Cistanoside Of Cistanche Herba förbättrar hypoxi-inducerad reproduktionsskada hos män via dämpning av oxidativ stress-Ⅱ

Effekter av Cis på hypoxi-inducerad GC-1 cellviabilitet in vitro.

För att undersöka om Cis kan förhindra de hämmande effekterna av hypoxi på GC{0}} cellviabilitet, utfördes en CCK-8-analys. GC-1-celler behandlades med olika undertyper (Cis-A, B, C, H) och koncentrationsintervall (0.02 μM, 0.2 μM, 2 μM) Cis i 72 timmar. En jämförelse av modellgruppen med DMSO-gruppen visade att DMSO inte direkt främjade GC{{10}}-cellviabilitet (Figur 2A). Cellviabiliteten återställdes dock markant (P < 0.05) med Cis-behandlingar. Jämfört med modellgruppen visade Cis-A, Cis-B, Cis-C och Cis-H alla vissa skyddande effekter på hypoxi-inducerad skada på GC-1 cellviabilitet, och Cis-B visade den mest signifikanta effekt (Figur 2A). De skyddande effekterna av Cis vid 0,2 μM var signifikant högre än de skyddande effekterna av Cis vid 0.02 μM, medan skillnaden mellan 2 μM och 0,2 μM inte var uppenbar, vilket tyder på att den återställda GC-1-cellviabilitet inducerad av Cis visade en dosberoende ökning i koncentrationsintervallet från 0.02-0.2 μM (Figur 2A). Därför, enligt de experimentella behoven, valdes 0,2 μM Cis som den optimala koncentrationen i följande in vitro-experiment. För att ytterligare bekräfta om könsceller verkligen skyddades av Cis, utfördes FCM- och Ki-67-färgning för att bedöma förändringen av proliferationen av GC-1-celler efter behandling med Cis. Vid Cis-behandling minskade andelen GC-1-celler i G1-fasen. Däremot gick fler celler in i S-fasen, vilket tyder på att Cis-behandling kan öka könscellsproliferationsindex (P < 0,01; Figur 2B). Statistiken för GC-1-cellcykeln visas i figur 2Bb. Ki-67-färgningsresultaten visade också att behandling med Cis-A, Cis-B, Cis-C och Cis-H signifikant förbättrade Ki-67-positiva cellförhållandet av hypoxi-inducerad GC{{54} } celler in vitro (Figur 2C).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mekanismen för Cis skyddar könsceller från hypoxi in vitro.

För att undersöka om de skyddande effekterna av Cis på GC-1-celler var relaterade till avlägsnandet av överdriven ROS, användes det fluorescerande färgämnet DCFH-DA för att detektera ROS-nivåer i varje grupp. Såsom visas i figurerna 3A och 3B ändrade behandling med DMSO inte det intracellulära ROS-innehållet eller LPO-nivån jämfört med modellgruppen. ROS-nivåer i GC-1-celler reducerades dock markant i de Cis-behandlade grupperna (Figur 3A). Dessutom observerades en minskning av LPO även i GC-1-celler som utsatts för Cis (Figur 3B).

För att ytterligare utforska mekanismen genom vilken Cis skyddar könsceller från hypoxisk skada, utfördes TUNEL-färgning och Western blot-analyser för att utvärdera apoptos. TUNEL-färgning (Figur 3C) visade signifikant apoptos i modellen och DMSO-grupperna. Emellertid observerades färre apoptotiska celler med Cis-behandling, vilket indikerade att Cis-behandling minskade GC-1-cellsapoptos. Dessutom mättes uttrycket av PARP, Caspase-3, Bax och Bcl-2 för att bekräfta den molekylära mekanismen. Som visas i figur 3D aktiverades Caspase-3 och PARP i GC-1-celler under hypoxi, och denna aktivering inhiberades av Cis-behandling. Dessutom var förhållandet Bax/Bcl-2 högre i modellgruppen än i kontrollgruppen, och Cis-behandling minskade förhållandet Bax/Bcl-2 (Figur 3D). Dessa data indikerade att Cis hade en potentiell förmåga att dämpa hypoxi-inducerad oxidantskada, och denna skyddande effekt kan uppnås genom att minska ROS-ackumulering och hämma Caspaser-relaterad apoptosvägaktivering.

