Clr-f uttryck reglerar njurens immunförsvar och metabolisk homeostas Ⅱ

Rörformiga och glomerulära njurskador hos Clr-f-defekta möss.

Den första granskningen avClr-f−/− njursektioner avslöjade flera förändringar i njurbarken. Att utvärderahistopatologiska lesioner, PAS-färgade njursnittfrån fyra 12-veckor gamla WT ochClr-f-/- möss bedömdes på ett förblindat sätt (Fig.2A). En varierande närvaro av proximala och distala tubulära lesioner observerades iClr-f−/− njurar som inkluderade tubulär epitelcellsgödning, nukleär förskjutning och förlust av borstkanter (Fig.2A; topppaneler). I sällsynta fall påträffades tubulär nekros i form av ansamling av luminal nekrotisk skräp och fullständig epitelförlust i några av de undersökta områdena. DeClr-f−/− njurar uppvisade ocksåglomerulära patologier(Fikon.2A; bottenpaneler), med områden med fokal förtjockning av glomerulära tufs, minimal periglomerulär fibroblastproliferation associerad med mild interstitiell fibros, och allvarligare lesioner med mesangiolys, kapilläraneurysm som utvecklats till uttalad störning av glomeruli och en konstant närvaro av nekrotiserande cellrester i kroppsskräp. . Scoring av glomerulär patologi avslöjade ett betydande antalglomerulära lesioneri Clr-f-defekta möss i jämförelse med WT-kullkamrater (Fig.2B). Elektronmikroskopi avslöjade allvarliga podocytskador, podocytfotprocessutskärning och betydande förtjockning avglomerulär källaremembran (GBM) (Fig.2C,D).

Klicka för att cistanche herba för njursjukdom

För att bedöma om njurimmunoglobulinavlagringar var närvarande, som är karakteristiskt associerade med de patologier som observerats, färgade vi njurbarksektioner av WT och Clr-f−/− njurar för närvaron av IgA, IgM och IgG antikroppar av IF (Fig. 2E) ). Clr-f−/− njurar visar tydlig dominant IF-färgning av glomerulära IgA-avlagringar åtföljd av uttalade IgM-avlagringar och en mindre men konsekvent närvaro av IgG-avlagringar. På samma sätt upptäckte vi liknande mönster av IgA, IgM och IgG tubulointerstitiell avlagringar i Clr-f-/- njurar. Komplementprotein C3 detekterades också brett i Clr-f-/- njurar men inte i WT njurar (Fig. 2F).

Clr-f krävs för korrekt njurfunktion.

För att utvärdera effekten av Clr-f−/− patologier på njurfunktionen analyserade vi blod- och urinsammansättning från 12-veckogamla Clr-f−/− och WT kullkamrater av hankön. Vi fann en blygsam, men ändå statistiskt signifikant, ökning av urin-protein-till-kreatinin (UP/CR)-förhållandet hos Clr f -/− möss jämfört med WT-möss, med ökat serumkreatinin, men liknande urinproteinnivåer jämfört med WT möss, såväl som liknande fraktionerad utsöndring av natrium (FENa) (Fig. 2G). Med tanke på det tubulära uttrycket av Clr-f bedömde vi om Clr-f−/− musblodtryck hos 12-veckogamla och 24-veckogamla Clr-f−/− möss påverkades. Clr-f-/-möss uppvisade en marginell men icke-statistiskt signifikant minskning av blodtrycket jämfört med WT-kullkamrater (Fig. 2H). Dessa resultat visar att normal njurfiltrering förändras i frånvaro av Clr-f, men Clr-f visar inga signifikanta roller i njurelektrolythomeostas eller blodtrycksreglering.

Clr‑f−/− njurtranskriptom visar en dysreglering i ämnesomsättningen.

