Clec12a lindrar inflammation samtidigt som den begränsar expansionen av en kolitogen kommensal
Dec 29, 2023
SAMMANFATTNING
Reglering av mikrobiotan är avgörande för tarmhälsan, men mekanismerna som används av medfödd immunitet är fortfarande oklara. Här visar vi att möss med brist på C-Type-lektinreceptorn, Clec12a utvecklade svår kolit, som var beroende av mikrobiotan. Fecal-microbiota transplantation (FMT) studier på bakteriefria möss avslöjade kolitogen mikrobiota bildad inom Clec12a-/- möss som märktes av expansionen av den grampositiva organismen, Faecalibaculum-gnagare. Behandling med F. rodentium var tillräcklig för att förvärra kolit hos vildtypsmöss. Makrofager i tarmen uttrycker de högsta nivåerna av Clec12a. Cytokin och sekvensanalys i Clec12a-/- makrofager avslöjade förhöjd inflammation men en markant minskning av gener associerade med fagocytos. Clec12a-/- makrofager är faktiskt nedsatt i sin förmåga att ta upp F. rodentium. Renad Clecl2a hade högre bindning till grampositiva organismer såsom F. rodentium. Således identifierar våra data Clec12a som en medfödd immunövervakningsmekanism för att kontrollera expansionen av potentiellt skadliga kommensaler utan öppen inflammation.
cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret
INTRODUKTION
Mikrobiotans sammansättning och funktion kan ha en djupgående inverkan på däggdjurs hälsa och sjukdomar (Fassarella et al., 2021). Detta har varit väldokumenterat för inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), där de flesta musmodeller av IBD är känsliga för förändringar i mikrobiotasammansättning (Gkouskou et al., 2014). Att förstå de faktorer som påverkar och instruerar mikrobiotastabilitet kommer att vara viktigt när mikrobiotabaserade terapier utvecklas (Sharma et al., 2020; Sorbara och Pamer, 2022). Mikrobiotan påverkas av flera parametrar inklusive kost, mediciner och immunsystemet. På senare år har adaptiva immunkomponenter, särskilt IgA, visat sig påverka mikrobiotasammansättningen (Nakajima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang och Palm, 2020). Men mindre är känt om hur specifika medfödda immunreceptorer påverkar homeostatisk mikrobiotasammansättning.
Genetiska polymorfismer i gener som reglerar mikrobiell igenkänning och slemhinneimmunitet är betydande riskalleler för IBD, inklusive autofagiproteinet ATG16L1 (Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux et al., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007 ). I en nyligen genomförd studie som undersökte förändringar i myeloida genuttryck hos individer med ATG16L1T300A polymorfism, identifierades den hämmande C-typ lektinreceptorn (CLR), Clec12a, vara signifikant undertryckt i dessa celler (Begun et al., 2015). Samma studie visade att Clec12a fungerar som försvar av patogen infektion genom association med autofagivägen. Dessa data tyder på att Clec12a-nedreglering hos individer med IBD kan påverka sjukdomens svårighetsgrad och/eller utveckling. Trots dessa bevis är lite känt om immunregleringsmekanismerna som utövas av Clec12a under kolit.
C-typ lektiner är en mångfaldig grupp av lösliga eller membranbundna molekyler som kan binda både värd- eller mikrobiellt härledda, lipider, proteiner och kolhydrater (Brown et al., 2018). Mincle (Clec4e) och Dectin-1 (Clec7a) är två CLR som påverkar specifika medlemmar av mikrobiotan för att upprätthålla intestinal homeostas (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Men med över 1,000 olika lektiner av C-typ återstår mycket att upptäcka inom denna proteinfamilj. Clec12a tillhör den naturliga mördarreceptorfamiljen och är en av endast två lektiner av C-typ som innehåller ett immuntyrosinhämmande motiv (ITIM) som kan begränsa inflammatoriska signalvägar (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004) . Clec12a känner igen urinsyra som är en signal om cellulär skada (Neumann et al., 2014). Clec12a uttrycks mest i medfödda immunceller, och i neutrofiler verkar det för att minska aktivering och nedreglera inflammatorisk cytokinproduktion vid urinsyraigenkänning (Neumann et al., 2014). Omvänt främjar Clec12a inflammation genom att tillåta mononukleära fagocyter (MNP) transmigration över blod-hjärnbarriären under en autoimmun modell av multipel skleros och potentierande typ I-interferonsignalering som svar på virusinfektion (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). Clec12a kan också känna igen den plasmodiska produkten, hemozoin, som har visat sig öka CD8+ T-celler i hjärnan efter Plasmodium-infektion (Raulf et al., 2019). Således representerar Clec12a en promiskuös CLR med en mängd olika roller i immunitet och unika signaleringsförmåga, men dess roll i tarmen är fortfarande okänd.
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
Vi har tidigare visat att specifika tarmsvampar förvärrar kolit genom att inducera purinmetaboliten urinsyra (Chiaro et al., 2017). Dessutom associerades purinmetabolism nyligen med mänsklig tarmsjukdom (Zhu et al., 2019). Dessa data tyder tillsammans på att urinsyradetektering kan vara relevant för IBD. Utifrån detta satte vi oss för att utforska funktionen av Clec12a i tarmen. Vi fann att djur med brist på Clec12a är mycket mottagliga för kolit, vilket är beroende av mikrobiotasammansättningen som bildas i frånvaro av Clec12a. FMT av Clec12a-/- mikrobiota till WT-bakteriefria djur var tillräcklig för att förvärra kolit och bildandet av den kolitogena mikrobiotan i Clec12a-/- djur är oberoende av adaptiv immunitet. För att identifiera relevanta mikrober som kan förvärra kolit, behandlades Clec12a-/- djur med olika antibiotika, och de som riktade sig mot grampositiva bakterier förbättrade sjukdomen. 16S rDNA-sekvensering identifierade att Faecalibaculum rodentium var betydligt mer förekommande i Clec12a-/- djur och oral sondmatning av F. rodentium var tillräcklig för att förvärra sjukdomspatologin hos WT-djur. Immunprofilering av Clec12a-/- djur visade en markant minskning av homeostatiska myeloidceller i tjocktarmen. RNA-sekvensering av F. rodentium-behandlade makrofager avslöjade att Clec12a främjar fagocytos. Eftersom Clec12a har visat sig binda flera ligander, frågade vi om Clec12a skulle binda till olika medlemmar av mikrobiotan. Med hjälp av ett Clec12a-Fc-fusionsprotein identifierar vi att Clec12a binder högst till grampositiva medlemmar av mikrobiotan. Tillsammans föreslår dessa data en modell där Clec12a kontrollerar kolitogena medlemmar av mikrobiotan genom direkt bindning och fagocytos samtidigt som inflammatoriska svar förhindras. I scenarier där Clec12a-uttrycket reduceras kan grampositiva patobionter expandera och främja inflammation. Således identifierar våra studier Clec12a som en viktig inflammatorisk suppressor för att säkerställa homeostas och underhåll av en frisk mikrobiota.
RESULTAT
Clec12a-/- djur är mycket mottagliga för kolit oberoende av det adaptiva immunsystemet
Reducerat Clec12a-uttryck har rapporterats hos individer med IBD och vi har visat att blockering av produktionen av en av liganderna för Clec12a, urinsyra, kan lindra kolit (Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015). Clec12a har dock ännu inte studerats i djurmodeller av kolit. För detta ändamål utmanades WT- och Clec12a-/- C57BL/6-möss med akut DSS-kolit. Clec12a-/- djur gick ner betydligt mer i vikt, uppvisade kortare kolon och hade en signifikant ökning av den inflammatoriska markören LCN2 i avföring jämfört med WT-djur, vilket tyder på försämrad inflammation och sjukdom (Figur 1A-C). Som stöd för detta avslöjade histologisk analys ökad epitelskada, kryptaförlust och inflöde av immunceller i Clec12a-/- djur jämfört med WT (Figur 1D, E). I överensstämmelse med resultaten i DSS-kolitmodellen, överföring av CD4+ CD45RBhi-celler till TCRb-/-; Clec12a-/- dubbla knockout-möss ledde till mindre viktökning över tiden och kortare kolon jämfört med T-celler överförda till TCRb-/- möss (Figur 1F, G). Sammantaget visar dessa resultat att förlust av Clec12a leder till förvärrad tarmsjukdom.
Clec12a rapporteras till stor del uttryckas inom medfödda immunceller med mycket lågt uttryck rapporterat i CD8+ T-celler. För att avgöra om adaptiv immunitet är involverad i den försämrade sjukdomen som observerats i Clec12a-/- djur, korsades Clec12a-/- djur till Rag-/- djur för att avlägsna både T- och B-celler. Återigen utvecklade Clec12a-/- djur försämrad sjukdom jämfört med WT-djur eftersom de gick ner mer i vikt och hade kortare kolon än WT-kontroller (Figur 1H, I). På liknande sätt, Clecl2a-/-; Rag-/- utvecklade försämrad tarmsjukdom jämfört med Rag-/- kontroller och gick ner lika mycket i vikt och hade kortare kolon än WT och Rag-/- som Clec12a-/- (Figur 1H, I). Vi har tidigare rapporterat att oral behandling med S. cerevisiae ökar urinsyranivåerna för att förvärra kolit. Emellertid observerades inga skillnader i urinsyranivåer i serum eller avföring i WT jämfört med Clec12a-/- djur, vilket tyder på att ökad sjukdom som observerats i Clec12A-/- inte är ett resultat av ökad urinsyra (Fig. S1). Således är försämrad kolitutveckling som observerats hos Clec12a-/- djur oberoende av det adaptiva immunsystemet.
