Clr-f uttryck reglerar njurens immunförsvar och metabolisk homeostas Ⅲ

Diskussion

Inflammation och immuncellsmedieradskador spelar en ledande roll i utvecklingen och progressionen av njurskada och dysfunktion. I denna studie redovisar vi ett krav på Clr-f vid underhåll avnjurhälsaoch funktionsom en inneboende homeostatisk kontroll motimmun- och metaboliskt medierad njurskada. Våra fynd visar immuncellsinfiltration och immunglobulin- och komplementproteinavlagring i njurarna hos möss med Clr-f-brist. Dessa immunegenskaper hos möss med Clr-f-brist är parade med det åldersassocierade utseendet av tubulära och glomerulära lesioner, ektopisk lipidackumulering och dysregleringen av många transkriptionsprocesser.

Klicka för att cistanche herba för njursjukdom

Clr-proteinerna som kodas inom NKC bland deras genetiskt kopplade NKR-P1-receptorer har varit i fokus för studien som icke-redundanta MHC klass I-oberoende mediatorer av saknad självigenkänning av NKR-P1-uttryckande immunceller9,27–31. Det ökade uttrycket av utvalda Clr-proteiner som svar på cellstress rapporteras också funktionellt begränsa immunsvaret hos vävnadsbosatta immunceller7,12,32. Följaktligen ansågs intestinal Clr-f bidra till immuntolerans inom den annars mycket immunogena tarmmiljön genom dess interaktion med de hämmande NKR-P1G-receptoruttryckande intraepiteliala lymfocyterna7. Arbete utfört av Leibelt et al. visade att möss utmanade med poly(I:C) uppvisade ökat Clr-f-uttryck och att Clr-f/NKR-P1G-interaktioner in vitro är starkt hämmande för NKR-P1G-uttryckande celler. Tillsammans kan dessa fynd tolkas som en potentiell mekanism genom vilken Clr-f kan förhindra reaktiviteten hos intestinala intraepitelial NKR-P1G positiva undergrupper mot epitelbarriären som ständigt provoceras av mikrobiella stimuli7.

Genereringen av möss med Clr-f-brist gav oss den första möjligheten att bedömafunktionella implikationerav Clr-f-uttryck in vivo och tillät oss att undersöka de potentiella immunhomeostatiska rollerna för Clr-f i njuren. Njurskadorna som observerats hos Clr-f−/− möss överensstämmer med modellen att nedregleringen av Clr-f fungerar som en indikator på cellstress och skada som frigör begränsningar på NKR-P1G-uttryckande efektorceller. Ökningen av NKR-P1G på T-celler i njurarna hos Clr-f−/−-möss tyder på att antingen NKR-P1G-uttrycket ökar bland njurbosatta T-celler i frånvaro av Clr-f, eller att njurarna av Clr- f−/− möss utsätts för infiltration av NKR-P1G-uttryckande T-celler. Frånvaron av en detekterbar förändring i närvaron eller distributionen av NKR-P1G-uttryckande celler i tarmen hos Clr-f−/− möss kan tyda på att de funktionella konsekvenserna av NKR-P1G: Clr-f interaktion i tarmen är begränsade till kontroll av immunreaktivitet i samband med infektion snarare än immuntolerans. Alternativt kan redundanta interaktioner också kontrollera aktiviteten hos NKR-P1G-uttryckande celler. Detta stöds av fynden att NKR-P1G binder inte bara till Clr-f utan även till Clr-d och Clr-g33, av vilka den senare uttrycks måttligt i vävnaderna i både njuren och tarmen6. Medan våra resultat avslöjar ett krav på Clr-f för att skydda mot autoimmun njurskada, är den NKR-P1G-medierade rollen i de autoimmuna njurpatologierna hos Clr-f−/− möss ofullständig. Särskilt, även om det finns en ökning av NKR-P1G-uttryckande T-celler i njurarna hos Clr-f−/−möss, är skillnaden underväldigande. Det är möjligt att en alternativ receptor deltar i övervakningen av Clr-f i njuren. För att till fullo ta itu med denna kontrollaxel i njurhomeostas behövs ytterligare undersökningar