Att undersöka de underliggande transkriptionsprocesserna som ansvarar för Clr-f−/−njurpatofenotyper, utförde vi RNA-sekvensering på njurar från 7-, 13- och 24-veckogamla WT- och Clr-f−/−-möss. Differentiellt uttryckta gener (DEG) i Clr-f-/-möss jämfört med WT-möss undersöktes genom funktionell anrikningsanalys och transkriptionell patotypanalys (Fig. 3A). Vi kartlade interaktionsnätverk av berikade biologiska processer från genuppsättningsanrikningsanalys (GSEA) av DEG identifierade vid varje ålder (Fig. 3B). Vår analys visade en anrikning av cellcykelrelaterade gener uppreglerade i njurarna hos 7-veckogamla Clr-f−/− möss. Vid 13 veckor anrikades metaboliska processer, transport, celldöd och svar på toxiska ämnen från DEG med ökat uttryck i Clr-f−/− njurar, medan icke-rörlig ciliumsammansättning, DNA-transkription och bearbetning berikades från DEG med minskat uttryck. Njurar hos 24-veckogamla Clr-f−/− möss uppvisade också en berikning av metaboliska processer och transport mellan DEGs med ökat uttryck, såväl som processer som reglerarblodcirkulation, medan celldöd, immunitet och Transforming growth factor-beta (TGF) signaleringsregleringsprocesser berikades från DEG med minskat uttryck.

För att fånga åldersassocierade processer som ligger bakom Clr-f−/− njurdefekter analyserade vi gener som tillhörde fyra dynamiska mönster av differentiellt uttryck: DEGs som ökar med åldern, minskar med åldern eller tillfälligt ökar eller minskar vid 13 veckors ålder. Funktionell anrikningsanalys av biologiska processer, molekylära funktioner och definierade vägar bland dessa grupper avslöjade att DEG med ökande uttryck från 7 till 24 veckors ålder i Clr-f−/− njurar var överrepresenterade i lipidmetaboliska vägar, medan DEGs relaterade till cell- substratvidhäftningen minskade i uttryck från 7 till 24 veckors ålder (Fig. 3C). DEG med en övergående ökning av uttryck vid 13 veckors ålder var mestadels associerade med mitokondriell andning, medan DEG med en övergående minskning av uttryck kartlades till cellcykelvägar. Inom dessa fyra kategorier av dynamiskt uttryck fanns tre subkluster som representerar differentiella uttrycksmönster där storleken på förändringen i uttrycket mellan 7 och 13 veckor var antingen liknande, högre eller lägre än graden av förändring mellan 13 och 24 veckors ålder. (Fig. 3C). De berikade biologiska processerna och molekylära funktionerna från varje sub-kluster av gener var till stor del distinkta över de fyra huvudsakliga dynamiska uttrycksmönster som identifierats men återspeglade överlappande eller relaterade cellulära processer inom varje grupp. Sammantaget avslöjar transkriptionsprofilen för Clr-f−/− njurar en dynamisk och utvecklande dysreglering av cellulär metabolism, funktion och homeostas.

Clr‑f−/− möss samlar på sig fett.

Den identifierade åldersassocierade ökningen av DEG relaterade till lipidmetabolism ledde oss till att undersöka uttrycksdata för WT- och Clr-f-/- möss för kända lipidassocierade gener. De flesta av dessa gentranskript var förhöjda i Clr-f-/- möss (Fig. 4A) och i linje med ökningar av abdominala och perirenala fettavlagringar i Clr-f-/- möss vid 24 veckors ålder (Fig. 4B). Även om Clr-f−/− och WT möss uppvisade liknande kroppsvikter (Fig. 4C), var vikten av bukfett i Clr-f−/− möss signifikant högre, vilket tyder på att fettvävnad stod för en ökad andel av Clr-f −/− muskroppsvikt (Fig. 4D). Vi upptäckte också ektopisk lipidackumulering i njurarna hos Clr-f-/- möss, vilket framgår av ökad ORO-färgning av Clr f -/- musnjurar (Fig. 4E). Eftersom perirenalt fett och närvaron av interstitiellt fett i njurarna är associerade med metabola riskfaktorer för CKD21, antog vi om Clr-f är skyddande motetiologier för diabetesellerrelaterade metabola störningarassocierad medCKD.

Clr‑f−/− musnjurar har transkriptionella profillikheter och skillnader med mänsklig njursjukdom.

