Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosiders inducerar apoptos i H22 hepatocellulära karcinomceller genom både yttre och inre signalvägar

Bakgrund

Levercancer rankad sjätte för cancerincidens och fjärde för cancerdödsfall över hela världen. Dessutom rankades den fjärde för cancerförekomst och först för cancerdödlighet i länder med lågt sociodemografiskt index [1]. I Kina är levercancer den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad död 2015 [2]. Mer än 90% av primär levercancer är hepatocellulärt karcinom (HCC) i världen [3]. För närvarande är leverresektion det huvudsakliga alternativet för behandling av HCC. Men mindre än 30 % av patienterna med HCC uppfyllde kriterierna för kurativ leverresektion och den totala 5-årsöverlevnaden är fortfarande så låg som 35-50% på grund av den höga återfallsfrekvensen [4, 5] . Tillgången på behandlingsalternativ för patienter med medel till avancerad HCC är mycket begränsad. Sorafenib, ett molekylärt riktat läkemedel, har godkänts av FDA som förstahandsbehandling för avancerad HCC. Sorafenib förlänger dock endast cirka 3 månaders överlevnad och svarsfrekvensen är mindre än 4 % [6, 7]. Det är angeläget att utveckla nya läkemedel eller strategier mot HCC.

Traditionell kinesisk medicin (TCM) ensam eller i kombination med andra strategier har använts för att behandla HCC och visat kliniska fördelar inklusive förlängd överlevnadstid, förbättrad livskvalitet, minskade biverkningar och så vidare [8, 9]. Cistanche, en sorts TCM, har olika biologiska funktioner, såsom antioxidation, antiinflammation, anti-aging och neuroprotection [10, 11]. Fenyletanoidglykosider har ansetts vara de viktigaste aktiva komponenterna i Cistanche, som har olika aktiviteter inklusive antioxidation, antiinflammation, leverskydd och neuroprotection [12-15]. Vår grupp har rapporterat detCistanche tubulosa fenyletanoidglykosider (CTPG)kan inducera apoptos i melanom B16-F10-celler och hämma tillväxten av tumörer hos möss [16]. I denna studie mätte vi antitumöreffekten av CTPG på HCC H22-celler både in vitro och in vivo och undersökte dess mekanismer. Vi fann att CTPG inducerade apoptos i H22-celler genom både yttre och inre signalvägar och undertryckte tillväxten av H22-tumörer hos möss.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metoder

Cellinje

Mus-H22-hepatocellulära karcinomceller erhölls från Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, Kina) och odlades i RPMI 1640-medium (Gibco) kompletterat med 100 U/ml penicillin och 100 ug/ml streptomycin och 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (Gibco) vid 37 grader i en fuktad atmosfär med 5 % CO2.

MTT-analys

CTPG köptes från Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Kina) och de viktigaste föreningarna i CTPG kvalificerades och kvantifierades genom högpresterande vätskekromatografi [16]. Cellviabiliteten utvärderades av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , USA) analys. H22-celler inokulerades i 96-brunnsplattor med en densitet av 2 × 104 celler i 100 ul medium per brunn och odlades vid 37 grader. Efter 24 timmar behandlades celler med olika koncentrationer av CTPG (0, 100, 200, 300 och 400 ug/ml) eller 0,3 % DMSO (lika med det i 400 ug/ml CTPG) under 24, 48 och 72 timmar, respektive. Efter centrifugering vid 1000 rpm under 7 minuter kastades supernatanten och 100 ul MTT-lösning (5 mg/ml i PBS) sattes till varje brunn. Plattorna inkuberades vid 37 grader under 4 timmar och 100 ul DMSO tillsattes för att lösa upp de bildade formazankristallerna. OD490-värdena detekterades av en 96-brunnsmikroplattläsare (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Cellviabiliteten beräknades enligt formeln: Cellviabilitet (%)=(ODbehandlad/ODobehandlad) × 100%.

Detektion av apoptos

H22-celler behandlades med olika koncentrationer av CTPG (0, 100, 200, 300 och 400 ug/ml) eller 0,3 % DMSO under 24 timmar och färgades sedan med Annexin VFITC/Propidium jodid (PI) Apoptos Detection Kit (YEASEN, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Prover analyserades med flödescytometri (BD FACSCalibur, USA).

Detektion av mitokondriell membranpotential

H22-celler behandlades med olika koncentrationer av CTPG (0, 200 och 400 ug/ml) under 24 timmar och färgades sedan med det membrangenomsläppliga JC-1-färgämnet (Beyotime, Kina) i 20 timmar min vid 37 grader. Efter tvättning två gånger med JC-1-buffert återsuspenderades proverna med 300 ul JC-1-buffert och analyserades med flödescytometri (BD FACSCalibur, USA).

Analys av cellcykeln

H22-celler inokulerades i 60 mm odlingsskålar och behandlades med olika koncentrationer av CTPG (0, 100, 200, 300 och 400 ug/ml) eller 0,3 % DMSO i 24 timmar. Alla celler uppsamlades och tvättades två gånger med PBS. Celler fixerades i 70% iskall etanol vid -20 grader i 2 timmar och tvättades två gånger med PBS, sedan återsuspenderades i 300 ul propidiumjodid/RNas-färgningsbuffert (BD Biosciences). Efter 10 minuter vid rumstemperatur samlades prover med flödescytometri (BD FACSCalibur, USA), och cellcykelfördelningen analyserades med ModFit LT 3.0-programvaran.

Hoechst 33 258 färgning

De morfologiska förändringarna av H22-cellkärnor analyserades genom membranpermeabelt DNA-bindande färgämne Hoechst 33,258-färgning. H22-celler såddes i en 6-brunnsplatta i koncentrationen 1 × 105 celler/brunn i ett 2 ml medium. Efter 60 % ~ 70 % konfluens behandlades cellerna med CTPG (0, 100, 200, 300 och 400 ug/ml) under 24 timmar. Cellerna samlades upp och fixerades med 4% iskall paraformaldehyd vid 4 grader under 10 min. Efter tvättning med PBS färgades cellerna med Hoechst 33,258 (Beyotime, Kina) vid 4 grader under 10 minuter. Prover observerades med ett inverterat fluorescensmikroskop (Nikon Eclipse Ti-E, Japan).

Western blot

Anti-kaspas-3, anti-klyvt kaspas-3, Anti-Bcl-2 och antiBax köptes från Beyotime Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Anti-kaspas-7, anti-klyft-kaspas-7, anti-kaspas-8, anti-klyvt-kaspas-8, anti-kaspas-9, anti-kaspas -cleaved-caspase-9, anti-PARP, anti-cleaved PARP, antimus IgG-HRP och anti-kanin IgG-HRP köptes från Cell Signaling Technology. Anti- -aktin köptes från Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Peking, Kina).

H22-celler behandlades med olika koncentrationer av CTPG (0, 100, 200, 300 och 400 ug/ml) eller 0,3 % DMSO under 24 timmar. Celler uppsamlades och lyserades med Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) under 30 minuter på is. Prover snurrades ner (12,000 g under 15 minuter vid 4 grader) för att samla upp supernatanterna och proteinkoncentrationerna mättes med BCA Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). En lika stor mängd protein i varje prov isolerades med 12% SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran (Biosharp, Kina). Efter blockering med TBST-buffert innehållande 5 % fettfri mjölk, inkuberades membran med motsvarande primära antikroppar respektive sekundära antikroppar konjugerade till pepparrotsperoxidas (HRP). Efter tvättning med TBST detekterades målproteinerna med ett ECL-analyskit (Beyotime, Kina).

Djur och etikförklaring

6-8 veckor gamla Kunming-hanmöss köptes från Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kina). Möss hölls i en standardtemperaturkontrollerad, lättcyklad djuranläggning vid Xinjiang University. Alla djurstudier utfördes enligt riktlinjerna från djurvårds- och användningskommittén vid Xinjiang University. Protokollet godkändes av kommittén för etik av djurförsök vid Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (BRGE-AE001), Xinjiang University.

Studie av tumörmus

För induktion av tumörmusmodellen injicerades Kunming-hanmöss subkutant med 1 × 1 06 H22-celler i 100 ul PBS i den högra flanken. Efter 3 dagar delades mössen slumpmässigt in i 3 grupper (7 möss/grupp). Kontrollgruppen injicerades med 0,1 ml DMSO subkutant runt tumören. CTPG-200- och CTPG-400-grupperna injicerades subkutant med 200 eller 400 mg/kg CTPG i 0,1 ml DMSO runt tumören. Möss behandlades varannan dag i upp till 21 dagar. Tumörstorlekar mättes med skjutmått i upp till 25 dagar och tumörvolymen beräknades enligt formeln: tumörvolym (mm3)=(längd×bredd2)/2. Efter 25 dagar övervakades tumörmössens överlevnad varje dag fram till slutet av denna studie.

Statistisk analys

Statistisk signifikans beräknades genom envägsanalys av varians mellan behandlings- och kontrollgrupperna. Alla data uttrycktes som medel ± standardavvikelse (SD). p < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.