Immunmedierad njurskada kännetecknas av en infiltration av inflammatoriska celler i det interstitiella utrymmet eller till glomerulus34. Njurackumuleringarna av monocyter, B- och T-celler, anti-glomerulära antikroppar, förhöjda IL-12- och IFN-cytokiner och olika glomerulära patologier hos Clr-f−/−-möss liknar mycket det autoimmuna landskapet hos LN-musmodellerna ( dvs MRL-Faslpr)35–37. Även om Clr-f−/− njurar uppvisar IgA dominanta mesangiala avlagringar med tillhörande IgM och IgG deposition, och klustringen av Clr-f−/− och IgAN transkriptionsprofiler, är det sannolikt för tidigt att antyda att dessa fenotyper är indikativa för en typ av CKD med IgAN38. Snarare är dessa skador, tillsammans med närvaron av mesangiolys, GBM-förtjockning och podocytdöd i Clr-f−/− njurar såväl som tubulointerstitiell förändring, fettackumulering och den betydande dysregleringen i metabola vägar, element som är gemensamma för en mängd olika patologier härrör från metabola defekter som förvärras av immunsystemet37,39,40. Oavsett den underliggande orsaken eller sjukdomstypen för Clr-f−/− musns njurdysfunktion, verkar Clr-f spela en mildrande roll mot utvecklingen av autoimmunitet med en tydlig glomerulonefritrelaterad patologi.

Vår undersökning av Rag1-/-Clr-f-/- möss indikerar ett framträdande bidrag från T- och B-celloberoende mediatorer till de autoimmuna svaren hos Clr-f-/- möss. I synnerhet var ackumuleringen av periglomerulära CD11c+-celler, F4/80+-celler och NKp46+-celler ännu mer uttalad i frånvaro av T- och B-celler och korrelerade med en signifikant närvaro av glomerulär skada. Detta tyder på att även om T- och B-celler kan bidra till njurskadande inflammation och autoantikroppskomplex, hos Clr-f−/−-möss kanske dessa inte är centrala bestämningsfaktorer för patologi, utan antingen sekundära bidragsgivare till den inflammatoriska aktiviteten hos andra immunceller eller potentiellt tjänar en immunreglerande roll i möss som saknar Clr-f. Detta kontrasterar bevis från ddY-musmodellen av IgAN som visar ett starkt T1-polariserat svar, med IFN-producerande T-celler som ökar med åldern och progressionen av glomerulär skada41. Njurinfiltrationen av B-celler i möss med Clr-f-brist har också visats i musmodeller av SLE42. Hittills är det oklart om B-celler i njuren bidrar till den skadliga inflammationen vid CKD eller spelar mer reglerande roller43. Nya bevis på CKD hos äldre patienter fann att minskningar av B-cellspopulationer var associerade med utvecklingen av njursjukdom44. Bevis från både T- och B-celler har visat sig ha immunsuppressiv aktivitet vid autoimmuna njursjukdomar45,46, och därför kräver den utsträckning i vilken de bidrar eller reglerar patologierna hos Clr-f−/− möss ytterligare undersökning.

Våra fynd visar tillsammans ett krav på Clr-f-uttryck i det tubulära epitelet i de proximala hoprullade tubuli, podocyter och/eller tarmepitel. Förlust av Clr-f-uttryck leder till en uttalad autoimmun och inflammatorisk kaskad som leder till njurskador och associerad fetma. Immunsvaren som framkallas av förlusten av Clr-f verkar vara T- och B-cellsoberoende. Sammantaget kan en funktionell roll för Clr-f i njuren föreställas som en hämmande molekyl för övervakande efektorimmunceller i njuren som finns i tarmen, eller som eninneboende regulator av tubulär cellfunktion.

Material och metoder Möss.