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity
【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Försämrad kolit hos Clec12a-/- djur är beroende av mikrobiotan
Kolit är känt för att delvis drivas av förändringar i mikrobiotans sammansättning (Kubinak et al., 2015; Ray och Dittel, 2015). För att avgöra om Clec12a-/- djur har en mikrobiota som främjar försämrad kolit, utfördes FMT från WT eller Clec12a-/- möss till bakteriefria WT-djur. Fyra veckor efter transplantationen hölls hälften av djuren tillsammans, medan den andra hälften förblev separat. Akut DSS-kolit inducerades sedan i varje grupp (Figur 2A). Djur som fick en Clec12a-/- FMT och djur som hölls tillsammans gick ner betydligt mer i vikt (Figur 2B) och hade signifikant kortare kolon (Figur 2C) än djur som fick FMT från WT-möss. Vidare avslöjade histologisk analys större epitelskada och inflammatoriskt inflöde efter transplantation med en Clec12a-/- mikrobiota (Figur 2D, E). De etablerade mikrobiella samhällena var distinkta bland grupperna som bestämdes genom 16S rRNA-gensekvensering med Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), oviktad (PERMANOVA, p=0.0062) och viktad- Unifrac-avstånd (PERMANOVA, sid=0.0001). Skillnaden mellan mikrobiota inom gruppen var störst i samhuserade djur med samma mått som indikerar förvärvet av mikrober från varje FMT-genotyp (Figur 2 FH). Dessa data indikerar att försämrad kolit hos Clec12a-/- djur drivs av specifika mikrober anrikade i frånvaro av Clec12a; och dessa mikrober blev de dominerande drivkrafterna för en kolitogen fenotyp, även i närvaro av en etablerad WT-mikrobiota.
Mikrobiotakomposition som bildas i Clec12a-/- djur är oberoende av adaptiv immunitet
Immunförsvaret är viktigt för att diktera sammansättningen av mikrobiotan. FMT-experimentet indikerade att Clec12a-/- leder till en förändring i sammansättningen av mikrobiotan som främjar försämrad kolitutveckling. Vi ville först avgöra om Clec12a-/-brist i immunförsvaret kunde omforma tarmmikrobiotan. För detta ändamål överfördes benmärg från WT- eller Clec12a-/- möss till dödligt bestrålade WT SPF-mottagarmöss för att standardisera mikrobiotan följt av en 8-veckas immunrekonstitutionsperiod (Figur 3A). Under denna tid har de transplanterade immunsystemen tid att utvecklas inom mottagaren, vilket differentiellt formar sammansättningen av mikrobiotan. För att avgöra om prokolitogena förändringar i mikrobiotan resulterade från denna immunskulptur, utförde vi FMT med avföring från antingen WT- eller Clec12a-/- chimära möss och inducerade DSS-kolit (Figur 3A). Även om det inte fanns några signifikanta förändringar i viktminskning (Figur 3B), var tjocktarmen från djur som fick en FMT från Clec12a-/- chimära möss signifikant kortare jämfört med djur som fick FMT från WT-möss (Figur 3C), vilket tyder på förvärrad sjukdom. Dessutom, när WT- och Clec12a-/- FMT-mottagare inhystes tillsammans, var tjocktarmen betydligt kortare jämfört med djur som fick en WT FMT (Figur 3C). Således leder Clec12a-/-brist i det hematopoetiska utrymmet till bildandet av en dominant kolitogen mikrobiota.
För att ytterligare stödja att det adaptiva immunsystemet är nödvändigt för bildandet av den kolitogena mikrobiotan i Clec12a-/- djur, utförde vi en FMT med avföring från Rag-/- eller Rag-/-; Clec12a-/- - som beskrivits tidigare. Djur som fick en Rag-/-; Clec12a-/- FMT gick ner mer i vikt och hade betydligt kortare tjocktarm än djur som hade fått en FMT från Rag-/- djur, dessutom utvecklade samhuserade djur också förvärrad sjukdom (Figur 3D, E). Dessa data visar att Clec12a-brist i det medfödda immunsystemet är tillräcklig för att leda till bildandet av en mikrobiota som kan förvärra kolit.
Clec12a undertrycker expansionen av Faecalibaculum rodentium
Vi använde en serie olika antibiotika för att identifiera de relevanta organismerna som driver sjukdom hos Clec12a-/- djuren. För det första, behandling med en potent cocktail av bredspektrumantibiotika som inkluderar erytromycin, ampicillin, neomycin och gentamycin, minskade sjukdomens svårighetsgrad signifikant hos både Clec12a-/- och WT-djur, vilket tyder på att bakteriepopulationen i mikrobiotan var relevant för sjukdomen ( Figur 4A; Figur S2). Därefter minskade vi ytterligare vilka bakteriepopulationer som var mest relevanta för sjukdomar genom att använda olika antibiotika inriktade på unika bakterietaxa. Specifikt valde vi gentamycin, en aminoglykosid som riktar sig mot gramnegativa bakterier, och cefalotin, ett cefalosporin som främst riktar sig mot grampositiva bakterier. Dessa läkemedel administrerades till Clec12a-/- djur under DSS kolit. Medan behandling med gentamycin inte gjorde någon skillnad i sjukdomens svårighetsgrad, bibehöll djur som fick cefalotin sin vikt och hade betydligt längre kolon än skenbehandlade djur (Figur 4B, C), vilket tyder på att grampositiva organismer som finns i Clec12a-/- mikrobiotan leker en viktig roll för att förvärra sjukdomspatologi.
Vi utförde sedan 16S rRNA-gensekvensering av SPF WT och Clec12a-/- avföring för att profilera sammansättningsförändringar i mikrobiotan. WT- och Clec12a-/- djur grupperade sig signifikant olika genom både icke-fylogenetiska och fylogenetiska överflödsvägda mätvärden, Bray-Curtis respektive viktad-UniFrac (Figur S3A-C). Alfa-diversitetsmått visade inga signifikanta skillnader i rikedom (observerade egenskaper), vilket indikerar att Clec12a-/- inte hyser fler arter (Figur 4D). Jämnhets- och Shannon-diversitetsindex ökade dock i frånvaro av Clec12a, vilket indikerar att den proportionella distributionen av bakterier i Clec12a-/- möss ändrades (Figur 4E, F) och ytterligare stöder att Clec12a är viktigt för att reglera mikrobiotastrukturen i tarmen.
Analys av sammansättningen av mikrobiomer (ANCOM) avslöjade att bland de ASV (amplikonsekvensvarianter) som är differentiellt rikliga, en ASV klassificerad i Faecalibaculum-släktet (Erysipelotrichaceae-familjen), utökades signifikant inom Clec12a-/- avföringen jämfört med WT (Figur 4G, H). BLAST med användning av den representativa ASV-sekvensen från vår analys indikerade en 100 % identitet med sekvenser från bakterien Faecalibaculum rodentium. Dessa data ger bevis för att grampositiva bakterier i Clec12a-/- djuret är ansvariga för den kolitogena fenotypen och implicerar specifikt den grampositiva organismen, F. rodentium, i förvärrad sjukdom.
Baserat på detta testade vi hypotesen att F. rodentium kan förvärra kolit. Vi förbehandlade WT SPF-djur med 1 x 108 CFU av antingen levande eller fixerad F. rodentium genom oral sondmatning och fortsatte behandlingen varje dag under den akuta modellen av DSS för att säkerställa höga nivåer av F. rodentium-kolonisering. Djur som fick både levande och fixerad F. rodentium gick ner mer i vikt och hade signifikant kortare kolon än vehikelbehandlade djur (Figur 4I, J), vilket indikerar att ökade nivåer av F. rodentium kan förvärra sjukdomen.
Clec12a begränsar makrofagernas inflammatoriska svar samtidigt som det förstärker fagocytos
För att definiera Clec12a cellulärt uttryck i frånvaro av sjukdom, profilerade vi medfödda och adaptiva immunceller i lamina propria (LP) med hjälp av flerfärgsflödescytometri. I enlighet med tidigare rapporter är Clec12a huvudsakligen begränsad till myeloidlinjen med lite eller inget uttryck på lymfocyter (Figur 5A) (Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001). Intestinala neutrofiler, makrofager och dendritiska celler visade liknande nivåer av Clec12a-uttryck (Fig. S4A), medan makrofager hade den största andelen celler i tarmvävnaden som uttrycker Clec12a (Figur 5A). Med tanke på makrofagernas dubbla roll för att främja inflammation via klassisk aktivering men också för att initiera reparativa mekanismer som svar på vävnadsskada, frågade vi hur Clec12a kan påverka denna dikotomi under kolit. Även om makrofager är ganska olika, kan de i stort sett delas in i M1-inflammatoriska och M2-reparativa makrofager genom uttryck av CD38 respektive EGR2. Vi visar Clec12a-/- djur har ökade M1 makrofager och minskade M2 makrofager i kolon LP under kolit (Figur 5 B, C, Fig. S4B). Dessa data indikerar att Clec12a reglerar makrofagsvar i tarmen.
För att bättre förstå hur Clec12a påverkar makrofagbiologi som svar på mikrobiella ligander, behandlades benmärgshärledda makrofager (BMDMs) isolerade från WT eller Clec12a-/- djur med en mängd vanliga mikrobiella ligander inklusive LPS, Pam3CysK och Flagellin. Cytokinanalys utfördes på alla dessa prover. Många av de testade cytokinerna inducerades inte under dessa förhållanden, men MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a och IL-6 detekterades konsekvent i dessa kulturer ( Figur 5D). Clec12a-/- BMDMs hade signifikant högre uttryck av dessa cytokiner som svar på många av de mikrobiella liganderna och de största differentiella svaren sågs som svar på TLR2-agonisten Pam3CysK. Dessa data överensstämmer med den kända rollen för Clec12a för att dämpa inflammatoriska svar under steril inflammation (Neumann et al., 2014).
cistanche växthöjande immunförsvar
RNA-seq utfördes på BMDM från WT eller Clec12a-/- behandlade med F. rodentium för att bestämma hur Clec12a reglerar dessa cellers svar på denna specifika bakteriella organism. Vi bedömde det differentiella svaret genom att jämföra Clec12a-/- BMDM exponerade för F. rodentium jämfört med vehikelkontroller med WT BMDM. Anrikningsanalys av differentiellt uttryckta gener visade att Clec12a-bristande makrofager hade en signifikant ökning av gener involverade i cellcykelkontroll när de utmanades med F. rodentium (Figur S5A). Cellcykeln är naturligt kopplad till fagocytos och det fanns också signifikanta minskningar av gener associerade med fagocytos och det inflammatoriska svaret (Figur 5E) (Luo et al., 2005). I enlighet med en nyligen genomförd studie på Clec12a och Salmonella, tyder dessa data på att fagocytos är defekt i frånvaro av Clec12a som svar på den normala tarmen bosatta F. rodentium (Begun et al., 2015). För att testa detta samlades peritoneala makrofager från WT- och Clec12a-/- djur och samodlades med Sybr®-grönt märkt F. rodentium. Clec12a-/- makrofager hade signifikant färre mikrober per cell (Figur 5F, G; Figur S5B), vilket indikerar att Clec12a-brist leder till upptag av färre organismer och överensstämmer med minskad fagocytos i RNA-seq-datauppsättningen. Sammantaget visar dessa data att Clec12a spelar den dubbla rollen att mildra öppna inflammatoriska svar på vanliga mikrobiella ligander samtidigt som det främjar makrofagbakterieupptag.
