Omfattande profilering av sekretomformuleringar från foster- och perinatala humana fostervattenstamceller Del 1
Jul 22, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Abstrakt:Vi har tidigare rapporterat att c-KIT plus htaman fostervatten-härledda stamceller erhållna från överblivna prover av rutin Ⅱ trimester prenatal diagnos (fetal hAFS) är utrustade med regenerativ parakrin potential som driver pro-överlevnad, anti-fibrotiska och proliferativa effekter. har också kan isoleras från kliniska avfallsprover i tredje trimestern under schemalagda kejsarsnitt (perinatala hAFS), vilket ger ett mer lättillgängligt alternativ jämfört med fosterhAFS. Icke desto mindre är lite känt om den parakrina profilen av perinatal hAFS. Här ger vi en detaljerad karakterisering av hAFS totala sekretom (dvs. hela lösliga parakrina faktorer som frisätts av celler i det konditionerade mediet, hAFS-CM) och de extracellulära vesiklarna ( hAFS-EVs) inom den, från Ⅱtrimester foster-versus III trimester perinatala celler. Fetal- och perinatal hAFS karakteriserades och utsattes för hypoxisk förkonditionering för att förbättra deras parakrina potential. hAFS-CM- och hAFS-EV-formuleringar analyserades med avseende på protein- och kemokin/cytokininnehåll, och EV-lasten undersöktes ytterligare genom RNA-sekvensering. Fenotypen av foster- och perinatal hAFS, tillsammans med deras motsvarande sekretomformuleringar, överlappade varandra; Ändå visade fostrets hAFS omogen oxidativ fosforyleringsaktivitet jämfört med perinatala. Profileringen av deras parakrina last avslöjade vissa skillnader beroende på graviditetsstadiet och hypoxisk förkonditionering. Båda cellkällorna gav formuleringar berikade med neurotrofiska, immunmodulerande, antifibrotiska och endotelstimulerande faktorer, och det omogna fetala hAFS-sekretomet definierades av en mer uttalad provaskulogen, regenerativ, pro-upplösande och anti-åldrande profil. Liten RNA-profilering visade mikroRNA-berikning i både fetal och perinatal hAFS-EV-last, med en stabilt uttryckt pro-resolving-kärna som en referensmolekylär signatur. Här bekräftar vi att hAFS representerar en tilltalande källa till regenerativa parakrina faktorer; valet av antingen fetala eller perinatala hAFS-sekretomformuleringar för framtida parakrin terapi bör utvärderas med hänsyn till det specifika kliniska scenariot.
Nyckelord:Amnionvätska; stamceller; parakrina effekter; extracellulära vesiklar; cellkonditionerat medium; kemokin; cytokiner; proteomik; RNA-sekvensering; mikroRNA
1. Introduktion
Regenerativ medicin har nyligen utvecklats som ett framväxande område för att tillhandahålla funktionellt återställande av skadad vävnad med hjälp av flera strategier. Eftersom vävnadstekniska tillvägagångssätt har utvecklats avsevärt under de senaste åren, har undersökningen av parakrina stamcellers effekter samtidigt intensifierats alltmer. Den terapeutiska potentialen hos transplanterade stamceller har i stort sett visats vara mestadels förmedlad av deras utsöndrade lösliga faktorer, som kan orkestrera en pro-regenerativ mikromiljö i värdvävnaden samtidigt som den utlöser aktiveringen av endogena mekanismer för funktionell återhämtning [1,2]. Därför har stamcellen utsöndrat hela cellfrisatta parakrina trofiska molekyler, såväl som membranbundna extracellulära vesiklar, alltmer föreslagits som ett innovativt terapiläkemedel genom flera oberoende prekliniska studier som riktar sig till kardiovaskulära, neurologiska och/eller inflammatoriska sjukdom. Följaktligen kan stamceller ses som biologiska fabriker för utnyttjande av deras terapeutiska sekretom genom att erbjuda färdiga att använda och färdiga regenerativa behandlingar. Genom att tillämpa en sådan cellbaserad, men ändå cellfri strategi, kan många begränsande aspekter associerade med kanonisk cellterapi övervinnas, samtidigt som gynnsamma effekter säkerställs.vad är en cistancheI detta perspektiv har mesenkymala stromaceller (MSC) testats omfattande som förmodade cellkandidater? Faktum är att MSC och stam-/progenitorceller har konstruerats och/eller stimulerats av olika förkonditioneringsstrategier för att förbättra deras regenerativa kapacitet och sekretoriska potential [3,4] med ett uttryckligt intresse för den biologiska relevansen av deras utsöndrade extracellulära vesiklar (EV).