Den enzymatiska mekanismen som hämmar OS involverar fria radikaler såsom glutationreduktas (GR), glutationperoxidas (GPx) och superoxiddismutas (SOD) [23]. Den enzymatiska mekanismen som hämmar OS spelar en viktig roll för att förhindra oxidativ skada i celler och vävnader [23]. För att ytterligare validera den potentiella mekanismen för Cis-hämning av hypoxiinducerad OS i GC-1-celler, mättes aktiviteterna för GR, GPx och SOD. Resultaten avslöjade att GR-, GPx- och SOD-aktiviteter alla signifikant (P < 0.01, figur 3E) minskade under hypoxi jämfört med kontrollgrupperna, och Cis-behandling återställde markant deras aktiviteter i GC-1-celler exponerade för hypoxi (P < 0,05, figur 3E), vilket tyder på att dessa föreningar kan aktivera det kraftfulla endogena antioxidantsystemet.

CISTANCHE TUBULOSA FÖR STIMULERING AV SPERMAPRODUKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Effekter av Cis på reproduktion hos hypobariska hypoxiinducerade råttor.

För att bestämma effekterna av hypobar hypoxi på råttor av hankön testade vi först morfologiska förändringar av testiklarna hos råttor som inducerats av hypobarisk hypoxi. Resultaten av HE-färgning visade att i kontrollgruppen var normala spermatogena celler i olika stadier ordnade på ett ordnat sätt från basalmembranet till lumen, och mogna spermier var synliga i tubuli lumen (Figur 4A). Jämfört med kontrollerna observerades patologiska förändringar av testikelvävnad i modellgruppen, basalmembranet i testikelepitelceller var löst arrangerat, det spermatogena epitelet var extremt tunt och nivån och antalet könsceller reducerades markant (Figur 4A) . Emellertid förbättrade behandling med Cis anmärkningsvärt histologin för hypobarisk hypoxi-inducerad testikelskada in vivo (Figur 4A). Vi mätte också kroppsvikt, testikelvikt, bitestikelvikt och seminal vesikelkörtelvikt, vilket ledde till att reproduktionsorganindex (förhållandet reproduktionsorgan/kroppsvikt) beräknades. Som visas i figur 4B-D var reproduktionsorganindex (testiklar, bitestikel och sädesblåskörtel) markant lägre i modellgruppen (P < 0.01) än i kontrollgruppen. Emellertid reverserades effekten av hypobar hypoxi på reproduktionsorganindex hos råttor med Cis-behandling (Figur 4B-D).

Därefter mättes också akrosomenzymaktiviteten och den levande spermiehastigheten hos råttspermier av hankön för att belysa testikelfunktionsskada. Som visas i figur 4E, 4F, var akrosomenzymaktivitet och spermiemotilitet lägre i modellgruppens råttor än i kontrollgruppen (P < 0.01). Jämfört med råttor i modellgruppen återställdes emellertid akrosomenzymaktivitet hos råttor behandlade med 8 mg/kg/d Cis (P < 0,05) (Figur 4D). Dessutom, såsom visas i figur 4F, behandling med Cis ocksåökade antalet levande spermier; råttorna som behandlats med 8 mg/kg/d Cis visade alla en signifikant ökad andel levande spermier (55,83 ± 6,03 %, P < 0.05; 69.{ {8}} ± 2,29 %, P < 0,01; .

Sammantaget antydde dessa resultat att den hypobariska hypoxiska miljön ledde till testikelmorfologiska förändringar, viktminskning av reproduktionsorgan och skador på testiklarnas funktion hos hanråttor, och Cis kunde effektivt skydda reproduktionsorganen från hypoxiinducerad skada.

Effekter av Cis på OS i testiklarna hos hypobariska hypoxiinducerade råttor.

ROS- och LPO-nivåerna i testiklarna hos råttor mättes för att analysera effekterna av Cis på hypobarisk hypoxi-inducerad OS. ROS-analys visade att jämfört med kontrollgruppen ökade ROS-nivåerna i testiklarna i modellgruppen signifikant (P < 0.01 Figur 5A). Omvänt var LPO dramatiskt förhöjd i testiklarna (P < 0.01) under hypobar hypoxi jämfört med normoxiska tillstånd (Figur 5B). Cis-behandling förändrade emellertid ovanstående förändringar (P < 0,05), där Cis-B utövade bättre effekter än andra Cis (Figur 5A, 5B). Cis verkade skydda testiklarna genom att minska OS under hypobariska hypoxiska förhållanden in vivo.