Clec12a binder företrädesvis till grampositiva kommensaler
Eftersom fagocytos initieras av bindning av mikrober följt av internalisering och dödande, antog vi att Clec12a kunde binda till specifika medlemmar av mikrobiotan, såsom F. rodentium. För att ta itu med denna möjlighet skapades ett fusionsprotein innehållande den extracellulära bindningsdomänen av murin Clec12a och Fc-delen av humant IgG1 (Clec12a-Fc) (Figur 6A) (Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf et al., 2019). Proteinet renades och screenades för bindning till en panel av olika grampositiva och gramnegativa bakterier som är kända för att finnas i den homeostatiska tarmen, inklusive F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, och svampkommensala Candida albicans, genom flödescytometri. Salmonella enterica inkluderades också eftersom tidigare studier indikerade att Clec12a kunde associeras med S. entericas inträde i cellen (Begun et al., 2015). Clec12a band i varierande grad med flera fylogenetiskt distinkta bakterier, inklusive F. rodentium, men inte svamparna C. albicans (Figur 6B). Clec12a band högst till de grampositiva organismerna F. rodentium och en medlem av familjen Lachnospiraceae Roseburia sp., och interagerade minst med B. animalis, B. uniformis och S. enterica (Figur 6B), vilket indikerar Clec12a-burken. binder till specifika medlemmar av mikrobiotan med en preferens för grampositiva organismer. Tillsammans identifierar våra data Clec12a som en mekanism som används av immunsystemet för att kartlägga det mikrobiella samhället i tarmen och beskära mikrobiotan genom direkt bindning och fagocytos samtidigt som man förhindrar öppna inflammatoriska svar på rikliga grampositiva mikrober, vilket är avgörande för att upprätthålla tarmhälsa.
DISKUSSION
Homeostas i tarmen kräver mekanismer för att begränsa kommensala mikrober utan att initiera skadlig inflammation (Macpherson et al., 2000). IgA har under de senaste åren dykt upp som ett av de kritiska sätten på vilka tarmimmunitet kan utöva kontroll över mikrobiotan (Pabst och Slack, 2020). Faktum är att IgA kan binda direkt till mikrober och/eller deras produkter och eliminera dem från tarmen utan induktion av prototypisk inflammation. Andra immunmolekyler som har dessa dubbla egenskaper har inte studerats hittills. Lektiner av C-typ omfattar en mångsidig klass av proteiner som kan känna igen en mängd olika protein-, kolhydrat- och lipidmolekyler från mikrobiella och värdprodukter (Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). Men få har studerats i samband med tarmimmunitet och mikrobiota (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Såvitt vi vet är detta den första demonstrationen av att Clec12a-brist förändrar sammansättningen av mikrobiotan som driver sjukdomens svårighetsgrad.
cistanche fördelar-stärker immunförsvaret
Clec12a har till stor del studerats i samband med igenkänning av mononatriumurat (MSU) eller urinsyra, vilket ofta är en indikation på celldöd (Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014). Urinsyra kan aktivera inflammatoriska svar genom NLRP3-inflammasomen, så för att förhindra vävnadsdestruktion under celldöd måste denna inflammation kontrolleras (Martinon et al., 2006). Clec12a visades balansera detta inflammatoriska svar genom nedreglering av Syk-signalering (Marshall et al., 2004). I enlighet med detta orsakar Clec12a-deletion i en modell av steril inflammation och en autoinflammatorisk modell av artrit ökad neutrofilaktivering och förvärrad sjukdom, vilket gör Clec12a till en viktig inflammatorisk broms (Redelinghuys et al., 2016). Men på senare tid har Clec12a också visat sig förbättra typ I-interferonsignalering som svar på virusinfektion och förmedla upptag av Salmonella via den antibakteriella autofagivägen (Begun et al., 2015; Li et al., 2019). Detta visar att Clec12a inte enbart fungerar för att begränsa inflammation, utan snarare kan spela en mängd olika roller beroende på sammanhanget. Tarmen är annorlunda genom att det finns ett stort antal immunceller även i frånvaro av sjukdom. Detta beror på närvaron av mikrobiotan, som spelar en viktig roll för att instruera immunutveckling och förhindra kolonisering av patogena organismer. Mikrobiotan har samma ytmönster som detekteras av TLR som också känner igen patogener, och därför måste tarmens immunsystem ha strikta regleringsmekanismer på plats för att begränsa inflammation till dessa främmande organismer (Blander et al., 2017).
Vi blev ursprungligen intresserade av Clec12a eftersom vi identifierade att en tarmsvamp, Saccharomyces cerevisiae, inducerar urinsyra för att förvärra kolit (Chiaro et al., 2017). Dessutom har andra studier identifierat att mikrobiotan kan påverka tarmsjukdom genom induktion av purinmetabolism, varav slutprodukten hos däggdjur är urinsyra (Zhu et al., 2019). Dessa data tyder på att mekanismer för att känna av urinsyra, såsom Clec12a, kan påverka intestinal homeostas. Vi observerade dock inga förändringar i nivåerna av urinsyra i serum eller avföring, vilket tyder på att ökad sjukdomsgrad hos ett Clec12a-/- djur inte drevs av ökad urinsyra. Den ökade svårighetsgraden av kolit i Clec12a-/- drivs dock av mikrobiotans sammansättning. Således, baserat på våra data, kan reducerat uttryck av Clec12a-/- påverka sammansättningen av mikrobiotan hos IBD-patienter (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). Intressant nog fann vi att antibiotika som riktade sig mot grampositiva organismer kunde lindra svårighetsgraden av kolit hos Clec12a-/- djur. Detta i motsats till flera rapporter som har identifierat expanderade gramnegativa Enterobacteriaceae under tarminflammation, så detta är en av få studier som har identifierat en expansion i grampositiva organismer som är associerade med kolitutveckling. Även om det troligen inte är den enda organismen som påverkar svårighetsgraden av kolit i denna modell, observerades en dramatisk expansion av F. rodentium i Clec12a-/- djur. F. rodentium är en grampositiv, oxidas- och katalasnegativ medlem av Firmicutes (Bacillota) phyla (Chang et al., 2015). Introduktion av F. rodentium dagligen till även WT-möss förstärker kolit, vilket stöder att utökade nivåer av F. rodentium i tarmen är skadliga och sannolikt driver kolitallvarligheten i Clec12a-/-. En färsk rapport visade att F. rodentium kan öka epitelial omsättning och undertrycka uttrycket av enzymer i epitel som nedreglerar inflammatoriska svar och därmed är i linje med den förvärrade sjukdomen vi ser när F. rodentium expanderas i tarmen (Cao et al., 2022). Eftersom människor koloniseras med en organism som liknar F. rodentium (Zagato et al., 2020), bör ytterligare studier belysa inverkan av dessa F. rodentium-liknande bakterier på aspekter av mänsklig fysiologi relaterade till kolit.
Som stöd för en roll för Clec12a bland medfödda immunceller, observerade vi att den kolitogena mikrobiotan fortfarande bildas i Clec12a-/- djur som saknar ett adaptivt immunsystem. Den högsta andelen celler i tarmen som uttrycker Clec12a var makrofager som ledde till att vi fokuserade på Clec12a-funktionen i dessa celler. Tidigare studier har visat att Clec12a är en viktig mediator för typ I-interferonproduktion som svar på virusinfektion (Li et al., 2019). Hur Clec12a påverkar svar på ett brett spektrum av bakteriella ligander har dock inte utvärderats; detta är mycket relevant i tarmen där det finns ett överflöd av TLR-ligander. Här visar vi att Clec12a tjänar till att temperera makrofagreaktioner i tarmen och sannolikt fungerar för att säkerställa homeostas som svar på mikrobiotan. RNA-sekvens av makrofager inkuberade med F. rodentium framhävde att Clec12a-brist leder till cellcykel- och fagocytosdefekter som svar på dessa kommensala bakterier. En nyligen genomförd studie visade att Clec12a-/- makrofager hade minskad autofagi som svar på Salmonella (Begun et al., 2015). Våra data kompletterar och utökar dessa fynd till att inkludera att Clec12a också fungerar för att kontrollera icke-invasiva kommensala organismer. F. rodentium har av andra visat sig påverka epitelbiologin, vilket tyder på att F. rodentium ligger i närheten av värden och därför måste kontrolleras hårt av immunsystemet. Våra data stödjer att Clec12a kontrollerar F. rodentium genom reglering av fagocytos. Fagocytos initieras av den fysiska bindningen av en ligand eller mikrob, och lektiner av C-typ kan associeras med flera ligander, vilket ledde till att vi testade om Clec12a kan associera direkt med tarm-residenta bakterier. Intressant nog band Clec12a högst till de grampositiva organismerna F. rodentium och Roseburia och mycket mindre till de gramnegativa organismerna A. muciniphila och B. uniformis och inte alls till C. albicans. Dessa data visar att Clec12a har en benägenhet att binda specifika medlemmar av mikrobiotan. Detta tillåter oss att bygga en modell där engagemang av Clec12a och efterföljande fagocytos kan kontrollera vissa medlemmar av mikrobiotan och förhindra de potentiellt skadliga effekterna av deras expansion. Detta belyser den dubbla funktionen av Clec12a som kan begränsa inflammation mot mikrobiella ligander samtidigt som den känner igen och kontrollerar specifika medlemmar av mikrobiotan. Således representerar Clec12a ett unikt sätt som det medfödda immunsystemet använder för att säkerställa homeostas i mag-tarmkanalen.