Ektopisk lipidackumulering i njuren är associerad med inflammation, fibros, mitokondriell dysfunktion och celldöd22,23. För att bedöma om Clr-f−/− njurar liknar definierade njursjukdomar, jämförde vi transkriptionsprofilen för Clr-f−/− njurar med publicerade uttrycksprofiler av njurvävnad och/eller blod frånmänskliga donatorer med CKD, Diabetisk nefropati(DN), lupus nefrit (LN), ellerIgA nefropati(IgAN) (Fig. 5A). Clr-f-/- njure transkriptionella profiler klustrade med blod från IgAN-patienter och glomerulär vävnad från DN-patienter (Fig. 5B). Jämförelse av Clr-f−/− och IgAN patientuttrycksprofiler genom funktionell anrikningsanalys visade parallella ökningar i genuttryck relaterat till cellulära reaktiva oxidsvar, celldöd, proteolys och amidmetabolism, såväl som delade minskningar i genuttryck associerat med membran trafcking processer, cytoskelett organisation, PI3K-AKT signalering, cell cykling och DNA/RNA metabolism (Fig. 5C). Omvänt skilde sig Clr-f−/− njurexpressionsuppsättningar från IgAN, med ökat uttryck av gener som tillhör signalvägarna AGE-RAGE, ErbB, TNF/MAPK och Rap1, och processer för vasopressinreglerad vattenreabsorption och lysosomaktivitet, och minskat uttryck av gener tillhörde adherens junction, icke-rörlig ciliumsammansättning, cellcykling, DNA-metabolism och TGF-signalering. Dessa fynd tyder på att i likhet med IgAN är cellulära processer för tillväxtkontroll, homeostas och reparation också dysreglerade i Clr-f−/− njurar, samtidigt som metabolism, stresssignalering ochepitelial strukturoch funktion är unika för Clr-f−/− njurar.

Clr-f-defekta njurar uppvisar inflammation och immuncellsinfiltration.

Med tanke på de kända immunmodulerande rollerna för Clr-proteiner undersökte vi immuncellernas bidrag tillClr-f−/− njurpatologi. Vi analyserade immuncellssammansättningen av 12-veckogamla WT och Clr-f−/− mus hela njurar genom flödescytometri. Vår analys avslöjade en signifikant ökning av antalet neutrofiler, T-celler och B-celler, men ingen skillnad i njur-NK-cell-, ILC- eller makrofagantal (Fig. 6A). Analys av den periglomerulära fördelningen av immunceller i njurbarken av WT och Clr-f-/− njurar av IF, vi observerade glomerulära ansamlingar av CD 45+ celler (Fig. 6B). Märkning av CD11c, F4/80, NKp46 och CD3, markörer som indikerar DC, makrofager, NK/ILC respektive T-celler, avslöjade en intraglomerulär ackumulering av CD11c+-celler (Fig. 6C) och periglomerulära ansamlingar av F4/{{ 16}}, NKp46+ och CD3+-celler i Clr-f−/− njurar (Fig. 6D). Visuell kvantifiering av immuncellpopulationer detekterade vid glomeruli bekräftade en signifikant ökning av närvaron av var och en av dessa immuncellpopulationer i njurarna hos Clr-f-/- möss jämfört med WT-möss (fig 6E). Immuninfiltrat vid autoimmun njursjukdom förstärks av den tubulära utsöndringen av IL-12 som föranleder skada av IFN-utsöndrande celler24–26. Vi undersökte därför WT och Clr-f−/− njurar för närvaron av dessa cytokiner och observerade färgning av både IL-12 och IFN i celler i Clr-f−/− njure tubulointerstitium (Fig. 6F, G).