Dessutom utfördes apoptosanalyser för att ytterligare utvärdera mekanismen genom vilken Cis skyddade mot hypobarisk hypoxi-inducerad testikelfunktionsskada. Resultaten av TUNEL-färgning (Figur 5C) visade att signifikant apoptos existerade i modellgruppen jämfört med kontrollgruppen. Efter Cis-behandling (8 mg/kg/d) inträffade dock färre apoptotiska celler (P < 0.05) (Figur 5C). Western blot-data visade också att hypoxi och hypobarisk behandling resulterade i aktivering av Caspase-3 och PARP och ett ökat Bax/Bcl-2-förhållande i testikelvävnad, vilket indikerar en ökning av apoptos (Figur 5D). Dessutom olika typer avCis behandlingsignifikant reducerad apoptos i testikelvävnad (Figur 5D). På liknande sätt visade IHC-analysen av testikelvävnad liknande resultat (kompletterande figur 1).

För att verifiera mekanismen för Cis-reducerad OS utlöst av hypobar hypoxi, testade vi ytterligare aktiviteterna hos GR, GPx och SOD i testikelvävnad. Som visas i figur 5E, jämfört med kontrollgruppen, reducerade hypobarisk hypoxibehandling signifikant GR-, GPx- och SOD-aktiviteter (P < 0.01). Emellertid återställde Cis-behandling enzymaktiviteterna (GR, GPx och SOD) hos testikelvävnad hos råttor behandlade med hypobar hypoxi (P < 0,05). Sammanfattningsvis verkade Cis skydda testiklarna genom att aktivera en kraftfull endogen antioxidantenzymförsvarsmekanism under hypobariska hypoxiförhållanden.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskussion

I höghöjdsområden är hypobar hypoxi känd för att påverka flera system hos människor, inklusive det manliga reproduktionssystemet [4, 20]. Nyligen genomförda experimentella undersökningar är inriktade på att förstå mekanismerna för hur hypobarisk hypoxi försämrar det manliga reproduktionssystemet. I denna studie undersöktes den terapeutiska effekten av Cis-extrakt från Cistanches Herba på hypoxiinducerad reproduktionsskada. Resultaten visade att Cis kan skydda det manliga reproduktionssystemet från hypoxisk skada genom att minska hypoxiinducerad ROS-ackumulering och OS genom att förbättra aktiviteten hos endogena antioxidantenzymer.

ROS är syrehärledda fria radikaler som spelar en viktig roll i människans fysiologi och patologi. Låga doser av ROS är avgörande förspermiekapacitet, akrosomreaktionen och spermatozoa-oocytfusion [24, 25]. Men överdriven ackumulering av ROS leder ofta till skador på könsceller och stromaceller, vilket resulterar i manlig infertilitet [26]. ROS kan lätt skada cellmembran, nukleinsyror, proteiner, enzymer och andra biologiska makromolekyler genom peroxidation. Dessutom leder de också till potentiell cell- och DNA-skada när de överskrider antioxidantkapaciteten. Ackumulerade bevis stöder den centrala rollen för ROS i patogenesen av manlig fertilitet [27, 28]. Produktionen av ROS regleras av syrespänningen. Under hypoxiska förhållanden minskar det tillgängliga syret i miljön och blodets viskositet ökar, vilket påverkar många syreberoende metaboliska processer i organismen [29, 30]. Men det lägre atmosfärstrycket på höga höjder orsakar dåligt venöst återflöde och en minskning av mängden syre som transporteras av blodomloppet till alla celler i organismen, vilket ytterligare ökar hypoxi hos organ och celler [29, 30]. Exponering för hög höjd ger således upphov till en serie hypoxiska fysiologiska reaktioner, inklusive produktion och ackumulering av ROS, när syrebehovet överstiger det vaskulära utbudet. Som tidigare nämnts leder ackumuleringen av ROS till en mängd olika intracellulära effekter, varav den mest kritiska är att orsaka OS i celler.

