfaktor på 12 [16] motsvarar dessa ungefär 1× och 2× den kliniska ekvivalentdosen för vuxna. NMN-gruppen fick NMN 200 mg·kg−1 genom sondmatning. Unga kontrollgrupper och grupper med naturligt åldrande fick lika volymer fysiologisk koksaltlösning (10 mL·kg−1). Behandlingar administrerades kontinuerligt i 2 månader.

 

2.3 Beredning av frysta sektioner

Möss bedövades genom intraperitoneal injektion av natriumpentobarbital (30 mg·kg-1) och avlivades. Buken öppnades snabbt, mesenteriet separerade och ilealvävnad samlades in och snittades vid 5 μm för frusna sektioner [17].

 

2.4 SA- -gal-analys för intestinal galaktosidasaktivitet

Färgning utfördes enligt SA- -gal kit-instruktionerna. Efter inkubation avlägsnades färgningslösningen och sektioner tvättades med PBS. Bilderna samlades in med hjälp av ett inverterat mikroskop.

 

2.5 Realtids-PCR för senescensassocierad sekretorisk fenotyp (SASP)

Totalt RNA från ileal vävnad extraherades med hjälp av TransZol Up Plus-kitet. Omvänd transkription utfördes med GoScript-systemet under följande förhållanden: 42 grader i 15 minuter, 70 grader i 15 minuter, 4 grader i 10 minuter. Realtids-PCR utfördes med MonAmp ChemoHS qPCR Mix med följande cykling: 95 grader 10 min; sedan 40 cykler på 95 grader 15 s, 60 grader 1 min. Smältkurva: 95 grader 15 s, 60 grader 15 s, 95 grader 15 s. GAPDH fungerade som intern referens, och relativ kvantifiering använde 2^-ΔΔCt-metoden. Primers köptes från Promega. Primersekvenser visas i tabell 1.

 

2.6 Immunfluorescensfärgning för uttryck av ZO-1

Ilealvävnad fixerades i 4% paraformaldehyd och paraffinsnittades vid 5 μm. Sektioner permeabiliserades med 0,3 % Triton X-100 i 15 minuter och blockerades med 10 % getserum under 1 timme vid rumstemperatur. Primär antikropp mot ZO-1 (1:200) applicerades över natten vid 4 grader. Efter PBS-tvättar inkuberades Cy3-konjugerad sekundär antikropp (1:500) i 1 timme vid rumstemperatur i mörker. Kärnor motfärgades med DAPI under 5 min. Objektglasen monterades med antiblekningsmedium och avbildades med konfokalmikroskopi. Fluorescensintensiteten kvantifierades med hjälp av programvaran Image-Pro.

2.7 Immunhistokemi för uttryck av Ki67 och Lgr5

Ileala sektioner inkuberades med primära antikroppar Ki67 (1:1000) och Lgr5 (1:200) över natten vid 4 grader enligt IHC-kitprotokollet, sedan med motsvarande sekundära antikroppar. DAB användes för kromogen utveckling. Resultaten observerades med ljusmikroskopi. Den genomsnittliga optiska densiteten kvantifierades med hjälp av programvaran Image-Pro.

 

2.8 ELISA för LPS-nivåer

Standarder och prover (100 μL per brunn) sattes till plattan och inkuberades vid rumstemperatur i 1,5 timme. HRP-konjugerad streptavidinlösning (100 μL per brunn) tillsattes sedan och inkuberades i 30 minuter. Substrat tillsattes under ljusskyddade betingelser och fick reagera under 30 min. Reaktionen avslutades med stopplösning och absorbansen mättes vid 450 nm.

 

2.9 Western blot för NLRP3, Caspase-1 och ASC

Ungefär 30 mg ilealvävnad maldes i flytande kväve. RIPA-lysbuffert innehållande proteas/fosfatasinhibitorer tillsattes; lysaten inkuberades på is under 30 minuter och centrifugerades vid 12 000 x g, 4 grader i 15 minuter för att samla supernatanter. Proteinkoncentrationen bestämdes med BCA-analys och justerades till 2 ug/μL. Lika mängder protein (20–40 ug) separerades med SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran. Membran blockerades med 5 % fettfri mjölk under 1 timme vid rumstemperatur, inkuberades med primära antikroppar (NLRP3 1:1000, Caspase-1 1:500, ASC 1:1000) över natten vid 4 grader, sedan med HRP-konjugerade sekundära antikroppar vid rumstemperatur (1:10 h00) i rumstemperatur (1:50 timmar). Efter TBST-tvättar utvecklades signaler. Bandintensiteterna normaliserades till GAPDH.

 

2.10 Statistisk analys

Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Statistisk analys och grafritning utfördes med SPSS 26.0 respektive GraphPad Prism 8.0.2. Envägs-ANOVA användes för att bedöma skillnader mellan grupper, följt av Tukeys post hoc-test. Statistisk signifikans sattes till P < 0,05.

 

Praktiska anteckningar för läsare som är intresserade av tarmmotilitet och utveckling av kosttillskott

 

Funktionellt fokus för Cistanche deserticola: Används traditionellt för att fukta tarmarna och lindra förstoppning; modern datastöd barriärstöd, inflammationsmodulering (TLR4/NF-KB) och mitokondriell funktion via AMPK/SIRT1.

Potentiell anti-aging tarmmekanism utforskas här: Undertryckande av NLRP3-inflammasomaktivering; minskning av LPS-driven låggradig inflammation; bevarande av täta korsningar (t.ex. ZO-1); underhåll av epitelial proliferation/stamness-markörer (Ki67, Lgr5).

Typiska experimentella orala doser hos möss: 2,5–5,0 g·kg−1 CDP under 2 månader; NMN 200 mg·kg−1 som positiv kontroll.

Translationell försiktighet: Musdoser är inte direkta rekommendationer för människor. Studien använder skalning av kroppsyta; humanekvivalenta formuleringar och säkerhet, identitetstestning och GMP-tillverkning är nödvändiga före produktutveckling.