FIGURLEGENDER
Figur 1. Clec12a begränsar tarmsjukdom oberoende av det adaptiva immunsystemet
(A) För att bedöma svårighetsgraden av kolit behandlades WT eller Clec12a-/- C57BL/6 specifika patogenfria (SPF) möss med 2,5 % dextran natriumsulfat (DSS) ad libitum i 7 dagar i dricksvatten. Den procentuella viktminskningen utvärderades dagligen. Medel +/- SEM, data poolas från tre oberoende experiment med tvåvägs ANOVA och Śídáks multipla jämförelsetest.
(B) Kolonlängd (cm) för indikerade djur mättes vid avlivning. Ett spridningsdiagram är medelvärdet +/- SEM, data poolas från tre oberoende experiment med användning av ett oparat t-test. Varje punkt representerar en mus
(C) Fekalt lipokalin-2 (ng/ml) från indikerade djur mättes som en avläsning av inflammation. Stapeldiagrammet är medelvärdet +/- SEM, data poolas från två oberoende experiment med användning av ett oparat t-test. Varje punkt representerar en mus
(D) Representativa H&E-färgade kolonsnitt från indikerade djur efter DSS-inducerad kolit.
(E) Histologipoäng för indikerade djur genererades från kolonsektioner i
(D). Stapeldiagrammet är medelvärdet +/- SEM, jämfört med ett oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
(F) T-cellöverföringsmodell av kolit utfördes för att bedöma kronisk kolit. Vikten av TCRb-/- och Clec12a-/- ;TCRb-/- djur mättes varje vecka. Grafen visar den procentuella viktförlusten för indikerade djur under hela experimentet. Medelvärde +/- SEM, jämfört med 2-vägs ANOVA.
(G) Kolonilängden för indikerade djur från (I) mättes vid avlivning. Stapeldiagrammet är medelvärdet +/- SEM, jämfört med ett oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
(H) WT, Clec12a-/-, Rag-/- eller Rag-/-;Clec12a-/- C57BL/6 SPF-möss bedömdes för akut kolit. Indikerade djur försågs med 2,5 % DSS ad libitum under 7 dagar. Den procentuella viktminskningen utvärderades dagligen. Medel +/- SEM, data är representativa för två oberoende experiment. Tvåvägs ANOVA och Śídáks multipla jämförelsetest.
(I) Kolonlängd (cm) för indikerade djur mättes vid avlivning. Stapeldiagrammet är medelvärdet +/- SEM, data är representativa för två oberoende experiment med oparade t-tester. Varje punkt representerar en mus * p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0,001; **** p < 0,0001
Figur 2. Mikrobiotan som bildas i ett Clec12a-/- djur ger försämrad kolit
A) Fekala mikrobiotatransplantationer (FMT) utfördes genom att överföra fekala supernatanter från WT- eller Clec12a-djur till bakteriefria WT-möss. Mikrobiotas fick homogeniseras i fyra veckor, varefter hälften av WTFMT-mössen och hälften av Clec12a-/-FMT-mössen inhystes tillsammans och fick ytterligare fyra veckor att blandas. Alla grupper fick sedan 2,5 % DSS ad libitum i sitt dricksvatten och avlivades på dag 7.
B) Procent viktminskning av indikerade djur bedömdes dagligen. Grafen visar medelvärde +/- SEM, data poolas från två oberoende experiment med tvåvägs ANOVA och Śídáks multipla jämförelsetest.
C) Kolonlängd (cm) från indikerade djur mättes vid avlivning. Ett spridningsdiagram är medelvärdet +/- SEM, jämfört med vanlig enkelriktad ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest. Varje punkt representerar en mus.
D) Representativa H&E-färgade kolonsnitt av indikerade djur efter FMT och DSS-inducerad kolit.
E) Histologipoäng genererades från kolonsektioner i (D). Stapeldiagrammet är medelvärdet +/- SEM, jämfört med ett oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
F) Viktade Unifrac-avstånd från 16S rRNA-gensekvensering av WTFMT, Clec12a-/- FMT eller samhuserade djur. Kartong- och morrhårsdiagram som visar alla punkter (parvis avståndsjämförelse) och jämförs med ett Kruskal-Wallis-test.
G) Oviktade Unifrac-avstånd från 16S rRNA-gensekvensering av WTFMT, Clec12a-/- FMT eller samhuserade djur. Kartong- och morrhårsdiagram som visar alla punkter (parvis avståndsjämförelse) och jämförs med ett Kruskal-Wallis-test.
H) Bray-Curtis avstånd från 16S rRNA-gensekvensering av WTFMT, Clec12a-/- FMT eller samhuserade djur. Kartong- och morrhårsdiagram som visar alla punkter (parvis avståndsjämförelse) och jämförs med ett Kruskal-Wallis-test.
Figur 3: Mikrobiotakomposition som bildas i Clec12a-/- djur är oberoende av adaptiv immunitet
A) Schematiskt diagram som visar benmärgsrekonstitution med efterföljande FMT. C57Bl/6 WT-möss bestrålades dödligt och rekonstituerades med antingen WT eller Clec12a-/- benmärg. Efter 8 veckor togs avföring från dessa möss och överfördes till WT-bakteriefria möss som förklaras i (A). De ursprungligen rekonstituerade chimära djuren tillfördes sedan 2,5 % DSS ad libitum i deras dricksvatten.
B) Procent viktminskning av FMT-möss från (F) bedömdes dagligen. Medelvärde +/- SEM, med tvåvägs ANOVA och Tukey multipeljämförelsetest.
C) Kolonlängd (cm) från indikerade djur mättes vid avlivning. Ett spridningsdiagram är medelvärdet +/- SEM, oparat t-test. Varje punkt representerar en mus
D) FMTs för att bedöma rollen av det adaptiva immunsystemet på mikrobiell formning och kolit svårighetsgrad utfördes genom att överföra fekala supernatanter från Rag-/- eller Rag-/-; Clec12a-/- SPF-djur till WT bakteriefria möss som beskrivs i (A). Möss behandlades med 2,5% DSS under 7 dagar. Den procentuella viktminskningen utvärderades dagligen. Grafen är medelvärdet +/- SEM, med tvåvägs ANOVA och Tukey multipeljämförelsetest.
E) Kolonlängd (cm) från indikerade djur i (F) mättes vid avlivning. Medelvärde +/-, SEM jämfört med vanliga envägs ANOVA och Dunnet multipel jämförelsetest. Varje punkt representerar en mus. * p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0,001; **** p < 0,0001
Figur 4. Clec12a begränsar expansionen av Faecalibaculum-gnagare, en mikrob som förvärrar kolit
A) WT- eller Clec12a-/- C57BL/6 SPF-möss fick en antibiotikacocktail (A) (neomycin, gentamycin, ampicillin, erytromycin), cefalotin eller gentamycin (B, C) i en koncentration av 0. 5g/L i fjorton dagar. Efter sju dagar gavs djuren 2,5 % DSS i deras dricksvatten tills de avlivades. Kolonlängd (cm) från indikerade djur mättes vid avlivning. Ett spridningsdiagram är medelvärdet +/- SEM, oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
B) Procent viktminskning av indikerade djur bedömdes dagligen. Grafen är medelvärdet +/- SEM, med tvåvägs ANOVA och Tukey multipla jämförelsetest
C) Kolonlängd (cm) för indikerade djur mätt vid avlivning. Ett spridningsdiagram är medelvärdet +/- SEM, oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
D) Observerade egenskaper från WT eller Clec12a-/- avföring, 16S rRNA-sekvensering av alfa-diversitet. Medelvärde +/- SEM, jämfört med Mann-Whitney-testet.
E) Pielou-jämnhet från WT eller Clec12a-/- avföring, 16S rRNA-sekvensering av alfa-diversitet. Medelvärde +/- SEM, jämfört med Mann-Whitney-testet.
F) Shannon Entropy Mean +/- SEM, jämfört med Mann-Whitney-testet.
G) ANCOM-analys från WT och Clec12a-/- avföring. Taxonomiska namn är de bästa klassificeringarna av ASV med hjälp av Genome Taxonomy Database (GTDB).
H) Relativ förekomst av Faecalibaculum rodentium ASV. Jämfört med Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** p < 0.01; ***p < 0,001; **** p < 0,0001
I) C57Bl/6 WT SPF-möss förbehandlades med 1x108 CFU av F. rodentium genom oral sondmatning under tre dagar. Djuren fick sedan 2,5 % DSS i sitt dricksvatten under 7 dagar medan de fortsatte att få daglig sondmatning av F. rodentium. Den procentuella viktminskningen utvärderades dagligen. Medel +/- SEM, Data poolas av fyra separata experiment med tvåvägs ANOVA och Tukey multipeljämförelsetest.
J) Kolonlängden (cm) för indikerade djur mättes vid avlivning. Stapeldiagrammet är medelvärdet +/- SEM. Data är sammanslagna från fyra separata experiment jämfört med vanlig enkelriktad ANOVA med Dunnet multiple korrektionstest. Varje punkt representerar en mus. * p < 0.05; ** p < 0.01; ***p < 0,001; **** p < 0,0001
Figur 5. Clec12a begränsar inflammation och främjar fagocytos i makrofager.