OS hänvisar till en obalans mellan oxidations- och reduktionsreaktioner, vilket leder till generering av överskott av oxidanter eller molekyler som accepterar en elektron från en annan reaktant, vilket i sin tur producerar ROS [31, 32]. OS är väl känt att kunna triggas av en rad endogena och exogena faktorer, inklusive exponering för hög höjd. Spermatozoer är celler som är särskilt mottagliga för OS på grund av deras otillräckliga cellreparationssystem och höga plasmamembraninnehåll av fleromättade fettsyror [33]. Testikel- och epididymala vävnader är inget undantag, eftersom närvaron av svår OS har observerats i runda spermatider hos råttor som utsatts för hypoxi [4]. OS påverkar DNA:s stabilitet och äventyrar därmed integriteten hos det genetiska materialet för könsceller [34-36]. En hög nivå av DNA-skada i manliga gameter har dock bekräftats leda till aktivering av apoptossignalering, vilket resulterar i en minskning av antalet epididymala spermier och en ökning av andelen defekta celler [28, 37]. I den aktuella studien minskade hypoxi avsevärt livsdugligheten för GC-1-celler genom induktion av apoptos och cellcykelstopp. Ännu viktigare, signifikant ökade ROS-nivåer visades av FCM-analys efter hypoxistimulering, med en ökad apoptoshastighet och högre aktivering av Caspase-3, PARP och Bax/Bcl-2-förhållandet, vilket indikerar att ROS kunde aktiveras apoptos genom att aktivera Caspase-signalvägen under hypoxiinducerad fertilitetsskada. De nuvarande fynden visade att hypoxi ledde till överdriven ROS-ackumulering, vilket orsakade oxidativ skada på reproduktionsceller. Därför är det meningsfullt att identifiera nya antioxidanter som kan fungera som ett effektivt tillvägagångssätt för att lindra hypoxiinducerad fertilitetsskada.

För att skydda mot OS finns ett komplext antioxidantsystem i kroppen, huvudsakligen sammansatt av enzymatiska faktorer. Under fysiologiska förhållanden upprätthåller ROS-innehållet och antioxidantsystemet en viss balans. ROS-överproduktion utarmar dock spermiernas antioxidantsystem, vilket leder till OS, vilket orsakar spermie-DNA-skador och resulterar i lägre fertilitet och graviditetsfrekvens [23]. Således, för att ta itu med ROS-överproduktion och relaterade skadliga effekter på cellnivå i det manliga reproduktionssystemet, har olika antioxidantstrategier testats [23]. För närvarande finns litteraturen om användningen av föreningar med antioxidantaktivitet ochförbättring av spermiefunktionenär omfattande. Viktigt är att de flesta rapporter beskriver en förbättring av spermieparametrar efter oralt antioxidantintag, inklusiveförbättringar i spermiekoncentrationenoch motilitet eller en minskning av DNA-skada [38]. Alltså, ett växande antal urologer skriver ut orala antioxidanter för infertilitet på grund av OS-relaterade problem [39]. Dessa antioxidanter inkluderar huvudsakligen karnitiner, vitaminer, zink, melatonin och naturliga föreningar [23, 40]. För närvarande, med utvecklingen av läkemedelsextraktionsteknik, anses ett ökande antal TCM-extrakt också lindra manlig infertilitet eftersom dessa antioxidanter kan minska de destruktiva effekterna av OS [41]. Yüce A. et al. rapporterade 2013 att kanel har gynnsamma effekter på den oxidativa och antioxidantbalansen i testiklar och spermiekvalitet [42]. Zhang L et al. visade att curcumin signifikant förbättrar spermiers rörlighet hos patienter och minskar H2O2 [43]. Dessutom har en mängd andra växtextrakt som blåbär, crocus sativus, granatäpplekärnor och grönt te också visat sig skydda reproduktionssystemet via antioxidantmekanismer [27, 44-47]. Cistanches Herba är en viktig TCM som har en gynnsam säkerhetsprofil och breda medicinska funktioner för behandling av bland annat infertilitet [13]. Moderna farmakologiska studier har visat att Cistanches Herba har olika aktiviteter, såsom antioxidativa, antiinflammatoriska, hepatoskyddande och anti-neurodegenerativa sjukdomsaktiviteter [13, 48]. Därför kan extrakt, fraktioner eller föreningar från Cistanches Herba ha potentiella antioxidantegenskaper för behandling av infertilitet.

De aktiva substanserna i växter som förbättrar fertiliteten inkluderar olika kemiska grupper såsom PhGs, saponiner, syresatta flyktiga föreningar och alkaloider [41]. Farmakologiska aktivitetsstudier av PhG har visat att PhG uppvisar ett brett utbud av bioaktiviteter, såsom antioxidation, antistrålningsneuroskydd och sexuell funktionsförbättring [49, 50]. Bland dessa aktiviteter väcker antioxidation gradvis uppmärksamhet. Vissa enskilda komponenter eller fraktioner av PhG har rapporterats hämma könscellapoptos inducerad av olika kemikalier, och deras antioxidationsförmåga in vitro har också visats in vivo i flera djurmodeller [51, 52]. Dessa resultat indikerar att doktorander kan vara en attraktiv kandidat förbehandling av manlig infertilitet. Cis är en aktiv PhG som kan isoleras från Cistanches Herba. I den aktuella studien undersökte vi effekterna av Cis på hypoxibehandlade celler eller en råttmodell och undersökte de underliggande molekylära mekanismerna. Cis uppvisade skyddande aktiviteter på minskningar av hypoxiinducerad livsduglighet och ökningar av apoptos i GC-1-celler, och det visade också en skyddande effekt på hypoxiinducerad skada i reproduktionssystemet hos råttor in vivo. En signifikant minskning av GR-, GPx- och SOD-aktiviteter under hypoxi jämfört med normoxiska grupper observerades, medan de specifika aktiviteterna för GR, GPx och SOD ökade signifikant i testiklar eller GC-1-celler behandlade med Cis. Cis verkade skydda testiklarna och GC-1-cellerna under hypoxiska förhållanden genom att förbättra aktiviteten hos antioxidantenzymer.

Enzymantioxidanter fungerar huvudsakligen genom att avlägsna superoxidanjoner, vilket förhindrar lipidperoxidation och DNA-skador för att förhindra infertilitet. Enzymatiska antioxidantmekanismer spelar en avgörande roll för att förhindra oxidativ skada [23]. Den enzymatiska mekanismen mot OS består av fria radikaler och glutationberoende enzymer inklusive GR, GPx och SOD [12]. Det är väl känt att antioxidantenzymer är väsentliga för det manliga reproduktionssystemet. I den aktuella studien åtföljdes effekten av minskade antioxidantenzymaktiviteter under hypobar hypoxi av ökad ROS och LPO i modellgruppen, vilket överensstämmer med tidigare rapporter [12]. Cis-administration ledde dock till en återhämtning av antioxidantenzymaktiviteter i GC-1-celler och testiklarna på råttor, vilket gjorde det möjligt att generera strategier för att administrera Cistanches Herba för att förhindra hypobarisk hypoxiinducerad skada, som tidigare föreslagits. Även om de nuvarande resultaten visade att behandling med Cis delvis minskade hypoxiinducerad könscellskada hos råttor, behövs ytterligare undersökningar för att reda ut den fullständiga bilden av dess reproduktiva skyddande effekter. Till exempel påverkar den specifika mekanismen för Cis aktiviteten hos antioxidantenzymer. Dessutom är det en fråga om några andra mekanismer också skulle kunna vara relevanta eftersom Cis endast delvis återhämtade sig från reproduktionsskadan orsakad av hypoxi. Slutligen, om Cis har en direkt tillväxtfrämjande effekt på könsceller bör också övervägas.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR UPPFÖLJANDE AV spermier AKTIVITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Slutsatser

I allmänhet betonar resultaten av denna studie potentialen hos Cis som en antioxidant för behandling av hypoxiinducerad manlig reproduktionsskada. Cis kan skydda mot hypoxi-inducerad manlig reproduktionsskada genom att återställa antioxidantenzymaktivitet, minska ROS-inducerad OS, samtidigt öka cellviabiliteten och minska apoptos. Viktigt är att Cis-subtyperna (Cis-A, Cis-B, Cis-C och Cis-H) som studerades i denna studie visade alla en viss skyddande effekt på reproduktionssystemet, och Cis-B visade den mest signifikanta effekten. Därför spekulerar vi att Cis kan vara en bra kandidat antioxidant förbehandling av hypoxiinducerad reproduktionsskada hos män, även om den exakta underliggande mekanismen kräver ytterligare undersökning.