Alla möss hölls i en dedikerad patogenfri miljö. C57BL/6 (WT) och B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) möss förvärvades från Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Möss som bar de kombinerade nollmutationerna i Rag1 och Clr-f (Rag1−/−;Clr-f −/−) genererades genom att korsa Clr-f-defekta (Clr f −/−) möss med (Rag1−/−) möss . All avel och manipulationer som utfördes på djur var i enlighet med universitetets riktlinjer och godkända av Dalhousie University Animal Ethics Committee och Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Ottawa. Alla djurstudiedesigner, experiment och rapportering utfördes i enlighet med ARRIVE-riktlinjerna.

Generering av Clr-f-defekta möss. Clr-f-deficienta (Clr-f −/−) möss genererades genom homolog rekombination av en målinriktningskonstruktion innehållande en foxed fosfoglyceratkinas (PGK) -neomycinkassett och genomisk sekvens som spänner över exon 3, 4 och en del av exon 5 av Clr-f gen. Den fullständiga inriktningskonstruktionen bekräftades genom sekvensering vid Ottawa Hospitals Research Institute (OHRI) före elektroporering i C57BL/6 Bruce-4 embryonala stamceller (ES). ES-klonselektion med G{{10}}resistens utfördes av IRCM (Montreal Clinical Research Institute) Transgenic Core Facility (Montreal, QC, Kanada). Under tiden testades 5'- och 3'-Clr-f-proberna i en restriktionsfragmentlängdpolymorfism (RFLP)-analys med användning av tymiskt genomiskt DNA från en WT B6-mus, som spjälkades med BamHI respektive PstI. Digererade DNA-fragment upplöstes på 1 % agarosgel och överfördes till nylonmembranblottar. Clr-f cDNA-prober märktes med radioaktivt 32P-dCTP (Perkin Elmer, Guelph, ON, Kanada) med användning av NEB lot-kit (New England Biolabs, USA). Blottar undersöktes med 32P-märkta Clr-f cDNA-sonder i en hybridiseringslösning (10% (vikt/volym) dextransulfat; 1 M NaCl; 1% SDS). Hybridisering utfördes över natten vid 65 grader och efterhybridiseringstvättningar utfördes med en lösning innehållande 2x SSC och 1% SDS förvärmd till 65 grader. Te blots exponerades för fotografiska filmer för att avslöja hybridiseringssignalerna (fig. S1A, S3B). Membranen strippades med 0,2% SSC/0,2% SDS under 30 minuter vid 85 grader mellan olika hybridiseringar. Neomycin-resistenta kloner screenades med Southern blot-analys och en målinriktningseffektivitet på ~15 % observerades. Utvalda ES-kloner mikroinjicerades i blastocyster vid IRCM Microinjection Service Facility för att generera de chimära Clr-flox-grundarmössen. Mössen screenades genom Southern blot-analys och avlades sedan med B6-honor för att producera Clr-fwt/lox heterozygota möss. Heterozygota möss korsades för att erhålla Clr-flox/lox-möss. För att ta bort neomycinkassetten uppföddes Clr-flox/lox-möss med homozygota CMV-cre-transgena möss på en B6-bakgrund (Jackson Laboratory). Den resulterande dubbla heterozygota CMV-CreTg/0; Clr-f−/+ möss korsades för att producera Clr-f−/− möss som saknade CMV-cre transgenen. Möss genotypades med användning av specifika primrar (tabell 1, Fig. S1B, C och Fig. S3C, D). PCR-amplifiering utfördes med användning av AccuStart II Taq DNA-polymeras (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). PCR-blandningen framställdes enligt tillverkarens instruktioner. Fenol/kloroform-extraherat öron-DNA användes som mallar. Följande PCR-cykelparametrar användes: 30 amplifieringscykler på 94 grader i 40 sekunder, 60 grader i 45 sekunder, 72 grader i 60 sekunder. WT och Clr-f −/− kullkamrater användes i alla experiment om inte annat anges.

In situ hybridisering.

In situ-hybridiseringsanalyser av Clr-f uppnåddes genom att klona fullängdssenssträngen CDS och Clr-f-omspännande antisenssträng in i en pGEM-T Easy-vektor såsom beskrivits tidigare. Digoxi-geninmärkta antisens- och sense-RNA-sonder transkriberades från linjäriserade plasmider som kodar för Clr-f-genen med T7-polymeras med användning av DIG RNA-märkningsblandning (Roche, Basel, Schweiz). Vävnader samlades in från vuxna B6-möss och fixerades antingen i 10% formalin vid RT eller i 4% paraformaldehyd vid 4 grader med försiktig skakning i upp till 24 timmar. Vävnader bäddades sedan in i paraffin och 4 µm sektioner preparerades på objektglas. Vävnadsobjektglas dekarbonerades genom behandling med 0.2 N HCl under 15 minuter och 30 µg/ml proteinas K vid 37 grader i 20 minuter. Vävnad fixerades i 4 % PFA under 10 minuter följt av behandling med 0,25 % ättiksyraanhydrid i 0,1 M trietanolamin två gånger under 5 minuter vardera. Objektglasen förhybridiserades sedan med hybridiseringslösning (50 % (v/v) formamid/5×SSC, pH 4,5; 2 % (w/v) blockeringspulver (Roche); 0,05 % (v/v) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 µg/ml heparin; 1 µg/mL jäst-RNA) i en 58 graders ugn i minst 1 timme och inkuberades sedan med hybridiseringslösning innehållande 500 ng/ml digoxigeninmärkt sond över natten vid 58 grader. Posthybridiseringstvättningar utfördes med 50 % formamid/2× SSC, pH 4,5 vid 55 grader 3× under 20 minuter vardera, och objektglasen färgades med anti-digoxigenin alkaliskt fosfatas-konjugerad antikropp från får vid 1:1000 utspädning i blockerande lösning ( Roche). Färgframkallning utfördes genom att tillsätta nitroblått tetrazolium/5-bromo, 4-klor och 3-indoylfosfat (NBT/BCIP, Roche) substrat till objektglasen. Objektglasen hölls i mörker vid RT tills optimala signaler uppträdde. Kontrollmärkning utfördes med användning av en sense-sträng-prob och kompetitiva bindningsstudier med sense- och antisense-prob-konfirmerad specificitet. Objektglasen motfärgades sedan med ljusgrönt eller metylgrönt och visualiserades under ett ljusmikroskop.

RT-PCR. Njurvävnader från ålders- och könsmatchade WT- och Clr-f −/− möss skars ut, sköljdes med PBS och frystes i -80 grad. RNA isolerades från frusna vävnader med användning av RiboZol RNA-extraktionsreagens (AMRESCO Inc., West Chester, PA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Ungefär 1 ug RNA transkriberades till cDNA med användning av ett Verso cDNA-kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). PCR-amplifiering utfördes på 1 μL cDNA-produkt med användning av specifika primrar (tabell 1). PCR-förhållanden som användes var 94 grader i 30 sekunder, 58 grader i 30 sekunder, 72 grader i 60 sekunder och 35 amplifieringscykler. PCR-produkter visualiserades på 1% agarosgel färgad med etidiumbromid (Fig. 1C, Fig. S3A).

Immunhistokemi.

Njurvävnader av ålders- och könsmatchade WT och Clr-f −/− möss avparaffinerades genom tre 5 minuters inkubationer i xylen, två 5 minuters inkubationer i 100% etanol, följt av 90 % etanol, sedan 80 % etanol och slutligen 70 % etanol. Objektglasen rehydratiserades genom tvättning i destillerat vatten (20 dopp), och värmeinducerad epitopåtervinning utfördes med användning av en tryckkokare i citratbuffert (pH 6,0). Endogena peroxidaser blockerades med 3% väteperoxid i sterilt vatten i 10 minuter, och proteiner blockerades med hjälp av Background Sniper (Biocare Medical, Pacheco, CA, USA). Sektioner inkuberades sedan med rått-anti-mus monoklonala anti-Clr-f-antikroppar7 vid 4 grader över natten. Nästa dag sköljdes objektglasen med 0,1 M PBS och inkuberades under 1 timme i sekundära antikroppar. Färgning utvecklades med ett get-på-gnagare HRP-Polymer-kit (Biocare Medical) och Betazoid DAB Bufer (Biocare Medical), följt av hematoxylin-motfärgning. Samma process användes för att färga njurvävnadssnitt för IHC-märkning av NKp46+- och CD3+-celler, med användning av anti-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, USA, klon 29A1.4, CAT# 48-3351-82) respektive anti-CD3 (BioLegend CAT#100,327) som primära antikroppar. IHC-märkning av F4/80 utfördes på frusna njursektioner med användning av en anti-F4/80 råttmonoklonal BM8-antikropp. En get-anti-råtta IgG H&L HRP-konjugerad sekundär antikropp (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) användes enligt ovan och IHCs utvecklades med, ett pepparrotsperoxidas (HRP)-substrat användes DAB Substrate Kit (Abcam, CAT# ab64238).

Immunfluorescens.

Njur- och/eller tarmvävnaderna hos ålders- och könsmatchade WT- och Clr-f −/− möss kryokonserverades i 30% sackaros vid -80 grader i Tissue-Tek optimal skärtemperaturförening (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). 20 μm kryostatsektioner fixerades med aceton i ett dragskåp vid rumstemperatur i 16 minuter och lufttorkades i minst 30 minuter, efter tvätt i 0,01 M PBS, pH 7,4. Ospecifik bindning blockerades med 10 % åsneserum. Sektioner inkuberades över natten vid 4 grader med de primära antikropparna: anti-Clr-f7, anti-NKR-P1G (en råtta anti-mus monoklonal antikropp som beskrivits tidigare7), anti-IgA (get anti-mus IgA alfakedja (Abcam, Cambridge) , Storbritannien CAT#ab97235), anti-IgG-PE (BioLegend, San Diego, CA, USA CAT#405324, anti-IgM-FITC (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA CAT#A21042), komplement C3 Antibody (11H9) ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA Cat# NB200-540), anti-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA CAT#554411), anti-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), anti-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), anti-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), anti-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116), och anti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) vid 1:100 koncentration i 5 % normalt serum i en fuktad kammare. Sekundär antikroppsmärkning av anti -Clr-f och anti-NKR-P1G antikroppar med användning av FITC-konjugerade polyklonala antikroppar utfördes vid RT under 1 h inkubation. Proverna DAPI kärnfärgades vid RT under 5 min, tvättades med PBS och monterades på objektglas med en droppe VECTASHIELD PLUS antifade monteringsmedia (Vector Laboratories, San Francisco, CA, USA) och täckt med ett täckglas. Objektglasen undersöktes med användning av ett Zeiss LSM 510 laserscannande konfokalmikroskop.

Histologi och patologipoäng.

Njursektioner av ålders- och könsmatchade WT, Clr-f −/−, Rag1−/− och Rag1−/−Clr-f −/− möss (3 μm) färgades med periodic acid-Schif (PAS). Njurvävnad bedömdes för mesangial cellularitet (definierad som 4 eller fler kärnor per mesangialt område), endokapillär proliferation, halvmånar och glomerulär skleros. Sektioner bedömdes också för närvaron av tubulopati, interstitiell fibros, tubulär atrofi och tubulointerstitiell cellinfiltrat. För glomeruli-patologipoäng användes en semikvantitativ poäng för att utvärdera graden av glomerulär skada. Minst 50 glomeruli i varje grupp undersöktes och skadans svårighetsgrad graderades från 0 till+3: en+1 lesion representerade en inblandning av mindre än eller lika med 30 % av glomerulus,+2 av 30–60 %, medan en +3 lesion indikerade att mer än eller lika med 60 % av glomerulus var inblandad. Mätning av GBM-tjocklek utfördes på glomerulära elektronmikrofotografier av WT och Clr-f −/− med hjälp av bild J V1.53a47. PAS-färgad njurvävnad från två Rag1−/− och två Rag1−/−Clr-f −/− möss bedömdes dessutom blint för förekomsten av de patologiska egenskaperna ovan, och de kvantifierade egenskaperna beräknades från de genomsnittliga fyra njursnitten per mus.

Elektronmikroskopi.

Bearbetning av vävnad för transmissionselektronmikroskopi följde det publicerade protokollet48. Kortfattat fixerades små bitar av njurvävnad från 12-veckogamla WT- och Clr-f −/− möss i 2,5 % glutaraldehydlösning och bearbetades sedan med 1 % osmiumtetroxid/uranylacetatmetoden. Prover bäddades in i Epon Araldite-harts före skärning med användning av en Reichert-Jung ultraskuren E ultramikrotom. Prover visualiserades på ett JEOL JEM 1230 transmissionselektronmikroskop och bilder togs med en Hamamatsu ORCA-HR digitalkamera.

Urin och plasma kemiskt avfall och elektrolytmätning.

Ungefär 150 μL urin samlades dagligen från 12-veckogamla WT- och Clr-f −/− hanmöss vid samma tidpunkt på dagen under 5 dagar i följd. Urin centrifugerades vid 10,000 rpm för att avlägsna skräp och lagrades sedan vid -80 grader. Ansiktsvenblod samlades från samma möss i hepariniserade rör och isolerades genom centrifugering vid 3000 g under 5 minuter och lagrades vid -80 grader. Urin- och plasmaprover skickades till Idexx Laboratories (Markham, Ontario) för mätningar av protein-, kreatinin- och elektrolytkoncentration.

Blodtrycksmätningar på 12 och 24 veckor gamla möss. Systoliskt och diastoliskt blodtryck (BP) mättes med tail-cuff-pletysmografi på 12 och 24-veckor gamla WT- och Clr-f −/− hanmöss vid steady state med en BP2000 Visitech-modell. BP mättes dagligen i samma rum och vid samma timme på dagen under 5 dagar i följd. BP-värden för de senaste 3 på varandra följande mätningarna användes för att beräkna det genomsnittliga BP-värdet eftersom de första 2 dagarna ansågs väsentliga för möss anpassning.

Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30× 106 avläsningsdjup per prov.

RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 och loggvikningsändringsgräns på 1,5. FPKM-värden för alla tidpunkter och prover tillhandahålls (Supplementary Dataset File 1). Funktionsanrikningsanalys. Genontologi och funktionell anrikningsanalys utfördes med g: Profiler (version e102_eg49_p15_7a9b4d6) med g: SCS multiple testing korrigeringsmetod som tillämpar signifikanströskel på 0,05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 och PANTHER-klassificeringssystemet med Fishers Exact-testning och FDR-tröskel för<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53. 

Funktionella anrikningsnätverk skapades med hjälp av genuppsättningar av GO Biological Processes (GO: BP) för Mus Musculus (GRCm38. p6) BioMart release: 2020-12-08 nedladdat från g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee) /gprofiler/gost). Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) utfördes med GSEA V4.0354,55 med nätverksanrikning baserad på FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).

Abdominal och ektopisk lipidanalys. Fettackumulering bestämdes av vikten av bukfett som dissekerats från individuella möss. Kroppsviktsmätningar gjordes före fettextraktioner. För Oil Red O (ORO)-färgning skars frysta njursektioner vid 10 μm med en kryostat och lufttorkades sedan i 30 min. ORO-färgning utfördes genom att fixera sektionerna med 3 tvättar av 60% isopropanol, varvid de inkuberades med en arbetskoncentration (66%) av ORO-lösning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) färgning under 15 min. Objektglasen tvättades sedan snabbt med 60 % isopropanol, färgades snabbt med Mayers hematoxylin för att markera kärnor och monterades sedan med VectaMount AQ Aqueous Mounting Media (Vector Laboratories).

Patotypanalys. Patotypanalys utfördes med användning av differentiellt uttryckta gener (DEG) med q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation. 