A) Immunfenotypning utfördes via flödescytometri på celler isolerade från kolon lamina propria (cLP) på WT och Clec12a-/- djur. Heatmap visar frekvensen av Clec12a-uttryck på medfödda och adaptiva immunceller
B) Stapeldiagrammet visar frekvensen av pre-gate, CD38+-celler (M1-makrofager) från cLP för indikerade djur. Medelvärde +/- SEM, jämfört med oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
C) Stapeldiagrammet visar frekvensen av pre-gate, EGR2+-celler (M2-makrofager) från cLP för indikerade djur. Medelvärde +/- SEM, jämfört med oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
D) BMDM skördades från WT och Clec12a-/- långa ben och odlades i närvaro av M-CSF (20 ng/ml) i 7 dagar. På dag 8 pulserades BMDM med LPS (100ng/ml), MDP (10mg/ml), Pam3cysk (1mg/ml) eller Flagellin (1mg/ml) under 24 timmar. Medier uppsamlades och analyserades med avseende på cytokinproduktion. Värmekartan visar Log2-faldig förändring av indikerade cytokiner från Clec12a-/- över WT.
E) BMDM från WT och Clec12a-/- möss isolerades och odlades som i (A) och samodlades sedan med F. rodentium vid en MOI av 10 under 24 timmar. Efter att BMDM tvättats, samlades RNA upp och preparerades för RNA-sekvensering. Topp 10 förenklade GO-termer (biologisk process) kategorier berikade bland Clec12a-/- nedreglerade
F) Peritoneala makrofager isolerades från WT och Clec12a-/- möss och samodlades sedan med Sybr grönfärgad F. rodentium för att bedöma fagocytos. Till vänster: WT-makrofager. Höger: Clec12a-/- makrofager. Representativa bilder från ljusfält (vänster kolumner), fluorescens (mittkolumner) och sammanslagna (höger kolumner) avbildas. Gula pilspetsar betecknar exempel på F. rodentium-celler som uppslukas av makrofager. skalstång=20 µm. Bilder är representativa för två separata experiment.
G) Stapeldiagrammet visar organismer per cell, som ses i (F). 250 WT-celler och 269 Clec12a-/-celler räknades för att kvantifiera mängden F. rodentium per cell.
Figur 6: Clec12a binder direkt till specifika medlemmar av mikrobiotan.
A) Schematiskt diagram som visar Clec12a-humant IgG1-Fc-fusionsprotein eller tom vektor (endast Fc-del) B) Histogram av flödescytometrisk analys som representerar differentiell bindning av Clec12a-Fc till olika bakterier eller C. albicans.
KOMPLETTERANDE FIGURLEGENDER
Kompletterande figur 1. Frånvaron av Clec12a stör inte urinsyranivåerna.
A) Serumurinsyra (µM) från indikerade djur mättes för att bedöma purinmetabolism mellan WT och Clec12a-/- C57Bl/6 möss. Spridningsdiagrammet är medelvärdet +/- SEM, data poolas från tre oberoende experiment med användning av ett oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
B) Fekal urinsyra (µM) från indikerade djur mättes för att bedöma tarmutsöndring av urinsyra mellan WT och Clec12a-/- C57Bl/6 möss. Spridningsdiagrammet är medelvärdet +/- SEM, data poolas från tre oberoende experiment med användning av ett oparat t-test. Varje punkt representerar en mus.
Kompletterande figur 2. WT och Clec12a-/- mikrobiotas driver differentiell sjukdom
Procent viktminskning av WT- och Clec12a-/- djur som behandlats med en antibiotikacocktail bestående av neomycin, gentamycin, ampicillin och erytromycin.
Kompletterande figur 3. Mikrobiotasammansättningen påverkas av Clec12a.
A) PCoA-plottar för de första 3 axlarna baserade på Bray-Curtis-avstånd som visar övergripande mikrobiotaförhållanden och motsvarande kartong- och morrhårsdiagram som kvantifierar olikheter inom varje grupp och jämförs med Mann-Whitney-testet.
B) PCoA-plottar baserade på viktade Unifrac-avstånd och motsvarande box- och whiskerplots som kvantifierar olikheter inom gruppen jämfört med oparat Mann-Whitney-test.
C) Tabell som visar PERMANOVA-testresultaten för WT vs. Clec12a-/- fekal mikrobiota med Bray-Curtis och vägda Unifrac-avstånd.
Kompletterande figur 4: Clec12a i makrofager begränsar inflammation.
A) Violinplots visar den geometriska genomsnittliga fluorescerande intensiteten (MFI) av immunceller som visas i (A). Medelvärde +/- SEM, Kruskal-Wallis test med Dunns korrigering för flera jämförelser. Bokstäver betecknar grupper som är väsentligt olika.
B) Representativa flödescytometridiagram av M1 och M2 makrofager från cLP från WT eller Clec12a-/- möss efter DSS kolit. Celler är pre-gated på live, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ och CD64+. Från figur 5A
Kompletterande figur 5. Clec12a stabiliserar cellcykelkontroll och reglerar fagocytos i makrofager.
A) Topp 10 förenklade GO-termer (biologisk process) kategorier berikade bland Clec12a-/- uppreglerade gener jämfört med WT som svar på F. rodentium. BMDM från WT och Clec12a-/- möss samodlade med F. rodentium isolerades och analyserades som i figur 7A.
B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200 makrofager räknades. Stapeldiagrammet visar det genomsnittliga antalet F. rodentium från 4 individuella brunnar för att visa konsistens i räkning och effekt över brunnar. Medelvärde +/- SEM jämfört med oparat t-test.
TACK
Vi vill tacka Gordon Brown för att han tillhandahållit Clec12a-/- djuren för detta projekt. Detta arbete stöddes av Helen Hay Whitney Foundation (KSO), University of Utah NRSA Microbial Pathogenesis T32 Training Grant (KSO), ett CCFA Senior Research Award (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 och NCCAM R01AT011423 (JLR), Edward Mallinckrodt (JLR), Jr. Foundation (JLR), NSF CAREER Award (IOS-1253278) (JLR), Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR), Burroughs Welcome Investigator in Pathogenesis Award (JLR), American Asthma Foundation (JLR), Margolis Foundation (JLR), ett MS Society Center-stipendium (JLR) och WM Keck Foundation (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), ett American Cancer Society Research Grant (RMO), ett Kimmel Scholar Award (RMO), R01AG047956 (RMO) och NIAID R01AI141202 (ASI). Detta arbete stöddes av University of Utah Flow Cytometry Facility förutom National Cancer Institute genom Award Number 5P30CA042014-24. Stödet och resurserna från Center for High-Performance Computing vid University of Utah är tacksamt tacksamma.
FÖRFATTARBIDRAG
TRC hjälpte till att utforma studien, utförde de flesta mus- och immunologiexperiment, satte ihop data till figurer och hjälpte till att skriva manuskriptet. RB satte upp bakteriefria experiment och bibehöll alla bakteriefria djur. ESV hjälpte till med immunologiska experiment med tarmlamina propria. KSO hjälpte till med musskördar och gav insikt och riktning. KMB hjälpte till med musskördar och flödescytometri. MCN hjälpte till med mössskörd. WV gav hjälp med att bygga konstruktionen för fusionsproteinet och rening. TJ gav hjälp med fagocytosanalyser. JH analyserade fagocytosmikroskopobjektglas. MH gav hjälp med reningen och användningen av fusionsproteinet. KAK tillhandahåller bakterieisolat. ROC gav immunologisk expertis och insikt. WZS hjälpte till att utforma studien utförde bioinformatiska analyser, hjälpte till med figurförberedelser och statistik, och hjälpte till att skriva manuskriptet. JLR hjälpte till att utforma och styra studien, övervakade experimentell design och resultat, organiserade kollaboratörer och reagenser, samlade in finansiering för studien och hjälpte till att skriva manuskriptet.
METODER
Musstammar
Alla muslinjer som användes häri var på en C57BL/6-bakgrund. Clec12a-/- möss var vänligt tillhandahållna av Gordon Brown (Medical Research Council Center for Medical Mycology, University of Exeter) och var genotyp enligt deras tidigare beskrivna protokoll (Redelinghuys, et al. 2016). Rag2-/- och TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) erhölls från Jackson Laboratories och bibehölls i vår muskoloni i flera generationer. För alla kolitexperiment in vivo användes 8 till 12-veckor gamla könsmatchade möss. Både han- och honmöss användes. Möss hölls i specifika patogenfria förhållanden.
Bakterie- och svampstammar
Följande organismer förvärvades från DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074). Bacteroides uniformis förvärvades från American Type Culture Collection (ATCC® 8492™). En Roseburia sp (stambeteckning JLR.KK002) isolerades på Schaedlers agar från C57BL/6-möss som hyser en sporbildare-berikad mikrobiota. Sporformig anrikning utfördes som tidigare beskrivits och möss hölls i flera generationer med denna mikrobiota i vår gnotobiotiska anläggning innan JLR.KK002 isolerades från avföring (Browne et al., 2016). Vi PCR-amplifierade och Sanger sekvenserade 16S rRNA-genen och klassificerade den sedan med SILVA ACT-tjänsten och SILVA-databasen (Pruesse et al., 2012). Salmonella typhimurimum ST2-stam användes. Candida albicans stam sc5314 användes. Bakteriestammar som används i det syntetiska PhyLo11b-samhället beskrivs nedan.
DSS-inducerad experimentell kolit
Kolit inducerades med tillsats av 2,5 % eller 3 % (vikt/volym) 36,000-50,000MW dextran-natriumsulfat (DSS) (MP Biomedicals) i dricksvattnet under 7 dagar. Kolitis svårighetsgrad övervakades dagligen genom förändringar i kroppsvikt, avföringskonsistens och fekalt blod. För monocyträddningsexperimentet fick alla möss 2,5 % DSS under 5 dagar, varefter vanligt vatten gavs; viktövervakningen fortsatte till dag 10 när djuren skördades. Allvarlighetsgränser på mer än 20 % viktminskning infördes som en svårighetströskel. Vid experimentella slutpunkter togs MLN och kolon bort. Kolon mättes från blindtarmen till ändtarmen för att bestämma längden. Vävnader bearbetades sedan för histologi, RNA-extraktion eller flödescytometrisk analys.
Kolonhistologi och poängsättning
Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).