Resultat

CTPG minskade livskraften för H22-celler in vitro

För att utforska antitumöreffekten av CTPG på HCC, behandlades H22-celler med olika koncentrationer av CTPG (0, 100, 200, 300 och 400 ug/ml) in vitro. Efter 24 timmar observerades morfologin hos H22-celler med användning av ett inverterat mikroskop. Vi fann att morfologin hos H22-celler förändrades dramatiskt genom CTPG-behandling. Med ökande CTPG-koncentration blev cellerna små och runda och cellantalet reducerades också kraftigt (Fig. 1a). MTT-analys användes för att analysera livsdugligheten hos H22-celler efter CTPG-behandling under 24, 48 respektive 72 timmar. CTPG minskade signifikant H22-cellviabiliteten på ett dosberoende och tidsberoende sätt (Fig. 1b). CTPG vid 300 ug/ml nådde den bästa hämmande hastigheten (fig. le). Värdena på IC50 för CTPG för H22-celler är 236 ug/ml vid 24 timmar och 169,8 ug/ml vid 48 timmar.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA MINNET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

CTPG inducerade apoptos i H22-celler

För att undersöka om den minskade livsdugligheten för H22-celler medieras av induktion av apoptos, behandlades H22-celler med olika koncentrationer av CTPG (0, 100, 200, 300 och 400 ug/ml) under 24 timmar och färgades med PI och Annexin V. Flödescytometriresultaten visade att CTPG signifikant inducerade apoptos av H22-celler (inklusive tidig och sen apoptos) på ett dosberoende sätt (Fig. 2a). Även om den höga dosen av CTPG också signifikant ökade nekros av H22-celler, spelar nekros en mindre roll i hämningen av H22-celltillväxt på grund av dess lägre andel (8,3 %) jämfört med apoptos (52,6 %). Vidare isolerades totala proteiner av H22-celler efter CTPG-behandling, och uttrycken av anti-apoptotiskt B-cellslymfom 2 (Bcl-2) och proapoptotiskt BCL-2-associerat X-protein (Bax) detekterades av Western utplåna. Gråskaleskanningsdata visade att uttrycksnivåerna för Bax och Bcl-2 ökade respektive minskade. Bax/Bcl-2-förhållandet ökade signifikant (Fig. 2b). Dessa resultat tyder på att CTPG inducerar apoptos i H22-celler.

CTPG inducerar kromosomal kondensation och cellcykelstopp i H22-celler

Det har rapporterats att DNA-skada och cellcykelstopp inducerad av läkemedel kan hämma tumörcelltillväxt och orsaka apoptos i tumörceller [17, 18]. För att detektera morfologin hos kärnor i H22-celler efter CTPG-behandling i 24 timmar, färgades H22-celler av Hoechst 33 342 och observerades med användning av inverterad fluorescensmikroskopi. CTPG-behandlade celler visade en dosberoende ökning av ljust kondenserad kromatin av kärnor, medan de obehandlade cellerna visade homogent färgade kärnor (Fig. 3a). Cellcykelfördelning i H22-celler analyserades ytterligare genom PI-färgning efterCTPG-behandlingi 24 timmar. Som visas i fig. 3b ökade CTPG-behandling signifikant andelen G0/G1-- och G2/M-fasceller och minskade signifikant andelen S-fasceller, vilket tyder på att CTPG inducerade G 0/G1 och G2/Mphas arrest i H22-celler. Den höga dosen av CTPG ökade också signifikant andelen sub-G1-celler.

CTPG minskade mitokondriell membranpotential och ökade frisättningen av cytokrom c

Mitokondrieberoende väg spelar en viktig roll i induktionen av apoptos [19, 20]. Förändringarna i mitokondriell membranpotential (Δψm) kan övervakas med JC-1-färgning eftersom JC-1-aggregat (röd fluorescens) kan sönderfalla till en monomer (grön fluorescens) med minskningen av Δψm [21]. Efter CTPG-behandling i 24 timmar färgades H22-celler med JC- 1-färgämne. Flödescytometridata visade att den röda fluorescensen i FL-2-kanalen och den gröna fluorescensen i FL-1-kanalen minskade signifikant och ökade vid CTPG-behandling. Andelen PE-FITC+-celler ökade signifikant (Fig. 4a), vilket tyder på att CTPG minskade Δψm i H22-celler. Detta överensstämmer med det ökade Bax/Bcl-2-förhållandet. Följaktligen observerade vi att frisättningen av cytokrom c ökade signifikant vid CTPG-behandling (Fig. 4b). Dessa resultat indikerade att CTPG delvis kan inducera apoptos i H22-celler via en mitokondrieberoende (inneboende) väg.

CTPG aktiverade kaspasvägen och förhindrade DNA-reparation

Därefter analyserades aktiveringen av kaspas inducerad av CTPG via både yttre och inre signalvägar. Efter CTPG-behandling i 24 timmar isolerades totala proteiner från H22-celler och nivåerna av pro- och kluvna kaspaser detekterades med Western blot. Jämfört med den obehandlade eller DMSO-kontrollen uppreglerade CTPG-behandling signifikant inte bara nivån av klyvd kaspas -8 (extrinsic pathway) utan också nivån av klyvd caspas -9 (intrinsic pathway) (Fig. 5). Aktiverat kaspas-8 och -9 klyvde sekventiellt nedströms pro-kaspas-3 och -7 som observerades i fig. 5. Aktiverat kaspas-3 klyvde DNA:t reparationsenzym av poly(ADP-ribos)-polymeras (PARP) för att förhindra DNA-reparation och ackumulera DNA-skada såsom observerats i fig. 3a.

Dessa resultat indikerade att CTPG inducerade apoptos i H22-celler genom både yttre och inre signalvägar.

CTPG undertrycker tillväxten av H22 HCC in vivo och förbättrar överlevnaden för tumörmöss

Slutligen utvärderades antitumöreffekten av CTPG på HCC i en tumörmusmodell, som etablerades genom subkutan injektion av H22-celler. Efter 3 dagars H22-cellinjektion behandlades tumörmöss med CTPG 8 gånger. Kroppsvikten hos möss och tumörstorlekar övervakades vid angivna tidpunkter. Såsom visas i fig. 6a har kroppsvikten hos möss i varje grupp ingen signifikant skillnad, vilket tyder på att de valda doserna av CTPG inte har några uppenbara biverkningar.

Intressant nog hämmades tumörtillväxten hos möss behandlade med både 200 mg/kg och 400 mg/kg CTPG signifikant (Fig. 6b). Dessutom förbättrade de två doserna av CTPG-behandling avsevärt överlevnaden för tumörmöss (3/7, 3/7) jämfört med kontrollgruppen (0/7) vid slutet av experimentet (fig. 6b). Vi fann också att CTPG signifikant ökade proliferationen av splenocyter isolerade från Kunming-hanmöss på ett dosberoende sätt (Fig. 6c), vilket tyder på att CTPG har immunstimulerande effekt.

CISTANCHE TUBULOSA AV HÖGSTA KVALITET FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskussion

TCM har använts för att behandla olika sjukdomar inklusive cancer under en lång historia. Det har rapporterats att TCM kan inducera apoptos i olika typer av tumörceller genom både extrinsiska (dödsreceptormedierade) och inre (mitokondrierberoende) signalvägar för att utöva antitumöreffekter [22–25]. De två vägarna kan aktivera caspas-8 respektive -9 [24, 26]. Här fann vi att CTPG signifikant undertryckte H22-celltillväxt genom induktion av apoptos och cellcykelstopp. Nivåerna av kluvna kaspas-8 och -9 uppreglerades avsevärt avCTPG-behandling, vilket tyder på att både yttre och inre signalvägar var involverade i induktionen av apoptos. Vår tidigare studie visade att CTPG inducerade apoptos i melanom B16-F10-celler genom en mitokondrieberoende väg som ökade nivån av klyvt kaspas-9 men inte kaspas-8 [16]. CTPG kan aktivera distinkta signalvägar i olika typer av tumörceller.

Mitokondriell membranintegritet regleras hårt av medlemmarna i BCL-2-proteinfamiljen inklusive Bax och Bcl-2 [27, 28]. Förhållandet mellan Bax och Bcl-2 spelar en avgörande roll i den mitokondrieberoende apoptosvägen [29]. I H22-celler behandlade med CTPG var Bax/Bcl-2-förhållandet signifikant uppreglerat, vilket kan orsaka minskningen av Δψm och frisättningen av cytokrom c som observerades i denna studie. Följaktligen klyvdes pro-kaspas-9 och aktiverades. Slutligen aktiverade initiativtagarna till aktivt kaspas-8 och -9 bödeln av kaspas-3 för att klyva PARP för att förhindra DNA-reparation. Sammantaget antydde dessa resultat att CTPG inducerade apoptos i H22-celler genom både yttre och inre signalvägar.

I en tumörmusmodell undertryckte CTPG tillväxten av H22 HCC avsevärt och förbättrade kraftigt överlevnaden för tumörmöss. Intressant nog främjade CTPG dosberoende spridningen av splenocyter från Kunming-möss, vilket överensstämmer med vår tidigare studie [16]. Dessa resultat antydde att CTPG kan undertrycka tillväxten av H22 HCC hos möss genom både direkt antitumöreffekt och indirekt immunförstärkning.

Slutsatser

CTPG undertryckte tillväxten av H22-celler både in vitro och in vivo och inducerade apoptos i H22-celler genom både yttre och inre signalvägar. Dessa data indikerade att CTPG kan vara en potentiell kandidat för behandling av HCC.