Smält vävnad passerades genom ett 70-μm nylonfilter, PBS tvättades och de återstående röda blodkropparna lyserades med ACK-lyseringsbuffert i 5 minuter på is. Njurimmunceller isolerades genom RT-centrifugering vid 2000 rpm under 30 minuter i 40% Percoll. Cellpelleten återsuspenderades i PBS och cellantal erhölls med hemocytometer. Olika mAbs användes för att verifiera cellytans proteinuttryck, celler färgades för flödescytometrianalys med fluorokrommärkta musantikroppar: anti-CD45 (eBioscience, klon 30-F11), anti-TCR (eBioscience, klon H{ {12}}), anti-NK1.1 (eBioscience, klon PK136), anti-CD19 (BioLegend, klon 1D3/CD19), anti-CD11b (BioLegend, klon M1/70), anti-F4/80 (BioLegend, klon BM8), anti-MHCII(IA/IE) (BioLegend, klon M5/114.15.2), anti-Ly6G (BioLegend, klon 1A8), anti-NKp46 (eBioscience, klon 29A1.4) och isotypkontroller. Cellviabiliteten bestämdes med ett Fixable Viability Dye (eBioscience, Cat# 65-0865-14). För att identifiera och kvantifiera immuncellpopulationer i WT- och Clr-f −/− njurarna, användes multiparametriska fowcytometrianalyser med antikroppar mot cellspecifika markörer för att identifiera neutrofiler (CD11b+Ly6G+), makrofager (CD11b+Ly6G−F4/{ {57}}MHCII+), NK-celler (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+) och NKp46+-celler (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), T-celler (Ly6G−NK1 .1−TCR+) och B-celler (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Alla prover förvärvades på en BD-Fortessa fowcytometer.

Referenser

1. Hato, T. & Dagher, PC Hur det medfödda immunförsvaret känner av problem och orsakar problem.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1459–1469 (2015).

2. Krüger, T.et al.Identifiering och funktionell karakterisering av dendritiska celler i den friska murina njuren och i experimentellaglomerulonefrit.J. Am. Soc. Nephrol.15, 613–621 (2004). 

3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Dendritiska celler och makrofager: Sentinels i njuren.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1841–1851 (2015).

4. Woltman, AMet al.Kvantifiering av undergrupper av dendritiska celler i mänsklig njurvävnad under normala och patologiska tillstånd.Kidney Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Gottschalk, C.et al.Batf3-beroende dendritiska celler i njurlymfkörteln inducerar tolerans mot cirkulerande antigener.J. Am.Soc. Nephrol.24, 543–549 (2013).

6. Zhang, Q.et al.Mus Nkrp1-Clr-genklustersekvens- och uttrycksanalyser avslöjar konservering av vävnadsspecifik MHCoberoende immunövervakning.PLoS One7, e50561 (2012).

7. Leibelt, S.et al.Dedikerad immunosensering av musens tarmepitel underlättas av ett par genetiskt kopplade lektinliknandereceptorer.Slemhinnor Immun.

8, 232–242 (2015). 8. Rahim, MMAet al.Mus NKR-P1B: Clr-b-igenkänningssystem är en negativ regulator av medfödda immunsvar.Blod125, 2217–2227 (2015). 

9. Carlyle, JRet al.Saknar självigenkänning av Ocil/Clr-b av hämmande NKR-P1 naturliga mördarcellreceptorer.Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004). 

10. Rutkowski, E.et al.Clr-a: En ny immunrelaterad C-typ lektinliknande molekyl uteslutande uttryckt av mustarmsepitel.J. Immunol.198, 916–926 (2017).

11. Balaji, GRet al.Igenkänning av värden Clr-b av den hämmande NKR-P1B-receptorn ger en grund för att sakna självigenkänning.Nat.Commun.9, 4623 (2018)

12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Välj Clr-g-uttryck på aktiverade dendritiska celler underlättar besläktad interaktionmed en mindre undergrupp av mjält-NK-celler som uttrycker den hämmande Nkrp1g-receptorn.J. Immunol.200, 983–996 (2018). 

13. Abou-Samra, E.et al.NKR-P1B-uttryck i tarmassocierade medfödda lymfoida celler krävs för kontroll av gastrointestinalatarminfektioner.Cell. Mol. Immunol.16, 868–877 (2019).

14. Germain, C.et al.Karakterisering av alternativt splitsade transkriptvarianter av CLEC2D-genen.J. Biol. Chem.285, 36207–36215 (2010).

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIGT ORGANISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 25 % ECHINACOSID OCH 9 % ACTEOSID FÖR NJURINFEKTION