Eftersom Clr-f antas vara en signal om cellhälsa till NKR-P1G-uttryckande celler, antog vi att den renala immuninfiltrationen i Clr-f-/− möss delvis beror på en ökad närvaro av NKR-P1G-uttryckande lymfocyter i njuren. Analys av NKR-P1G-uttryck på njur-TCR + T-celler och NK1.1+ NK-celler i WT- och Clrf-/−-möss med flödescytometri visade ingen skillnad i medelfluorescensintensiteten för NKR-P1G-färgning på njur-NK celler, men en ökning av NKR-P1G-färgning av renala T-celler i Clr-f−/− möss (Fig. 6H)

Figur 5. Jämförelse mellan transkriptionsprofiler för Clr-f−/− möss och humana kroniska sjukdomar. (A) Tabell över genuttrycksprofilsdatauppsättningar av 15 mänskliga njursjukdomar kontra 13-veckogamla Clr-f−/− möss. Referenskällan för datauppsättningskällorna för den mänskliga uttrycksprofilen indikeras av kolumnen Studie. (B) Likhetsmatris som visar hierarkisk klustring av differentiella genuttrycksprofiler i panel (A). Den rödstreckade linjen i dendrogrammet indikerar nivån för separering av matriskluster. (C) Jämförelse av 4531 grader (Log2 FC; Padj.<0.05) of 13-week-old Clr-f−/− mice (group 0) and IgAN patients. Gene set enrichment from 4 DEG clusters: (I) upregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients, (II) upregulated in Clr-f−/− mice and downregulated IgAN patients, (III) downregulated in Clr-f−/− mice, and upregulated IgAN patients, and (IV) downregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients. Heat maps were constructed using Morpheus (https://sofware.broadinstitute. org/morpheus).

Clr‑f-brist resulterar i T‑ och B‑oberoende autoimmunitet och patogenes. För att klargöra immunförsvarets bidrag till njurpatologin hos Clr-f−/− möss undersökte vi Clr-f−/− möss som också hade brist på T- och B-celler, med hjälp av den Rag1-deficienta musstammen (Rag1−/−Clr-f−/−). Eftersom Rag1-/-Clr-f-/- möss saknar antikroppar, kunde vi utvärdera Clr-f-associerad patogenes i frånvaro av immunglobulinavsättning. Analys av Rag1-/-Clr-f-/- njurarna visade glomerulära lesioner som tyder på mild proliferativ glomerulopati och områden med glomerulär fibros (Fig. 7A). Glomerulär patologipoäng visade ett signifikant högre antal glomeruli med lesioner i Rag1-/-Clr-f-/- jämfört med Rag1-/- möss (Fig. 7B). Poängsättning av Rag1−/−Clr-f−/− njursektioner identifierade ökningar i endokapillär proliferation, halvmånar, glomeruloskleros eller fokal segmentell skleros, och interstitiell fibros och tubulär atrofi, med en signifikant ökning av närvaron av mesangial cellularitet (Fig. 7C). .

För att bedöma T- och B-cellernas bidrag till lipidackumuleringen som observerades i Clr-f-/-möss, mätte vi total kroppsvikt och abdominal fettvikt i Rag1-/-Clr-f-/- i förhållande till Rag1-/- möss. Te Rag1−/−Clr-f−/− kroppsvikt var signifikant lägre än Rag1−/− kontroller (Fig. 7D), medan abdominal lipidvikt ökade signifikant (Fig. 7E), om än i mindre utsträckning än vad som observerades i Clr-f−/− möss jämfört med WT möss (174 mg fett ökat mot 274 mg i genomsnitt).

Slutligen, för att undersöka immunförsvaret till dessa njurdefekter, undersökte vi Rag1−/−Clr-f−/− njurar för närvaron av IL-12 och IFN och njurinfiltrerande immunceller. IF-analys av Rag1-/-Clr-f-/- njurar visade en ökad närvaro av IL-12 och IFN (Fig. 7F,G). Vi observerade också en omfattande periglomerulär ansamling av CD45+-celler i Rag1−/−Clr-f−/− njurar (Fig. 7H), som visade sig bestå av CD11c+, F4/80+ och Nkp46+-celler. Dessa resultat tyder på att T- och B-cellsoberoende mekanismer är de primära mediatorerna av njurpatologi hos möss som saknar Clr-f.

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIGT ORGANISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 25 % ECHINACOSID OCH 9 % ACTEOSID FÖR NJURINFEKTION