EV: er är partiklar i nanostorlek som avgränsas av ett lipiddubbelskikt och utsöndras aktivt av alla celltyper. Elbilar inkluderar mycket små (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); de fungerar som kritiska biologiska transportörer för intercellulär signalering genom att leverera sin molekylära last från en föräldracell till en responder/målgrupp [5,6]. Med tanke på att deras speciella parakrina potential när det gäller att utöva gynnsamma effekter är jämförbar med deras ursprungsceller, har stamcellselektroniska elbilar uppstått som tilltalande terapeutiska alternativ i prekliniska modeller av sjukdomar, såsom ischemi, inflammation eller skada, som utförligt granskats i [{{3 }}]. Ur ett translationsperspektiv, utöver cellmodulerande potential, är isoleringsmöjlighet och förhöjd självförnyelse nyckelaspekter av den ideala källan till terapeutiska elbilar och lösliga faktorer. I ett sådant scenario kan fetal och perinatal MSC erbjuda ett intressant alternativ med tanke på deras proliferativa potential och utvecklingsmässigt omogna profil med intermediära egenskaper mellan embryonala och vuxna somatiska stamfader [10,11]. Fetal MSC kan isoleras från extra-embryonala annex under graviditeten som överbliven provtagning som erhålls under prenatal screening (dvs. korionvilli [12-14] och fostervatten [15,16]) eller erhålls som perinatala progenitorer vid födseln, från kliniskt avfallsmaterial (dvs foster- och placentamembran [17-21], navelsträngskomponenter [22-24] och term fostervatten [25,26]).
Cistanche kan anti-aging
Särskilt har humana fostervattenstamceller (hAFS) framhållits som lovande terapeutiska strategier inom regenerativ medicin. och har visat sig vara brett multipotenta in vitro och in vivo [16,27,28], bidrar till den hematopoetiska härkomsten efter in utero-transplantation [29], och ympar in skadade organ samtidigt som de utövar immunmodulerande effekter [26,30] och aktiverar endogena reparativa svar, som utförligt beskrivs i [31]. Vårt team och andra har ytterligare visat att hAFS frisätter ett sekretom som är mycket berikat med bioaktiva trofiska molekyler som kan rikta in sig på olika reparativa mekanismer. hAFS parakrina faktorer har rapporterats ge pro-överlevnadsstimuli med släckning av inflammation [32], ger kardioskydd mot förlängd ischemi [33.34] och kardiotoxicitet [35], och stimulerar lokal angiogenes med återinträde i kardiomyocytcellcykeln [ 34,36]. Eftersom de flesta av dessa effekter har visat sig rekapituleras av enbart hAFS-EV-administration, har oberoende studier fokuserat på att dissekera deras regenerativa profil mot olika patologiska bakgrunder, inklusive skelett- och hjärtmuskelskada, njursjukdom, artros, osteoporos, nekrotiserande enterokolit och neurodegenerativ modeller [34,37-44].