Lipocalin-2 (LCN-2) ELISA
Protokollet utfördes enligt tillverkarens protokoll (Fischer Scientific DY1857-05). Kortfattat samlades avföring upp, vägdes och mosades i HBSS IX vid en koncentration av 100 mg/ml. Proverna centrifugerades sedan vid 50 xg under 5 minuter för att avlägsna stora skräp. Supernatanten avlägsnades sedan och placerades i ett nytt rör och centrifugerades vid 8000 xg i 5 minuter för att pelletera bakterier. Denna supernatant späddes sedan ut efter djurens sjukdom men varierade i allmänhet från 1:100- 500 (frisk) – 1:500-1000 (DSS-behandlad). Urinsyramätning Koncentrationen av urinsyra utfördes enligt tillverkarens instruktioner (Invitrogen™ Amplex™Red Uric/Uricase-aktivitetsanalyssats, kat# A22181). I korthet samlades blod från WT- eller Clec12a-/- möss genom hjärtpunktion i guldtoppserumseparatorrör. Rören fick koagulera under 30 minuter och centrifugerades sedan vid 1300 xg under 10 minuter. Serumet avlägsnades och placerades i 1,5 ml Eppendorf-rör, snabbfrystes och förvarades vid -80 grader Celsius tills testning. Fekal urinsyra utfördes genom att erhålla färska fekala pellets från WT- och Clec12-/- möss. Pellets vägdes och registrerades och mosades sedan i 1 ml 1x reaktionsbuffert. Efter fysisk mäskning snurrades rören vid 50 xg i 5 minuter för att avlägsna stora skräp. Den återstående fekala uppslamningen analyserades med avseende på urinsyra.
T-cellöverföring experimentell kolit
WT-mjältar isolerades och mosades i RPMI innehållande 10 % fetalt bovint serum, penicillin och streptomycin. Celler centrifugerades vid 367 xg för att isolera celler. Den resulterande pelleten suspenderades sedan i 1x RBC-lysbuffert under 5 minuter, i mörker, vid rumstemperatur. De resulterande vita blodkropparna passerades sedan genom en Miltenyi CD4+ MACS-kolonn för att isolera CD4+ T-celler. T-celler färgades sedan med CD4 och CDRB och sorterades på en FACS Aria Fusion (BD Biosciences). CD4+ CDRBhi-celler samlades in och administrerades till TCRb-/- eller TCRb-/-; Clec12a-/- möss intraperitonealt (IP). Varje mus fick 5 x 105 celler. Kolitis svårighetsgrad och utveckling övervakades varje vecka genom att bedöma viktminskning. Vid den experimentella slutpunkten togs MLN och kolon bort och kolon mättes från blindtarmen till ändtarmen för att bedöma sjukdomens svårighetsgrad.
Isolering av leukocyter från colon lamina propria
Murina kolon med fäst ceca skördades och placerades i 1X PBS i 6-brunnsplattor på is. Eventuellt synligt kvarvarande fett och bindväv avlägsnades och blindtarmen klipptes bort från tjocktarmen. Kolonen spreds upp och slem och avföring avlägsnades försiktigt från tjocktarmen innan de placerades tillbaka i 6-brunnsplattan. När alla kolon väl spreds och skrapades, tärnades varje kolon på en petriskålslock med hjälp av ett rakblad och placerades i ett separat 50 ml rör. 10 mL förvärmd dissociationslösning (1X HBSS utan Ca+ och Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES och 30 mM EDTA) tillsattes och rören vortexade kort. Kolon inkuberades under ca 25 min. vid 37 grader med skakning vid 150 rpm tills lösningarna var grumliga från IEC-separationen. Prover skakades 3X och virvlades i 15 sekunder och hälldes sedan över ett 100 mM filter på en 50 ml konisk form för att avlägsna icke-immuna celler såsom IEC, och filtren sköljdes kort med 2 ml iskall 1X PBS. Den återstående vävnaden uppsamlades på filtret med pincett och flyttades till en ny 50 ml konisk form. 15 ml förvärmd digestionslösning (1X HBSS med Ca+ och Mg, 5 % FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, kat # 4942078001], 0,5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, kat # LS002139] och 0,5 mg/ml kollagenas D [Millipore-Sigma, kat # 11088866001]) tillsattes, proverna vortexades kort och inkuberades därefter i 45 minuter. vid 37 grader med skakning vid 150 rpm, eller tills lösningen blev grumlig. Prover skakades sedan 3X och virvlades i 15 sekunder. För att samla upp de återstående immun-cLP-cellerna hälldes den digererade vävnaden sedan över ett 40 mM filter på ett 50 mL koniskt rör innehållande 10 mL 1X PBS. Proverna sköljs därefter och filtreras med 2 ml iskall 1X PBS och centrifugeras vid 800 xg under 10 minuter vid 4 grader. Därefter avlägsnades supernatanten och kasserades med vakuum. Celler återsuspenderades sedan i 500 ml komplett RPMI och räknades med trypanblått uteslutningsfärgning.
Flödescytometri
Leukocyter isolerade från cLP färgades för livsduglighet med hjälp av zombiefärgämne 510 (AmCyan) under 10 minuter vid RT i mörker. Proverna blockerades sedan Fc-receptorn med CD-16/32 i 20 minuter vid 4 grader i mörker. Efter centrifugering vid 367 xg i 5 minuter färgades dekanterade celler under 30 minuter i mörker vid 4 grader. Alla antikroppar användes i en utspädning av 1:250 om inte annat anges. Myleloidpanelen bestod av CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (intracellulär, 1:50). T-celler särskiljdes av: Zombie färgämne 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (intracellulär 1:50), IL{{ 50}}PE (intracellulärt 1:50), IFN-g (BV605) (intracellulärt 1:50), RORgt-PE610 (intracellulärt 1:50), IL-17A-BV785 (intracellulärt 1:50). Efter färgning tvättades cellerna två gånger under 5 minuter vardera med kolonnbuffert (1X HBSS utan Ca2+, Mg2+ och HEPES, EDTA, FBS). Celler fixerades O/N med 2% PFA om ingen intracellulär färgning behövdes och tvättades sedan i kolonnbuffert 2X innan de kördes på flödescytometern. Om intracellulär färgning var nödvändig följdes FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer-kit (Tonbo Biosciences) och protokoll. Alla prover återsuspenderades sedan i 300 ul kolonnbuffert och kördes på en BD LSR Fortessa efter kompensering med UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) och med enfärgningskontroller.
IgA-färgande bakterier
Bakterier isolerades från fekala pellets genom att mosa in i HBSS med Ca2+ och Mg2+ i en koncentration av 100 mg avföring per ml HBSS. Mosad avföring snurrades sedan vid 50 xg under 5 minuter för att avlägsna stora skräp. Supernatanten avlägsnades och placerades i ett nytt rör. Detta snurrades sedan vid 8000 xg i 5 minuter för att pelletera bakterier. Supernatanten avlägsnades och pellets tvättades i HBSS med Ca2+ och Mg2+. Slutligen återsuspenderades pellets i HBSS i en koncentration av 100 mg/ml, och 10 uL av detta placerades i en 96-brunnsplatta och blockerades med HBSS w/ Ca2+ och Mg2+ innehållande 10 % FBS i 20 minuter vid RT. 100 uL anti-IgA (PE) sattes sedan direkt till provet och inkuberades i 30 minuter vid 4 C i mörker. Cellerna tvättades sedan i HBSS+FBS-lösning 2x och återsuspenderades slutligen i HBSS+1x Sybr®-grönt och fick inkubera i 20 minuter i mörker vid RT. Prover avlästes sedan direkt på flödescytometern.
Benmärgsisolering
Benmärg isolerades som tidigare beskrivits. Kortfattat, långa ben från C57Bl/6 vildtyp eller Clec12a-/- djur extraherades och rengjordes med en pappershandduk genom att försiktigt gnugga. Rena ben hölls på is medan djuren bearbetades. Benens ändar klipptes något för att exponera märgen. Ben sattes in (exponerad ände vänd nedåt) i ett 0,5 ml Eppendorf-rör som hade genomborrats med en 18 g nål. Detta 0.5mL Eppendorfrör placerades sedan inuti ett 1.5mL Eppendorfrör och centrifugerades vid 13,000 x g i 1 min. Spinngen genom benmärgen lyserades sedan RBC, med användning av RBC-lysbuffert (Biolegend) enligt tillverkarens rekommendationer. Efter RBC-lys återsuspenderades celler i komplett Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) innehållande: 10 % FBS, 1 mg/ml Pen/Strep, HEPES 10 mM, 1x icke-essentiell aminosyra, natriumpyruvat 1 mM. Celler centrifugerades sedan vid 367 xg under fem minuter för att pelletera celler. Isolerade celler användes sedan för att utveckla BMDM eller för att ytterligare isolera monocyter.
Benmärgshärledda makrofager
Leukocyter isolerades från benmärgsisolering, suspenderades i komplett DMEM och räknades via trypanblått uteslutningsfärgning på en hemocytometer. Celler ströks ut på vävnadskulturbehandlade 10 cm skålar vid en koncentration av 5-8 x 106 celler/platta i 10 ml komplett medium + M-CSF (20 ng/ml). Färskt medium, inklusive M-CSF, lades till befintligt medium dag 4 och dag 7. Fullständigt differentierade BMDM:er användes för experimentell användning mellan dagarna 7-9.
Monocytisolering
Benmärg skördades från WT- och Clec12a-/- djur som tidigare beskrivits. Monocyter isolerades med Monocyte Isolation Kit (BM), en mus (Miltenyi Biotec) och en LS MACS-kolonn enligt tillverkarens instruktioner.