Även om bevis kan stödja den kliniska översättningen av hAFS-EV för framtida parakrinterapi, är det viktigt att tänka på att de flesta av dessa studier huvudsakligen har undersökt den modulerande potentialen hos fosterhAFS som erhållits under Ⅱ trimester prenatal screening. En fullständig profil av sekretomet från den perinatala har motsvarighet (dvs från III trimester c-sektioner) har ännu inte utforskats i detalj. Tredje trimesterns perinatala hAFS har visat distinkta immunreglerande egenskaper jämfört med mig- och II-trimestern [26], samtidigt som relevant endotelial regenerativ potential bibehålls [25].hur mycket cistanche att taDet bör noteras att den senaste rapporten om den heterogena morfologin hos fostrets hAFS[45] har gett nya insikter om deras stamness och genuttrycksprofil.bioflavonoiderDetta har helt och hållet kastat nytt ljus över det regenerativa värdet av de olika cellfraktionerna av hAFS[46]. Därför väcker omfattande karaktärisering av de olika subpopulationerna av hAFS ökande uppmärksamhet. Vi har tidigare rapporterat att en 24-timmars hypoxisk och serumfri stimulering representerar en effektiv strategi för att öka den parakrina potentialen för Ⅱ trimester foster hAFS [34,35,37]. Eftersom lite är känt om sammansättningen av sekretomet från III trimester hAFS, rapporterar vi här den omfattande jämförelsen av Ⅱ kontra Ⅲ trimester hAFS och deras sekretomfraktioner (inklusive hattar-EVs), för att ta itu med påverkan av graviditetsstadiet och hypoxiska celler prekonditionering av cell- och sekretomegenskaper.
2. Resultat
2.1.Perinatal hAFS Presentera en nära fenotypisk matchning till foster har
Ingen statistiskt relevant skillnad uppskattades i donatorålder mellan fostervattenprover från Il trimester och perinatal III trimester. Fetalt c-KIT* hAFS (f-hAFS från II trimester amnionvattenprover) och perinatalt c-KIT* hAFS (p-hAFS från III trimesters amnionvätska kliniskt avfall) bekräftade liknande egenskaper med fibroblastliknande och oval-rund morfologi (Figur 1A) och mesenkymal stromal fenotyp (data visas inte), som tidigare rapporterats [16,25]. Både f-hAFS och p-hAFS odlade in vitro fram till passage 5 visade försumbara nivåer av åldrande från åldringsassocierad - -galaktosidas (SA- -Gal) aktivering i cirka 4 procent av cellerna (Figur 1B) . Både f-hAFS och p-hAFS presenterade en hög nivå av samuttryck av de mesenkymala markörerna CD107a och CD146, som nyligen har rapporterats definiera en mycket sekretorisk fenotyp[47]. CD107at CD146*-celler representerade majoriteten av f-hAFS-populationen (ungefär 64 procent,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">
Figur 1. Foster har och perinatalt har fenotypisk utvärdering. (A) Representativa bilder av foster hAFS (f-hAFS, vänster panel) och perinatal hAFS (p-hAFS, höger panel) odlade in vitro under standardförhållanden; skalstapel: 200 um. (B) Analys av den senescenta markören beta-galaktosidas(SA- -Gal, i blått) via cytokemifärgning på f-hAFS och p-hAFS efter 5 passager i kultur; representativa bilder rapporteras i den vänstra panelen, skalstapel: 200 um. Motsvarande procentandel av -Gal-positiva celler/fält rapporteras i grafen i den högra panelen (f-hAFS:4,12±0,58 procent och p-hAFS:3,88±2,10 procent ;p=0.1424,n{ {24}} experiment).(C)Immunofenotyp av hAFS som uttrycker CD146 och CD107a mesenkymala markörer. Representativa flödescytometridiagram av f-hAFS och p-hAFS (vänster panel) och motsvarande värden hänvisade till dubbelpositiva CD107a plus CD146 plus celler; CD107a plus CD146* f-hAFS:63,68±5,82 procent ,*p=0.016jämfört med resterande g36,32±5,82 procent f-hAFS (Övrigt);CD107at CD146 plus p-hAFS:52,07±6,76 procent med återstående. 93±56,76 procent p-hAFS (Övrigt); CD107a plus CD146 plus f-hAFS vs CD107a plus CD146 plus p-hAFS p=0.2403,n=4 experiment. Övrigt: total mängd återstående CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS och CD107at CD146-hAFS. Alla värden uttrycks som medelvärde ± sem av oberoende experiment. SA- -Gal: Ålderdomsassocierat- -galaktosidas.