F. rodentium BMDM-samodling och RNAseq
F. rodentium-kulturer kvantifierades med OD 600 nm (med användning av 1 OD 600 nm=1 x 10^8 celler/ml), tvättades 2 gånger i steril PBS och samodlades med 1 x 106 celler/ml helt differentierade BMDMs vid en MOI på 10 i 6-brunnsvävnadsodlingsplattor. Efter 24 timmars samodling samlades media in och lagrades vid -20 C tills vidare användning. BMDM tvättades med kall, steril PBS, 2x. Qiazol (Qiagen cat# 79306) RNA-stabiliseringsreagens sattes sedan direkt till varje brunn. Brunnarna skrapades med en cellskrapa uppsamlade i 1,5 Eppendorf-rör och frystes vid -20 grad tills RNA-extraktion. RNA-extraktion utfördes med användning av ett Direct-zol RNA-miniprep-kit (Zymo Research cat# R2070) enligt tillverkarens instruktioner och sekvenseringsbibliotek framställdes av Huntsman Cancer Institute High-throughput Genomics kärnanläggning. Totalt RNA hybridiserades först med NEBNext rRNA Depletion kit v2 (NEB, cat# E7400) för att minska rRNA från proverna. Strängade RNA-sekvenseringsbibliotek framställdes med användning av NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit för Illumina (NEB, kat# E7760L). Renade bibliotek kvalificerades på en Agilent Technologies 4150 TapeStation med en D1000 ScreenTape-analys (Agilent, cat# 5067-5582 och 5067-5583). Molariteten för adaptermodifierade molekyler definierades genom kvantitativ PCR med användning av Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, kat#07960140001). Individuella bibliotek normaliserades till 5 nM som förberedelse för Illumina-sekvensanalys och sekvenserades på en NovaSeq 6000 med en 150-cykelsekvenseringskörning med parad ände.
Cytokinanalys
BMDM isolerades och odlades som tidigare beskrivits. Fullständigt differentierade BMDM:er ströks ut med 1 x 105 celler/brunn i 12-brunnars vävnadsodlingsplattor. BMDM stimulerades med 100 ng/ml LPS; 1 ug/ml Pam3Cysk; eller 1 ug/ml flagellin. Celler stimulerades under 24 timmar, media samlades upp och sparades vid -20 C för analys. Cytokiner analyserades med LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, cat# 740150). Data analyserades med hjälp av LEGENDplex™-dataanalysmjukvaran.
16s rRNA-gensekvensering
Fekala pellets eller ilealinnehåll samlades upp från individuella möss och frystes omedelbart vid {{0}} grad i 2 ml skruvlocksrör innehållande 250 mg 0,15 mm granatpärlor (MoBio, cat# {{5) }}). DNA extraherades med hjälp av Power Fecal DNA Isolation Kit (MoBio eller QIAGEN), enligt instruktionerna i kitet, och inkluderade 2 cykler med 1 minuts pärlslagning vid 4 grader på en Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products). V3- och V4-regionerna av 16S rRNA-genen amplifierades med en enda omgång PCR med användning av primrar som innehöll (beskrivna 3' till 5') målsekvensen för V3/4-regionen 16S rRNA-gen, en 2-nukleotiddyna följde av Illumina-primersekvenserna, en 8--nukleotidindexsekvens och den återstående Illumina-adaptersekvensen. V3/4 16S-inriktningssekvenserna togs från Takahashi (Takahashi et al., 2014) och indexen togs från Kozich (Kozich et al., 2013). De fullständiga oligonukleotidsekvenserna som användes var (index betecknade med Xs): Prok16SV34_För: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. PCR-cykelbetingelser var som följer: 98 graders initial denaturering under 2 minuter; 26 cykler med 20 sek 98 graders denaturering, 20 sek 51,5 graders glödgning, 20 sek 72 graders förlängning; och en enda sista 72 graders förlängning i 2 minuter. Varje PCR (utfördes i tre exemplar för varje prov) gjordes i en 25 ul volym med användning av Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, kat# M0492L), 5 pmol av varje primer och 50 ng mall-DNA. Efter amplifiering slogs triplikat PCR från varje prov samman, 5 ul kördes på en agarosgel för att bekräfta amplifiering och den återstående volymen rensades upp med Axygen AxyPrep MAG PCR-rensningspärlor (Corning, cat# MAG-PCR-CL{{53 }}) utspädd till 62,5 % i vatten för att effektivt avlägsna all primerdimer som helst skulle sekvenseras. Utspädda pärlor tillsattes vid 1,8X volymen av PCR-reaktionerna, rengjordes enligt tillverkarens riktlinjer och de rengjorda amplikonerna eluerades med 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,0. Amplikoner kvantifierades sedan med en picogrön dsDNA-analys (ThermoFisher, kat #P11495) på en mikroplattläsare, och sedan multiplexerades de rengjorda och indexerade individuella sekvenseringsbiblioteken jämnt (med ng DNA) och sekvenserades på ett Illumina MiSeq-instrument i parad ände 300-cykelläge vid Huntsman Cancer Institutes High-Throughput Genomics delade resursanläggning.
Bioinformatisk bearbetning av sekvensdata
16S rRNA-genavläsningar demultiplexades vilket medgav 0-felmatchningar i index som sedan bearbetades och analyserades inom QIIME2-ramverket (Bolyen et al., 2019) som vi tidigare har beskrivit (Stephens et al., 2021). I korthet trimmades demultiplexade och kvalitetsfiltrerade sekvenser först av primer- och länksekvenser med Cutadapt-pluginet, för att sedan betyda DADA2 (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). Taxonomier tilldelades sedan till ASV:er med classifysklearn-metoden i feature-classifier plugin, mot GTDB-referensuppsättningen (release89) trimmad till den förstärkta V3/4-regionen och tränad med fit-classifier-naive-bayes-metoden (Bokulich et al. , 2018; Parks et al., 2018; Pedregosa et al., 2011). Mångfaldsmått, avstånd och statistisk signifikans för beta-diversitetsgrupperingar efter permanova beräknades inom QIIME2 (Anderson, 2001).
För RNA-seq av BMDM:er var råavläsningarna av första kvalitet och adaptertrimmade med hjälp av trim i överflöd, sedan kvantifierades transkriptantalet med hjälp av lax mot transkriptomet från sammansättningen GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ 16}}17). Transkriptionsnivåkvantifieringar lästes in i R med hjälp av tidspaketet och sammanfattades till gennivåräkningar före differentiell expressionsanalys med DESeq2 med användning av designformeln '~ Genotype + Behandling + Genotype: Behandling' (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Differentiella svar på F. rodentium representerade skillnaden mellan varje genotyps svar på levande F. rodentium-behandling jämfört med vehikelkontrollbehandlade celler. Signifikant differentiellt uttryckta gener definierades som de med ett justerat p-värde < 0,05 och log2-faldig förändring > |0,58| (1,5 gångers byte). Signifikant nedreglerade och uppreglerade genlistor användes sedan för att testa för anrikning i genontologi (GO) termer med hjälp av klusterProfiler-paketet inklusive förenkla funktionen för att minska GO-term redundans och identifiera viktiga biologiska processer (S, 2020; Wu et al. ., 2021).
F. rodentium DSS-utmaning
F. rodentium odlades som tidigare beskrivits och kvantifierades till 1 x 1 09 CFU/ml i steril PBS. F. rodentium fixerades genom att först tvätta två gånger i steril PBS och sedan återsuspendera i 1 ml 10 % Fomalin-PBS under 10 minuter. Cellerna tvättades sedan ytterligare två gånger i 10 ml steril PBS för att förbereda för oral sondmatning. Icke-fixerade tvättades som fixerade celler och hölls på is tills sondmatning. WT C57BL/6 SPF-möss mättes oralt med 100 uL lösning innehållande antingen enbart PBS (vehikel), F. rodentium (levande) eller F. rodentium (fixerad) från dagarna -3 till 10. Djuren gavs 3,0 % DSS på dagarna 0-7; färskt DSS-vatten ersattes varannan dag. Allvarlighetsgränser på mer än 20 % viktminskning infördes som en svårighetströskel. Vid experimentella slutpunkter togs MLN och kolon bort. Kolon mättes från blindtarmen till ändtarmen för att bestämma längden. Vävnader bearbetades sedan för histologi, RNA-extraktion eller flödescytometrisk analys.
Fagocytosanalys
Peritoneala makrofager isolerades genom att injicera 5 ml steril PBS i peritonealhålan. PBS omrördes försiktigt medan den var i kaviteten med några sekunders mellanrum. Efter 2 minuter drogs PBS ut med användning av en 28 gauge nål och dispenserades i kall komplett DMEM. Celler centrifugerades vid 367 xg och tvättades i komplett medium. Celler räknades sedan med en hemocytometer och ströks ut i 12-brunnsvävnadsodlingsplattor vid en koncentration av 2,5 x 105 celler/ml. Celler fick vidhäfta över natten. Nästa dag blandades brunnarna försiktigt genom virvling och media aspirerades. Vidhäftande celler tvättades sedan två gånger med 500 ul kall, steril PBS. Förvärmd komplett DMEM innehållande F. rodentium vid en MOI av 10 sattes sedan till adherent (makrofager). Plattorna snurrades sedan försiktigt vid 200 xg, vid rumstemperatur i tre minuter och inkuberades sedan under standardcellodlingsbetingelser (37 C, 5% CO2) i 90 minuter. F. rodentium framställdes som beskrivits för samodling av BMDM:er för RNA-sekvensering endast, efter tvättning återsuspenderades cellerna i en 1x Sybr®-grön (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), vid RT i 20 minuter. Bakterieceller pelleterades sedan vid 4000 rpm under 5 minuter, återsuspenderades med komplett DMEM och förvärmdes för peritoneala makrofager. Efter 90 min samodling aspirerades media och cellerna tvättades två gånger med kall, steril PBS. Vidhäftande celler innehållande Sybr® grönfärgad F. rodentium fixerades med 2 % paraformaldehyd (PFA) under 10 minuter. PFA aspirerades och steril PBS placerades på celler. Celler avbildades sedan för fagocytos av F. rodentium
Makrofagebildanalys
Ljusfälts- och fluorescensbilder av F. rodentium-behandlade makrofagkulturer togs med användning av ett EVOS m7000 Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Tre till fem separata randomiserade bilder togs för varje kultur, vilka utfördes i tre exemplar.
Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).
CLEC12A-Fc-fusionsproteinkonstruktion and reningpå
De cDNA som kodar för de extracellulära domänerna av mus Clec12a amplifierades med PCR från vita blodkroppar isolerade från C57Bl/6 WT SPF-benmärg och bekräftades genom sekvensering. cDNA:n fuserades till C-änden av humant IgG1-Fc i expressionsvektorn pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Konstruktioner innehållande Clec12a eller tom vektor transfekterades in i Lx293-celler odlade med DMEM +10% FBS och Pen/strep (1 mg/ml). Utsöndrade fusionsproteiner skördades från mediet 24-48 efter transfektion. Media centrifugerades vid 367 xg i 5 minuter för att avlägsna skräp/döda celler, och supernatanten frystes vid -20 C tills användning. Clec12a-Fc eller endast Fc fusionsproteiner isolerades med Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kit (Thermo Fisher Scientific, katalognummer: 88804), kvantifierade med Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Katalognummer: 23227) och bekräftas med western blöt med antiClec12a-antikropp (Novus Biologicals NBP2-27346SS).
Clecl2a-Fc-bindningsanalys
Renade konstruktioner späddes till 0,4 mg/ml i HBSS med Ca2+ och Mg2+. Bakterier odlades i sina respektive media och aeroba förhållanden och normaliserades med OD 600 nm. Bakterier tvättades med HBSS med Ca2+ och Mg2+ och blockerades med HBSS med Ca2+ och Mg2+ +10% FBS under 20 minuter vid RT. Alla färgningsprocedurer ägde rum under atmosfäriska förhållanden. 1 x 107 bakterieceller placerades i en rundbottnad 96-brunnsplatta, snurrade vid 3,000 xg och dekanterades. 50 uL konstruktioner placerades på bakterieceller, blandades försiktigt och inkuberades vid 4 C under 1 timme. Bakterieceller tvättades med HBSS med Ca2+ och Mg2+ + 10% FBS, 2x. 50 uL get-anti-human Fc (PE) (ebioscience Catalog # 12-4998-82) sattes till cellerna och inkuberades vid 4 C i 1 timme i mörker. Cellerna tvättades sedan som tidigare och placerades i HBSS med Ca2+ och Mg2+ innehållande 1x Sybr®-grönt (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Celler inkuberades vid rumstemperatur under 20 minuter i mörker och avlästes omedelbart på en BD LSR Fortessa flödescytometer.
Bestrålning och benmärgsrekonstitution
Benmärg skördades från WT- och Clec12a-/- djur som tidigare beskrivits. Mottagna mottagna möss bestrålades dödligt med 5 00 Rad på dag -1, följt av 400 Rads på dag 0. Fyra timmar efter den sista bestrålningen placerades mottagarmöss under isofluranbedövning och 100 uL isolerade benmärgsceller suspenderade i steril PBS (1 x 108 celler/ml) levererades via en 28,5 gauge nål till det retroorbitala utrymmet. Vi var intresserade av mikrobiotan, så djur sattes inte på antibiotika, och efter 8 veckor samlades fekala pellets in för mikrobiotaöverföring till GF-djur.
REFERENSER
Anderson, MJ (2001). En ny metod för icke-parametrisk multivariat variansanalys. Austral Ecol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.
Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ, et al. (2015). Integrerad genomik av riskvarianten för Crohns sjukdom
identifierar en roll för CLEC12A i antibakteriell autofagi. Cell Rep. 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.
Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF och Artis, D. (2017). Reglering av inflammation genom mikrobiota-interaktioner med värden. Nat. Immunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.
Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA och Caporaso, JG (2018). Optimering av taxonomisk klassificering av markör-gen amplikonsekvenser med QIIME 2 ''sq2-funktionsklassificerare-plugin. Mikrobiom 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.
Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F., et al. (2019). Reproducerbar, interaktiv, skalbar och utbyggbar mikrobiomdatavetenskap med QIIME 2. Nat. Biotechnol. 37, 852-857. 10,1038/s41587-019-0209-9.
Brown, GD, Willment, JA och Whitehead, L. (2018). C-typ lektiner i immunitet och homeostas. Nat. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10,1038/s41577-018-0004-8.
Browne, HP, Forster, SC, Anonye, BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., och Lawley, TD (2016). Odling av "oodlingsbar" mänsklig mikrobiota avslöjar nya taxa och omfattande sporbildning. Nature 533, 543-+. 10.1038/natur17645.
Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., et al. (2008). En nyckelroll för autophagy och autophagy-genen Atg16l1 i mus och mänskliga tarm Paneth-celler. Nature 456, 259-263. 10.1038/natur07416.
Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA och Holmes, SP (2016). DADA2: Högupplöst provslutning från Illumina amplikondata. Nat. Metoder 13, 581-+. 10,1038/Nmeth.3869.
Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., och Garrett, WS (2022). Faecalibaculum rodentium omformar retinsyrasignalering för att styra eosinofilberoende tarmepitelhomeostas. Cellvärd och mikrobe 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.
Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK och Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium allm. nov., sp. nov., isolerad från avföring från en laboratoriemus. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10.1007/s10482-015-0583-3.
Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., et al. (2017). En medlem av tarmmykobiotan modulerar värdpurinmetabolism och förvärrar kolit hos möss. Sci. Transl. Med. 9, .
Drouin, M., Saenz, J. och Chiffoleau, E. (2020). C-typ lektinliknande receptorer: Huvud eller svans i celldödsimmunitet. Främre. Immunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.
Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H. och Zoetendal, EG (2021). Tarmmikrobiomstabilitet och motståndskraft: klargörande av svaret på störningar för att modulera tarmhälsa. Gut 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.
Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C. och Eliopoulos, AG (2014). Tarmmikrobiotan i musmodeller av inflammatorisk tarmsjukdom. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.
Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T. och Cao, XT (2004). KLRL1, en ny mördarcelllektinliknande receptor, hämmar naturlig mördarcellscytotoxicitet. Blod 104, 2858-2866. DOI 10.1182/blod-2004-03-0878.
Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., et al. (2012). Interaktioner mellan kommensala svampar och lektinreceptorn av C-typ Dectin-1 påverkar kolit. Science 336, 1314-1317. 10.1126/science.1221789.
Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Connell & June L. Round (2015). MHC-variation skulpterar individualiserade mikrobiella samhällen som kontrollerar känsligheten för enterisk infektion. Naturkommunikation. 0,1038/ncomms9642.
Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F. och Rock, KL (2010). Urinsyra främjar ett akut inflammatoriskt svar på steril celldöd hos möss. J. Clin. Investera. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.
Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK och Schloss, PD (2013). Utveckling av en Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline för analys av Amplicon Sequence Data på MiSeq Illumina Sequencing Platform. Applied and Environmental Microbiology 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.
Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM, och Round, JL (2015). MyD88-signalering i T-celler styr IgA-medierad kontroll av mikrobiotan för att främja hälsa. Cell Host Microbe 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.
Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namini, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS och Ruland, J. (2019). Urinsyrakristallreceptorn Clec12A potentierar typ I-interferonsvar. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.
Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T., et al. . (2015). Associationsanalyser identifierar 38 mottaglighetsställen för inflammatorisk tarmsjukdom och belyser delad genetisk risk över populationer. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.
Love, MI, Huber, W. och Anders, S. (2014). Modererad uppskattning av veckförändring och dispersion för RNA-seq-data med DESeq2. Genome Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.
Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M. och Patro, R. (2020). Tximeta: Referenssekvenskontrollsummor för härkomstidentifiering i RNA-seq. Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.
Luo, Y., Tucker, SC och Casadevall, A. (2005). Fc- och komplementreceptoraktivering stimulerar cellcykelprogression av makrofagceller från G1 till SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.
Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H. och Zinkernagel, RM (2000). En primitiv T-cellsoberoende mekanism för tarmslemhinnan IgA-svar på kommensala bakterier. Science 288, 2222-+. DOI 10.1126/science.288.5474.2222.
Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH och Lepenies, B. (2014). En plattform för att screena för C-typ lektinreceptorbindande kolhydrater och deras potential för cellspecifik inriktning och immunmodulering. Journal of Controlled Release 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.
Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S. och Brown, GD (2004). Identifiering och karakterisering av en ny human myeloid hämmande c-typ lektinliknande receptor (MICL) som huvudsakligen uttrycks på granulocyter och monocyter. J. Biol. Chem. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.
Martin, M. (2011). Cutadapt tar bort adaptersekvenser från sekvensläsningar med hög genomströmning. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro M. Lorenzo, MP, et al. (2019). Mikrobiotaavkänning av Mincle-Syk Axis i dendritiska celler reglerar produktionen av interleukin-17 och -22 och främjar integriteten av tarmbarriären. Immunitet 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.
Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A. och Tschopp, J. (2006). Giktassocierade urinsyrakristaller aktiverar NALP3-inflammasomen. Nature 440, 237-241. 10.1038/nature04516.
Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., et al. (2018). IgA reglerar sammansättningen och metaboliska funktionen av tarmmikrobiotan genom att främja symbios mellan bakterier. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.
Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. et al. (2014). Clec12a är en hämmande receptor för urinsyrakristaller som reglerar inflammation som svar på celldöd. Immunitet 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.
Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., et al. (2016). Monoklonal IgA med hög affinitet reglerar tarmmikrobiota och förhindrar kolit hos möss. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.
Pabst, O. och Slack, E. (2020). IgA och tarmmikrobiotan: vikten av att vara specifik. Mucosal Immunol. 13, 12-21. 10,1038/s41385-019-0227-4.
Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA och Hugenholtz, P. (2018). En standardiserad bakteriell taxonomi baserad på genomfylogeni reviderar livets träd väsentligt. Nat. Biotechnol. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.
Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA och Kingsford, C. (2017). Lax ger snabb och fördomsmedveten kvantifiering av transkriptionsuttryck. Nat. Metoder 14, 417-+. 10,1038/nmeth.4197.
Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-learn: Machine Learning i Python. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.
Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR och Brown, GD (2008). Karakterisering av murin MICL (CLEC12A) och bevis för en endogen ligand. Eur. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.
Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019). Lektinreceptorn av C-typ CLEC12A känner igen plasmodialt hemozoin och bidrar till utveckling av cerebral malaria. Cell Rep. 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.
Ray, A. och Dittel, BN (2015). Inbördes samband mellan dysbios i tarmmikrobiotan på grund av immunbrist och sjukdomspenetrering av kolit. Immunology 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.
Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA, et al. (2016). MICL kontrollerar inflammation vid reumatoid artrit. Ann. Rheum. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.