2.2.Fetal hAFS visar en annan metabolism än perinatal hAFS
För att utvärdera om graviditetsstadiet kan påverka mitokondriell metabolism, analyserades f-hAFS och p-hAFS i standardförhållanden in vitro-odling genom biokemiska analyser. Utvärdering av aerob metabolism visade att syreförbrukningshastigheten (OCR) och ATP-syntesen var lägre i f-hAFS med avseende på p-hAFS, både när de stimulerades med pyruvat plus malat (P/M;***p)<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">
2.3. Hypoxisk förkonditionering påverkar inte foster- och perinatal har viabilitet och upprätthåller deras sekretoriska aktivitet
För att definiera hAFS-sekretomformuleringar odlades celler under serumfria betingelser för att undvika kontaminering från FBS. Vi har tidigare visat att 24 timmars serumfria (SF) och 1 procent O2 hypoxiska odlingsförhållanden inte signifikant förändrade livsdugligheten för Ⅱtrimester fetalt hAFS (f-hope), medan de stödde frisättningen av regenerativa parakrina faktorer i deras cellkonditionerade medium (hAFS-CM) och i extracellulära vesiklar (hAFS. EVs) [34,35,37,49]. Häri, förutom att profilera p-hAFS-sekretomfraktionerna för första gången, utvärderade vi om p-har uppvisat liknande beteende under samma förkonditionering, med användning av det normoxiska odlingsförhållandet som kontroll. f-hAFS och p-hAFS livsduglighet analyserades efter 24 timmar i följande inställningar: normoxiskt (20 procent O2) tillstånd i komplett kontroll (Ctrl) odlingsmedium (Ctrlf-hAFSnormo och Ctrl p-hAFSnormo), ett normoxiskt tillstånd i SF medium (SF f-hAFSnormo och SF p-hAFSnormo), hypoxiskt (1 procent O2) tillstånd i komplett kontrollmedium (Ctrlf-har hypo och Ctrl p-hAFSnypo), och hypoxiskt tillstånd i SF-medium (SF f-har hypo och SF p -har hypo, figur 3A). Vi bekräftade att f-has viabilitet var oförändrad i både Ctrl- och SF-förhållanden och under hypoxisk stimulering, med mer än 80 procent (upp till nästan 88 procent) av de totala cellerna som var opåverkade. Tidiga och sena apoptotiska celler varierade från ca. 13 procent till 18 procent i SF-förhållanden, utan någon statistiskt signifikant relevans. Likaså låg perinatal livsduglighet i intervallet 80-92 procent och tidiga och sena apoptotiska celler representerade upp till 18 procent i SF-tillstånd. p-hAFS påverkades marginellt endast under de kombinerade hypoxiska och SF-förhållandena; faktiskt, medan förkonditionering inte påverkade cellöverlevnad när p-hAFS odlades i ett komplett medium, visade motsvarande SF-tillstånd en ökning med ca. 4-veck (* sid<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">
Figur 2. Metabolisk karakterisering av foster- och perinatalhAFS. (A) Syreförbrukningshastighet (OCR), ATP-syntes genom F1-F.ATP-syntas och P/O-kvot i f-have och-have i närvaro av pyruvat plus malat (P/M) eller succinat (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustralienJämförelsen av procentandelen av inhibering av OCR- och ATP-syntes i f-och-hAFS på grund av de ovan angivna inhibitorerna rapporteras i den nedre panelen B. För OCR-experiment: hAFS plus Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">
Vi utvärderade sedan utbytet av sekretomfraktioner erhållna från f-hAFS kontra p-hAFS baserat på proteinberikning. Totalt har sekretom, eftersom hela cellutsöndrade parakrina faktorer här representeras av hAFS-CM. Proteinkoncentrationen av f-hAFS-CM och p-hAFS-CM i SF-medium efter hypoxisk cellförbehandling kontra normoxiskt kontrolltillstånd som baslinje (nämligen f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo och p -hAFS-CMHypo,) utvärderades med BCA-analys och mättes enligt 10§ celler.cistanchResultaten antydde att f-has-CM och p-hAFS-CM visade en lika positiv trend i proteinberikning efter hypoxisk priming (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 gradceller;p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 graders celler） över sina normoxiska motsvarigheter (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 ug/10 graders celler; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 graders celler. Likaså mättes ytproteinkoncentrationen av hAFS-EVs i f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo och p-hAFS-EVShypo EVs visade jämförbart utbyte när de erhölls från f-hAFS eller p-hAFS. Som för hAFS-CM-formuleringar, en positiv trend i ökningen av proteinhalten på f-hAFS-EVs och p-hAFS. EVs uppskattades efter hypoxisk stimulering över motsvarande normoxiska tillstånd （f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 graders celler och p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 graders celler;f-have-EVsnormo∶1,28±0,36 ug/10 grader -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 graders celler, figur 3C).
2.4.Fetal- och perinatala hAFS-utgivningsbilar med analog morfologi och storleksfördelning
Morfologisk analys med transmissionselektronmikroskopi (TEM) ökade den höga EV-sekretoriska proliferationen av både f-hAFS och p-hAFS (Figur 4). Vi undersökte ytterligare storleken och arean av f-hAFS-EVs och p-hAFS-EVs (Figur 4B) efter hypoxisk förkonditionering jämfört med normoxisk baslinje. Foster- och perinatala har släppt ut elbilar med heterogena storlek, i intervallet 40-250 nm, och inkluderar därför både exosomer/små elbilar och mikrovesiklar/blåsor som släpper ut. Den genomsnittliga storleken på elbilar/fält i de olika grupperna var jämförbar, fostrets hAFS-EV mätte 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) och perinatala mättes 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, nm, 4B, vänster panel). När det gäller utbytet visade hAFS stimulerad under hypoxi en positiv trend i ökningen av mängden små elbilar, även om denna ökning inte var statistiskt signifikant. f-hAFS-EVStypo mätte 40-70 nm vilket var nästan dubbelt så mycket jämfört med deras normoxiska motsvarighet. Perinatal-has-EVSHypo som mätte 40-70 nm, 70-100 nm och 100-130 nm var nästan tredubbla mängden av de som erhölls i normoxisk kultur (Figur 4B).
Nanopartikelspårningsanalys (NTA) visade ett förhöjt antal partiklar i både f-hAFS-EV- och p-hAFS-EV-preparat, och bekräftade ökningen av EVs i de hypoxiska proverna, vilket också observerats från de tidigare analyserna (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'partiklar/10 graders celler; f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10 graders partiklar/10 graders celler ;p-hAFS-EVsnormo:2,43±0,80×10 graderspartiklar/10 graders celler;p-hAFS-EVshypo:3,05±0,62x10 graderspartiklar/10 graders celler, figur 4C).
Figur 4. Morfologisk karakterisering av fetala och perinatala har-EV. (A) Representativa bilder av transmissionselektronmikroskopi (TEM) av f-hAFS och p-hAFS (övre respektive nedre vänstra panelen, med svarta pilar som indikerar intracytoplasmatiska multi-vesikulära kroppar med små EV/exosomer inom dem), och av f -hAFS-EVs och p-hAFS-EVs (övre respektive nedre högra panelen) släpps under serumfria förhållanden och under normoxisk kontra hypoxisk förkonditionering (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; och f-hAFS-EVshypo, respektive), skalstaplar: 200 nm. (B) Vänster panel: TEM-analys av hAFS-EVs storleksfördelning; höger panel: fördelning av antalet f-hAFS-EV och p-hAFS-EV per fältstorleksintervall från 40 nm upp till 250 nm beaktades; värden uttrycks som medelvärde±sem av n=3 oberoende experiment. (C) Nanopartikelspårningsanalys för hAFS-storlek och distribution. Vänster panel: representativ bild av den grafiska utdata; höger panel: hAFS-EVs-koncentration mätt som 10 graders partiklar per 10 graders utsöndrande celler; nm: nanometer; ml: milliliter.
2.5. Proteomisk karaktärisering av foster vs. perinatal hAFS framhäver skillnader i deras sekretomsammansättning enligt graviditetsålder och hypoxisk förkonditionering
Proteomisk karakterisering av både f-hAFS- och p-hAFS-sekretomformuleringar utfördes med hjälp av en hagelgevärsetikettfri plattform, baserad på kopplingen av nanovätskekromatografi och högupplöst masspektrometri (nLC-HRMS). Fyrtioåtta proteomiska profiler förvärvades genom duplikatanalys av tre biologiska replikat av hAFS-CM och har-EV från f-hAFS och p-hAFS som genomgick hypoxisk cellförbehandling jämfört med det normoxiska tillståndet som en kontroll. Totalt 4179 distinkta proteingrupper identifierades med minst en unik peptid och med molekylvikter från 2 till 3900 kDa och isoelektriska punkter från 3,6 till 13. Ett högre genomsnittligt proteinuttryck i hAFS-EVs observerades jämfört med hAFS-CM . Justeringen av alla erhållna proteinlistor utfördes på basis av identifierade proteiner. För varje experimentellt tillstånd skapades en unik lista som normaliserade och genomsnittliga [50] peptidspektrummatchningsvärdena (PSM) som tillskrivs proteinerna, som representerar antalet masspektra som tilldelats var och en och indirekt representerar deras överflöd i proverna. Den fullständiga listan över proteiner som identifierats i hAFS-CM och har-EV-formuleringar rapporteras i tabell S1.
Tillämpningen av linjär diskriminantanalys (LDA[51]) på denna masterlista möjliggjorde extraktion av statistiskt signifikanta proteiner (Fratio större än eller lika med 4,5 och** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 i hAFS-CM och har-EV-formuleringar övervägda separat. Medan cirka 69,5 procent och 69,9 procent av proteinerna delades mellan hAFS-EVs respektive hAFS-CM-förhållanden, verkade det återstående innehållet exklusivt i olika proportioner, från 3,7 procent till 13,4 procent, bland formuleringarna.
För att kvantitativt undersöka de proteomiska förändringarna utfördes en märkningsfri differentialanalys genom att använda den hemmagjorda programvaran MAProMa och använda två algoritmer, DAve (Differential Average) och DCI (Differential Confidence Index, som representerar förhållandet och förtroendet för differentiellt uttryck, respektive), på PSM för varje enskilt protein mellan de två jämförda termerna. Användning av stringenta filter för DAve och DCI för att maximera förtroendet för identifiering och för att överväga proteiner med en variation som är större än en gångers förändring på 1,5, parvisa jämförelser av f-hAFS-CM kontra p-hAFS-CM och av f-hAFS-EVs kontra f-hAFS-EVs kontra p-hAFS-EVs gjordes enligt cellens graviditetsstadium. Totalt 58 och 109 proteiner hittades differentiellt uttryckta i ovanstående has-CM- respektive have-EV-avdelningar (Figur S1B, C för utvalda detaljer och Tabell S2-S3 i utökad form). Bland dessa resulterade 30 proteiner uppreglerade i f-hAFS-CM och 28 uppreglerades i p-hAFS-CM (Figur S1B); likaså resulterade 44 distinkta proteiner i uppreglerade i f-have-EVs och 65 uppreglerades i p-hAFS-EVs (Figur S1C). Speciellt är proteiner som resulterade i uppreglerade i f-hav att betraktas som nedreglerade i p-has och vice versa.
värden rapporteras; se Tabell S2 för den fullständiga listan och detaljerade parametrar för de rapporterade proteinerna. (C) Biologiska processer anrikningsanalys av proteiner identifierade med en frekvens av minst 2 i foster hAFS-CM (vänster panel) och perinatal have-CM (höger panel) enligt cellhypoxisk förkonditionering. Baserat på FunRich-verktyget visas genontologitermer i stapeldiagram som rapporterar procentandelen gener berikade för varje kategori (rosa staplar för-ha-CMnormo, lila staplar för f-hAFS-CMhypor ljusblå staplar för p-hAFS-CMnormo, och blå kulor för p-hAFS-CMhypo).köpa cistancheEndast genontologitermer med Bonferroni korrigerad med*p<0.05 are="">
Denna artikel är extraherad från Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms
