Cytokinabsorption under mänsklig njurperfusion minskar fördröjd graftfunktionsassocierad inflammatorisk gensignatur

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

John R. Ferdinand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Molecular Immunity Unit, University of Cambridge Institutionen för medicin, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Storbritannien

2 National Institute of Health Research Blod- och transplantationsforskningsenhet i organdonation, Cambridge, Storbritannien

3 University of Cambridge Department of Surgery, Cambridge, Storbritannien

Transplantation är den optimala behandlingen för de flesta patienter med slutstadietnjuresjukdommen organbrist är en stor utmaning. Normotermisk maskinperfusion (NMP) har använts för att rekonditionera marginella organ; mekanismer genom vilka NMP kan gynna organ är dock inte välkända. Med hjälp av par mänskliga njurar erhållna från samma givare jämförde vi effekten av NMP med den av kylförvaring på den globalanjuretranskriptom. Vi fann att kylförvaring ledde till en global minskning av genuttryck, inklusive gener för inflammatoriska vägar och de som krävs för energigenereringsprocesser, såsom oxidativ fosforylering (OXPHOS). Däremot skedde under NMP markant uppreglering av OXPHOS-gener, men också av ett antal immun- och inflammatoriska gener. Genom att använda biopsier från njurar som genomgick NMP som därefter transplanterades, fann vi att högre inflammatoriskt genuttryck inträffade i organ med förlängd fördröjd transplantatfunktion (DGF). Därför använde vi en hem-adsorber (HA) för att ta bort pro-inflammatoriska cytokiner. Detta försvagade inflammatoriska genuttryck ökade OXPHOS-väggener och hade potentiellt kliniskt viktiga effekter för att minska uttrycket av en DGF-associerad gensignatur. Tillsammans tyder våra data på att adsorption av pro-inflammatoriska mediatorer från perfusatet representerar en potentiell intervention som kan förbättra organens livsduglighet.

NYCKELORD:klinisk forskning/praktik, fördröjd graftfunktion (DGF), donatorer och donation: avlidna,njure(allograft) funktion/dysfunktion,njuresjukdom: immun/inflammatorisk, njure

Cistanche ört som förbättrar njurfunktionen

1. INTRODUKTION

Njuretransplantation representerar den optimala behandlingen för de flesta patienter medslutskedenjuresjukdom, med fördelar för både livskvalitet och kvantitet.1 Organbrist är en stor utmaning, och flera strategier har använts för att öka antalet tillgängliga njurar, inklusive användning av donatorer av avliden cirkulationsdöd (DCD) och donatorer med utökade kriterier (ECD) ), som båda är förknippade med högre frekvenser av fördröjd transplantatfunktion (DGF) jämfört med avliden hjärnstammsdöd (DBD) donator.2,3 I DCD-njurar ger exponering för varm ischemi under processen med cirkulationsstopp ett betydande bidrag till DGF . DGF uppstår på grund av ischemisk tubulär cellskada eller död, vilket kan stimulera medfödd immunaktivering via NLRP3-inflammasomsamling, vilket leder till generering av interleukin (IL)1 och IL18.4-6 Förekomsten av inflammatoriska cytokiner i urinen har faktiskt varit används som biomarkör förakutnjureskadaoch DGF.7-9

Normotermisk maskinperfusion (NMP) gör att transplanterade organ kan perfunderas med varma, syresatta röda blodkroppar, i frånvaro av cirkulerande immunkomponenter, inklusive komplement och neutrofiler.10-14 Denna process har använts för att bedöma marginella organ15 och för att " rekonditionera" organ för att underlätta transplantation av njurar som från början avböjdes efter ett erbjudande via en nationell organtilldelningstjänst.16 Vår tidigare erfarenhet av att använda NMP gav skälen till en randomiserad kontrollerad studie för att bedöma dess effektivitet för att förebygga DGF i DCD-njurar,17 men de mekanismer genom vilka NMP kan gynna transplanterade njurar är inte helt klarlagda. Vidare, frågan om ytterligare manipulation avnjureunder NMP, till exempel genom att ta bort pro-inflammatoriska cytokiner och kemokiner från perfusatet, kan erbjuda ytterligare fördelar för att optimera organet före transplantation har inte behandlats i mänskliga njurar, men vår studie av svin NMP visade lovande resultat.18

Här tog vi ett opartiskt tillvägagångssätt för att ta itu med dessa två frågor med hjälp av transkriptomisk analys av människannjurebiopsier tagna i början och slutet av NMP för att bedöma globala förändringar i genuttryck. Vi använde par av mänskliga njurar från en enda donator som möjliggjorde en jämförelse av effekten av olika interventioner i organ med identisk genetisk bakgrund och kunde bedöma effekten av dessa förändringar på en förutsägelse av transplantatresultat.

Cistanche extrakt fördel: förebygga akutnjureskada

2. RESULTAT

2.1. Parade njurar är genetiskt lika och en användbar modell för att bedöma interventioner

Vi undersökte de transkriptionsförändringar som är förknippade med organkonservering och NMP i två oberoende studier, var och en med fem par njurar, vilket ger totalt 10 par/20 mänskliga njurar. Av dessa var två från DBD och åtta från DCD-givare (tabell S1, S2 och figur S1). I dessa studier tog vi kortikala biopsier före och efter intervention (kylförvaring eller NMP) och undersökte det transkriptionella landskapet med hjälp av RNA-sekvensering (RNA-Seq). Användningen av parade njurar och parade biopsier från densammanjuretillät oss att kontrollera för biologisk variation och att regressera denna konfounder ur analysen (Figur S2A). Vi bekräftade detnjurepar börjar med ett gemensamt transkriptionslandskap (Fig. S2B) och genom att tillämpa olika ingrepp på varjenjurei ett par kan vi studera effekten av en intervention oberoende av biologisk variation.

FIGUR 1 Njurar som exponerats för kylförvaring visar begränsade förändringar i genuttryck jämfört med de som genomgår NMP. Ett par njurar erhölls som hade avvisats för användning vid transplantation. Ettnjurehölls i statisk kylförvaring och den andra genomgick normotermisk maskinperfusion (NMP). Biopsier togs från den yttre cortex vid starten och efter 2 timmar. B, Volcano plot som indikerar en förändring i genuttryck efter 2 timmar för den angivna gruppen jämfört med starten. Röda prickar indikerar differentiellt uttryckta gener med ett justerat P-värde<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

FIGUR 2 Korrelation av transkriptom efter NMP med längden av fördröjd transplantatfunktion. Ett genuttryck korrelerades med längden av DGF i biopsier tagna efter NMP som en del av en randomiserad klinisk prövning. Expressionsnivåerna för de 1000 generna med störst korrelation med resultatet har plottats. B, GSEA utfördes för korrelationen från A mot känneteckens datauppsättning. Endast signifikanta vägar (FDR q-värde<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP resulterar i en ökning av OXPHOS- och inflammationsvägsgener jämfört med kylförvaring

För att undersöka de potentiella mekanismerna genom vilka NMP kan påverka njurarna, tog vi initialt femnjurepar (n {{0}} DCD-donatorer och n=1 avliden hjärnstamsdöd [DBD] donator, Figur S1, Tabell S1) och utförde en tid 0 (0 timmar) kortikal biopsi . Vid denna tidpunkt randomiserades njurarna till statisk kylförvaring eller NMP, som beskrivits tidigare 10 (Figur 1A). Efter 2 timmar togs en andra biopsi från båda njurarna och RNA-Seq utfördes. När vi jämförde genuttryck mellan tid 0- och 2-timme biopsier, fann vi att njurar placerade i statisk kylförvaring inte hade någon statistiskt signifikant förändring i uttrycket av någon enskild gen när de korrigerades för flera tester (Figur 1B , vänster panel). Däremot under loppet av 2 timmar av NMP uppreglerades 956 gener och 353 gener nedreglerades (Figur 1B, högra panelen). Vi bedömde sedan förändringar i uttrycket av grupper av gener inom en gemensam väg, och jämförde tiotals eller hundratals gener snarare än någon enskild gen, vilket ytterligare minskade effekten av biologisk interindividuell variation på analysen. Detta avslöjade förändringar i funktionellt viktiga vägar, där uttrycket av varje enskild gen inom den vägen inte ändrades med tillräcklig omfattning för att nå statistisk signifikans. Denna genuppsättningsanrikningsanalys (GSEA) visade att kylförvaring hade en betydande inverkan på ett antal metaboliska vägar (Figur 1C, vänster panel). I synnerhet var det en markant minskning av gener involverade i oxidativ fosforylering (OXPHOS), en nyckelväg som krävs för att generera ATP.19 Däremot var OXPHOS bland de vägar som signifikant uppreglerades under NMP (Figur 1C, högra panelen), med potentiella fördelar för cellviabilitet och återställande av cellulär homeostas. Dessutom inducerades ett antal vägar involverade i immun- eller inflammatoriska processer under NMP, med "TNF-signalering via NFkB" som visar den största ökningen. I enlighet med detta var TNF, såväl som IL1B och de neutrofilrekryterande kemokinerna CXCL8 (IL8) och CXCL2, bland de mest uppreglerade generna i 2-timmars NMP-biopsier (Figur 1D). Stränganalys av de 50 bästa uppreglerade generna avslöjade uppreglering av biokemiskt relaterade gener som var grupperade i fyra huvudnoder; IL8 och neutrofilrekryterande kemokiner, inflammasomassocierade gener, NFkB-signalering och transkriptionsreglering (Figur 1E). Observera att DBD- och DCD-njurar var transkriptionellt lika vid baslinjen (Figur S2C), och genvägarna som förändrades under NMP var liknande i DBD- och DCD-njurar (Figur S2D). Tillsammans visar vår analys att det under NMP finns ett ökat uttryck av gener som främjar genereringen av energi, med potentiellt fördelaktiga effekter för organet, men en samtidig induktion av pro-inflammatoriska gener, vilket kan vara skadligt.

Cistanche tubulosa extrakt: förbättra njurfunktionen

2.3. Inflammatoriska väggener i NMP-njurar associerade med förlängd fördröjd transplantatfunktion

För att koppla de transkriptionsförändringar som inträffar under kylförvaring och NMP till kliniska resultat, utförde vi RNA-Seq på biopsier tagna från 33 DCD-njurar som hade genomgått NMP som en del av en randomiserad klinisk prövning som för närvarande utvärderar dess effektivitet.17 Prover fanns tillgängliga på en undergrupp av njurar randomiserade till NMP-armen av studien som därefter transplanterades (tabell S3, figur S1). DGF är vanligare i DCD-njurar och definieras klassiskt som ett krav för dialys den första veckan efter transplantationen. Emellertid under den omedelbara posttransplantationsperioden får vissa patienter en enda dialysepisod för hyperkalemi, vilket inte nödvändigtvis återspeglar närvaron av signifikant akut tubulär nekros. Vi använde därför en modell som korrelerade genuttryck med tiden mellan transplantationskirurgi och den sista dialyssessionen (dvs. varaktigheten av DGF). Detta visade mer markerade transkriptionsförändringar i transplantationer som kräver dialys utöver de första 24 timmarna efter transplantation (Figur 2A), såväl som en signifikant positiv korrelation mellan uttrycket av gener för inflammatoriska vägar inklusive "TNFA-signalering via NFkB" och "inflammatoriskt svar"-vägar och längden av DGF, med en större anrikning av dessa vägar i njurar som upplevde mer förlängd DGF efter transplantation (Figur 2B). Omvänt korrelerade längden av DGF negativt med storleken på uttrycket av "OXPHOS"-väggener (Figur 2B). Sammantaget indikerar dessa data att efter NMP är njurar som har lägre uttryck av inflammatoriska väggener och högre uttryck av "OXPHOS"-väggener mindre mottagliga för förlängd DGF posttransplantation. Detta skulle stödja slutsatsen att de molekylära förändringarna som inträffar under NMP kan ha både fördelaktiga (induktion av OXPHOS-väggener) och skadliga (induktion av inflammatoriska väggener) effekter.

2.4. Urinproduktion och renalt blodflöde under NMP visar olika associationer med OXPHOS- och inflammatoriska väggener

Mängden urin som produceras under NMP är en av ett antal parametrar som ingår i kirurgiska kvalitetsbedömningspoäng som används för att vägleda beslut om organanvändning,15 men huruvida hög urinproduktion under NMP verkligen ger en god prognos för njuren och de underliggande molekylära vägarna aktiverade i njurar med hög urinproduktion är oklart. I totalt 10 njurar som genomgick NMP (NMP endast njurar, tabell S1 och S2, figur S1), observerade vi ett urval av urinutsläpp från 0 till 340 ml under 2-timmesperioden av perfusion (Figur 3A vänster panel). Att notera, när vi jämförde vägarna som förändrades under NMP i fem njurar i två oberoende experiment, fann vi att liknande vägar inducerades (Figur S3A) vilket bekräftar reproducerbarheten av vår experimentella design och användbarheten av att jämföra vägar snarare än enskilda gener. I biopsierna 2-timme efter perfusion, korrelerade uttrycket av 11 gener signifikant med den urinvolym som producerades under denna period. Dessa inkluderade värmechockproteiner (HSPs), HSPA1A, HSPA1B och HSPH1, som positivt korrelerade med ökad urinproduktion (Figur 3A högra panelen). Genuppsättningsanrikningsanalys visade att urinproduktion också positivt korrelerade med "TNF-signalering via NFkB"-väggenerna och negativt korrelerade med OXPHOS-gener i postperfusionsbiopsier (Figur 3B, S3C). På liknande sätt, i pre-perfusionsbiopsier, korrelerade OXPHOS negativt med urinproduktion i dessa njurar medan vägar associerade med immunaktivering inklusive "TNF-signalering via NFkB" och "allotransplantatavstötning" positivt korrelerade med urinproduktion, vilket tyder på att NMP hade liten effekt på dessa processer , eller på andra analyserade vägar, i njurar med hög urinproduktion (Figur 3B, S3C-D). Eftersom induktionen av gener för inflammatoriska vägar observerades i våra kliniska prover med förlängd DGF (Figur 2B), utmanar dessa data dogmen att hög urinproduktion förekommer i mer livskraftiga, "friska" njurar och antyder att dessa njurar faktiskt kan ha mer inflammatorisk potential, är mindre i stånd att generera energi och att denna inte väsentligt förändras under NMP.

Njurblodflödet under perfusion har också bedömts som en parameter som kan återspegla efterföljande transplantationsfunktion.15 I de 10 studerade njurarna varierade njurblodflödet vid 2 timmars perfusion från 14,1 till 168,8 ml/minut (Figur 3C vänstra panelen). I biopsierna 2-timme efter perfusion, korrelerade åtta gener signifikant positivt med ökande njurblodflöde (Figur 3C högra panelen), inklusive HSPA1L, men det fanns ingen direkt överlappning mellan denna genlista och de som korrelerade med urinproduktion (Figur 3A) ). Analys av anrikning av genuppsättningar visade att högt njurblodflöde korrelerade positivt med OXPHOS-gener i 0-timmarsbiopsier, men i motsats till de med högst urinproduktion hade perfusion en betydande inverkan, vilket resulterade i en negativ korrelation med "OXPHOS" väggener med 2 timmar (Figur 3D, Figur S4A-B). Njurblodflöden korrelerade negativt med ett antal immun- och inflammatoriska genvägar i både 0- och 2-timmesbiopsier (Figur 3D, Figur S4B), i motsats till urinproduktion (Figur 3B, Figur S3C). Tillsammans tyder dessa data på att njurblodflöde och urinproduktion kanske inte är likvärdiga indikatorer på en mer livsduglig njure, men att den förra kan mer troget identifiera ennjuremindre sannolikt att ha förlängd DGF.

fördelar och biverkningar av cistanche: antiinflammatorisk

2.5. Tillägg av en fålladsorberare till perfusionskretsen har ingen effekt på perfusionsparametrar men minskar signifikant inflammatoriskt genuttryck, inklusive NLRP3 och IL1B

Analyser avnjureperfusat har visat en avsevärd ökning av koncentrationen av pro-inflammatoriska cytokiner och kemokiner under loppet av hypotermisk och NMP.20,21 Dessa bioaktiva molekyler recirkulerar in i njuren, med potential att inducera ytterligare inflammation. Med tanke på att vår analys av transplanteradenjureprover indikerade att induktionen av TNF-beroende gener i NMP-njurar var associerad med DGF (Figur 2B), antog vi att avlägsnande av cytokiner och kemokiner från perfusionskretsen kan dämpa inflammatorisk geninduktion, med potentiella fördelaktiga effekter för njuren. Ett sådant tillvägagångssätt har visat viss effekt hos patienter med systemiskt inflammatoriskt svarssyndrom,22,23, och associerades med ökat njurblodflöde i svinnjurar som genomgick NMP.18 För att testa detta i mänskliga njurar tog vi ytterligare fem njurpar och utförde NMP i 4 timmar med biopsier tagna vid 0, 2 och 4 timmar (Figur S1). I varje fall tillsattes en cytosol-hem-adsorberare (HA) som tar bort molekyler med en molekylvikt på 10-50 kDa till perfusionskretsen för en njure inom varje par (NMP plus HA) (Figur 4A). Som förväntat resulterade tillägget av HA i lägre koncentrationer av en mängd olika cytokiner i perfusatet (Figur 4B) men hade ingen effekt på njurblodflödet, urinproduktion eller sammansättning, syreförbrukning och syrabashomeostas (Figur 4C, Tabell S4, S5). Under 4 timmars NMP hade således HA ingen inverkan på de perfusionsparametrar som för närvarande används kliniskt för att generera kvalitetsbedömningspoäng men hade en betydande effekt på genuttryck; Efter NMP uppreglerades generna 1794 och 4026 vid 2 respektive 4 timmar, inklusive TNF och IL6 (Figur 4D, E). men endast hälften av detta antal (n=898 och n=2606) ökades när HA var närvarande (Figur 4D, Figur S5A och B). Antalet nedreglerade gener reducerades också genom tillägg av HA (Figur 4D). Efter 4 timmars NMP var 46 gener signifikant uppreglerade och 181 nedreglerades med tillägg av HA (Figur 4F). Detta försvagade transkriptionella svar inkluderade NLRP3-inflammasomaktiveringsassocierade gener, såsom IL1B, NLRP3 och CASP1 (Figur 4G, Figur S4B) och några neutrofilrekryterande kemokiner (Figur S5C), tidigare associerade med njurskada i djurmodeller.24,25 Detta visar att lösliga mediatorer frigörs frånnjurerecirkulera och driva de novo uttryck av inflammatoriska gener i organet, men att detta kan lindras genom att de avlägsnas från perfusionskretsen.

FIGUR 4 Tillsats av en fålladsorberare till den normotermiska maskinperfusionskretsen har betydande effekter på cytokinnivån i perfusatet och transkriptomet men inte på fysikaliska parametrar som registrerats på riggen. Ett par mänskliga njurar togs från samma donator, en av paret genomgick standardnormotermisk maskinperfusion (NMP)-protokollet i 4 timmar och den andranjuregenomgick NMP med tillägg av en fålladsorberare till kretsen. Prover togs för RNA-Seq före perfusion (0 timmar), efter 2 timmar och vid slutet (4 timmar). B, Koncentration av nyckelcytokiner i perfusatet efter 4 timmars NMP. Linjen indikerar par av njurar. Cytokinmätningar normaliserades till totalt perfusatproteininnehåll. Angivet P-värde är från ett parat t-testtest för reduktion av cytokiner med tillsats av HA. C, Urinproduktion och renalt blodflöde (RBF) över perfusionens tidsförlopp. Greenline indikerar enbart NMP och orange med tillägg av fålladsorberare. D, Venn-diagram som visar antalet gener som uttrycks signifikant differentiellt när man jämför 2-hr- eller 4-hr-proverna med pre(0-}hr)-proverna. Röda diagram är uppreglerade gener och blåa nedreglerade. Skärningspunkten är de gener som uttrycks vördnadsfullt vid båda tidpunkterna i samma riktning. E, log2 normaliserade uttrycksvärden för de indikerade generna över perfusion från vävnadstranskriptomen, standardfelstaplar är indikerade. F, Vulkanplot för parvis jämförelse av enbart NMP med NMP plus HA vid 4 timmar. Rött indikerar differentiellt uttryckta gener med ett justerat P-värde<0.05. g,="" as="" for="">

behandla njursjukdomar cistanche extrakt

2.6. HA associerad med en minskning av en fördröjd transplantatfunktionsassocierad gensignatur

Genuppsättningsanrikningsanalys visade en signifikant minskning av "TNF-signalering via NFkB"-vägen i NMP plus HA-njurar jämfört med enbart NMP (Figur 5A-B). Noterbart minskade närvaron av HA inte bara inflammatoriskt genuttryck inomnjuremen också ökade OXPHOS- och fettsyrametabolismvägar, som båda bidrar till energigenerering (Figur 5A-B). Därför skulle förändringarna i genuttrycksvägar som inträffar med HA stödja slutsatsen att dess effekter är kliniskt fördelaktiga, eftersom det minskade "TNFA-signalering via NFkB"-väggener och ökade "OXPHOS"-väggener, som båda var associerade med en kortare varaktigheten av DGF (Figur 2B).

För att ytterligare utforska sambandet mellan transkriptionsförändringar i NMP och kliniska resultat, försökte vi kurera en gensignatur som finns i njurar med DGF. Vi identifierade de 100 positiva (UPP) och negativt (NER) reglerade generna (rankade efter log-faldig förändring) som korrelerade med längden på DGF i de 33 kliniska proverna (Figur 5C, Data S1). Vi fann en signifikant anrikning av gensignaturen associerad med ökad längd av DGF i prover med högre urinproduktion (Figur 5D), vilket tyder på att hög urinproduktion under NMP identifierar njurar med risk för mer förlängd DGF. Det fanns ingen statistiskt signifikant korrelation mellan DGF-signaturen och generna associerade med högre renalt blodflöde (Figur 5E). Vi utvärderade därefter om och hur tillägget av HA till NMP-kretsen påverkade uttrycket av DGF "UP" och "DOWN" gensignaturer. Anmärkningsvärt nog visade detta att uttrycket av gensignaturen associerad med ökad längd av DGF reducerades signifikant genom tillsats av HA, och signaturen associerad med minskad längd av DGF ökades signifikant genom tillsats av HA (Figur 5F).

Sammantaget tyder de transkriptionsförändringar vi har identifierat på att NMP har potentiella fördelar jämfört med kylförvaring när det gäller dess effekter på energigenerering i njuren. Men under perfusion frigörs vissa bioaktiva molekyler från njuren till perfusionskretsen, vilket genererar en förstärkningsslinga som driver inflammation när de kommer in i njuren igen. Avlägsnande av dessa molekyler avbryter denna loop och kan vara användbart för att minska inflammation och öka energigenereringen, vilket ytterligare förbättrar de fördelaktiga effekterna av NMP och minskar känsligheten för DGF (Figur 6).

FIGUR 5 Tillsats av skinka-adsorbenten reducerar en DGF-associerad gensignatur. En GSEA-analys av effekten av tillsatsen av HA till transkriptomet efter 4 timmars NMP mot kännetecken för geneset. Endast signifikanta vägar plottas. Röda prickar indikerar positiv anrikning och blå negativ, storleken på punkten är omvänt korrelerad med FDR q-värdet och positionen indikerar den normaliserade anrikningspoängen (NES). B, Anrikningsdiagram från GSEA för nyckelvägar från Hallmark-databasen för jämförelsen från A. Linjen anger det löpande anrikningsresultatet och fioldiagrammet anger fördelningen av genernas medlemsgener i den rankade genlistan som används i varje analys. C, Värmekarta över de fyra största positiva (UPP) och negativa (DOWN) korrelationerna med längden på DGF och används som en del av genuttryckssignaturen för DGF. Fullständig DGF-signatur ges i kompletterande data. DF, DGF-associerad gensignatur användes med GSEA för att undersöka uttrycket av signaturen i korrelationen av 2-hr urinproduktion med 2-hr transkriptom (D), korrelation av 2-hr RBF med 2-h transkriptom (E), och effekten av tillsats av HA på transkriptomen efter 4 timmar (F). Tomter som för A

FIGUR 6 Grafisk sammanfattning. A, Under kylförvaring sker en global minskning av transkriptionen. Under NMP uppregleras uttrycket av gener i ett antal vägar inklusive oxidativ fosforylering (OXPHOS) och inflammatoriska väggener såsom TNF, IL8 och NFkB. B vänster panel, Under NMP frigörs inflammatoriska mediatorer (gula cirklar) frånnjurei perfusionslösningen. De recirkulerar och stimulerar pro-inflammatorisk gentranskription i njuren och är associerade med en minskning av generna för produktion av energivägar, vilket minskar ATP. Höger panel, Närvaron av fålladsorberaren (HA) bryter denna inflammatoriska amplifieringsslinga

Cistanche ört som förbättrar njurfunktionen

3. DISKUSSION

Våra data visar att kylförvaring är effektiv för att begränsa betydande förändringar i genuttryck. Detta är i linje med gnagarmodeller, där njurar lagrade i upp till 18 timmar i kylförvaring visade liten förändring i uttrycket av pro-inflammatoriska cytokiner, inklusive IL1 , TNF och IL6.26 Vår användning av opartisk, global transkriptionell profilering snarare än mätningen av ett litet antal kandidatgener gjorde det möjligt för oss att analysera uttrycket av grupper av gener som finns inom specifika vägar. Detta avslöjade en signifikant minskning av uttrycket av OXPHOS- och glykolysvägsgener i kyllagrade njurar, vilket potentiellt minskade kapaciteten hos dessa njurar att generera ATP, i linje med en tidigare studie som visade minskad ATP i kyllagrade mänskliga njurar.27 Ett antal av pro-inflammatoriska vägar nedreglerades också under kylförvaring, inklusive TNF-aktivering via NFkB och reaktiva syrespeciesvägar som kan vara potentiellt fördelaktiga. Det kan dock vara så att kylförvaring bara sätter ett tillfälligt grepp om dessa vägar och att efter reperfusion i mottagaren skulle liknande förändringar i inflammatoriskt genuttryck som observerats i NMP inträffa.

NMP hade motsatt effekt mot kyllagring på OXPHOS- och glykolysväggener, vilket ökade deras uttryck, med potential att öka den cellulära kapaciteten att generera ATP och återställa homeostas. Notera att hypotermisk syresatt perfusion av mänskliga njurar också har visat sig öka ATP-nivåerna jämfört med kylförvaring 27, därför kan återställandet av syresättning vara den huvudsakliga stimulansen för dessa processer snarare än normotermi. Icke desto mindre kommer dessa förändringar sannolikt att vara fördelaktiga för organet med tanke på vår observation av en negativ korrelation mellan ökat uttryck av OXPHOS-väggener och förlängd DGF.

En färsk artikel av Hameed et al28 utförde också en transkriptomisk analys av NMP i tre njurar som genomgick NMP. Tyvärr gjorde författarna inte sina data offentligt tillgängliga, så en djupgående jämförelse med vår datauppsättning är inte möjlig. Men deras manuskript indikerade induktion av immunsvarsrelaterade gener under NMP, inklusive IL1B, CXCL2 och TNF, vilket är i överensstämmelse med våra resultat.

I vår analys av njurar som genomgår NMP i samband med en klinisk prövning, korrelerade vi genuttryckssignaturer med en längd av DGF snarare än DGF-incidens (definierad som ett behov av dialys under den första veckan efter transplantation). Noterbart var att njurar med en varaktighet av DGF på 1 dag eller mindre var mycket transkriptionsmässigt lika de utan DGF, vilket sannolikt återspeglar dialysbehov på grund av perioperativt associerad hyperkalemi snarare än bona fide DGF. Vi fann att en längre DGF var associerad med högre uttryck av TNFA-signalering via NFkB-väggener och lägre uttryck av gener associerade med OXPHOS. Dessa data tyder på att njurar med ökad OXPHOS och minskad immunsignalering kan ha bättre potential som givares njurar, men denna slutsats kräver validering i en större prospektiv studie.

Vi bedömde också de molekylära processer som korrelerar med urinproduktion och njurblod under NMP. Dessa parametrar har tidigare använts, tillsammans med ett antal andra mått, för att generera en kvalitetsbedömning av perfunderade njurar. Höga värden på urinproduktion och njurblodflöde har ansetts återspegla ett mer livskraftigt transplantat.15 Våra data visar att vägar som korrelerar med hög urinproduktion och högt njurblodflöde skiljer sig åt, och i själva verket visar dessa parametrar polära motsatta associationer med inflammatoriska vägar . Hög urinproduktion var associerad med högre uttryck av immunvägsgener medan högt njurblodflöde var negativt korrelerat med dessa vägar. Vi fann också att DGF-gensignaturen vi genererade var berikad i njurar med hög urinproduktion under NMP, vilket tyder på att denna parameter kan identifiera njurar med risk för en längre DGF, i motsats till den nuvarande dogmen. En potentiell förklaring är att en mycket hög urinproduktion speglar njurar med mer tubulära skador som saknar förmågan att koncentrera urinen. Således kan det finnas en "Goldilocks-effekt" med avseende på urinproduktion, där njurar med låg/liten urinproduktion är de med betydande abnormiteter i genereringen av filtrat, de med mycket hög urinproduktion har betydande tubulära skador som utesluter urinkoncentration. Denna hypotes skulle behöva testas i ett större antal njurar som sedan transplanterades.

Under 4 timmars NMP förekom en induktion av inflammatoriska gener i njuren. Det är dock värt att notera att nuvarande klinisk praxis endast omfattar 1 timmes NMP, och denna effekt kanske inte är uppenbar över en kortare perfusionstid. Längre perfusion kan dock ha fördelar när det gäller återställande av syresättning och energigenerering, och i vårt experiment kan de negativa effekterna av immungeninduktion väsentligt förnekas genom införandet av en cytosol HA till perfusionskretsen. Dessa data indikerar att inflammatoriska mediatorer som genereras av njuren under loppet av NMP kommer in i perfusionskretsen och kan förvärra steril inflammation och att deras avlägsnande förbättrar induktionen av inflammationsvägsgener som observeras under NMP. Viktigt är att vi visade att tillägget av HA påverkar uttrycket av gener som är förknippade med sämre resultat kliniskt. Vår DGF-gensignatur härleddes från prover som genomgick NMP som en del av en klinisk prövning som utvärderade dess effektivitet, vilket gör att vi på ett robust sätt kan koppla de förändringar vi observerade i våra parade njurstudier med kliniska slutpunkter i njurar som genomgår transplantationer. Emellertid kommer dess tillämpning i samband med en klinisk prövning att behövas för att definitivt bevisa användbarheten av dess tillämpning på njurar före transplantation. HA är ospecifik och kan ta bort molekyler som är användbara, förutom de som är skadliga för organet. Vi fann att nettoeffekten av HA på njurtranskriptomet verkade fördelaktigt, men det kan vara så att en förfining för att specifikt ta bort bevisade, skadliga mediatorer kan vara ännu effektivare.

Njurparen vi använde var från samma individ och var därför genetiskt identiska och hade upplevt en liknande miljö under hela donatorns liv. Vi bekräftade att deras tid 0 transkriptom var extremt lika (Figur S2 A, B). Dessa biopsier tar dock prov på en liten del av njuren, och njurpar kan vara asymmetriskt påverkade av patologi, till exempel cystor eller småkärlsjukdom. En ytterligare varning är att alla njurar som används i interventionsexperimenten som presenteras här avvisades för transplantation och några representerar transplanterade organ i den nedre delen av kvalitetsspektrat. Ändå observerade vi mycket reproducerbara resultat när vi jämförde genvägar i grupper om fem njurar. Vi kunde också visa att njurar från DCD och DBD hade ett liknande svar på perfusion. Genom att kombinera detta med vår kurerade post-NMP DGF-signatur kunde vi förutsäga potentiella kliniska fördelar. Detta experimentella tillvägagångssätt skulle kunna användas som ett prekliniskt verktyg för att screena framtida interventioner för potentiell terapeutisk effekt för att möjliggöra ett rationellt urval av kandidatinterventioner för kliniska prövningar.

Sammanfattningsvis ger vår studie den första globala transkriptionsprofilen av mänskliga njurar som genomgår NMP, löser de olika molekylära vägarna som aktiveras i NMP jämfört med kylförvaring, och visar att de skadliga effekterna av bioaktiva molekyler som produceras eller frigörs från njuren under NMP kan vändas genom tillägg av en HA. Dessutom reducerade denna intervention uttrycket av gener associerade med förlängd DGF, vilket ger ett starkt mekanistiskt skäl för att tillämpa en sådan intervention i en framtida klinisk prövning. Våra data har också implikationer för perfusionsstrategier bortom njurarna, inklusive vid lever- och lungtransplantation, vilket tyder på att avlägsnandet av bioaktiva molekyler från perfusater bör undersökas i dessa sammanhang där NMP används alltmer. Slutligen belyser vår studie användbarheten av global transkriptionsprofilering i parnjurarför bedömning av nya ingrepp på perfunderade organ; transkriptionsförändringar föregår förändringar i proteinöverflöd (används traditionellt som biomarkörer förnjureskada) och tiotusentals gentranskript kan lätt mätas. Således har RNA-mätning potential att ge en tidig, känslig avläsning av den cellulära funktionen hos mänskliga organ som hämtas för transplantation som kan tillämpas på framtida studier.

TACK

Författarna tackar alla organdonatorer och deras familjer. Clatworthy Lab är tacksamt för de centrala faciliteterna som tillhandahålls av MRC Laboratory of Molecular Biology. Detta arbete utfördes med hjälp av resurser från Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3) som drivs av University of Cambridge Research Computing Service, tillhandahållna av Dell EMC och Intel med hjälp av Tier-2-finansiering från Engineering and Physical Sciences Research Council (kapitalbidrag EP/P020259/1), och DiRAC-finansiering från Science and Technology Facilities Council (www. Dirac. ac. Storbritannien).

AVSLÖJANDE

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja som beskrivs av American Journal of Transplantation.

FÖRFATTARBIDRAG

JRF, SH, MLN och MRC designade studien och tolkade data. JRF, SH, TM, CJW, AF och TCD utförde experimenten. JRF, SH och MRC skapade figurer och tabeller. MRC skrev huvudmanuskriptet. JRF och SH skapade metoderna och figurlegenderna, JRF, SH och MLN redigerade manuskriptet.

Cistanche fördel: förbättra njurfunktionen

Referenser:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. UK Renal Registry 19th Annual Report: Chapter 5 Survival and Causes of Death in UK Adult Patients on Renal Replacement Therapy in 2015: National and Centre-specific Analyses. Nephron. 2017;137(1):117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J, et al. Analys av faktorer som påverkar resultatet efter transplantation av njurar donerade efter hjärtdöd i Storbritannien: en kohortstudie. Lansett. 2010;376(9749):1303–1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Effekt av donatorålder och kylförvaringstid på resultatet hos mottagare av njurar som donerats efter cirkulationsdöd i Storbritannien: en kohortstudie. Lansett. 2013;381(9868):727–734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Inflammatoriska celler vid ischemisk akut njursvikt.NjureInt. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H, Rock KL. Hur döende celler varnar immunförsvaret för fara. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):279–289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Immunterapi för akutnjureskada. Immunterapi. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, et al. Postoperativa biomarkörer förutsäger akutnjureskada och dåliga resultat efter hjärtkirurgi hos vuxna. J Am Soc Nephrol. 2011;22(9):1748–1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, et al. IL-18 och urin-NGAL förutsäger dialys och återhämtning av transplantat efternjuretransplantation. J Am Soc Nephrol. 2010;21(1):189–197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Biomarkörer för försenat transplantat fungerar som en form av akutnjureskada injuretransplantation. Sci Rep. 2015;5:11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Först njurtransplantation hos människa efter ex vivo normoterm perfusion. Transplantation. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Ex-vivo normoterm perfusion vid njurtransplantation: dåtid, nutid och framtid. Curr Opin Organtransplantation. 2016;21(3):301–307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, et al. En observationsstudie av donator Ex Vivo lungperfusion vid lungtransplantation i Storbritannien: DEVELOP-UK. Health Technol Assess. 2016;20(85):1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M, et al. Standard donatorlungupphandling med normotermisk ex vivo lungperfusion: En prospektiv randomiserad klinisk prövning. J Hjärtlungtransplantation. 2017;36(7):744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, et al. En randomiserad studie av normotermisk konservering vid levertransplantation. Natur. 2018;557(7703):50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, et al. Användning av Ex Vivo Normotermic Perfusion för kvalitetsbedömning av kasserade humana donatorpankreaser. Am J Transplantation. 2015;15(9):2475–2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Framgångsrik transplantation av mänskliga njurar som anses otransplanterade men återupplivade av Ex Vivo Normotermic Machine Perfusion. Am J Transplantation. 2016;16(11):3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Protokoll för en randomiserad kontrollerad, öppen studie av ex vivo normoterm perfusion kontra statisk kylförvaring i donation efter njurtransplantation med cirkulationsdöd. BMJ öppet. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Hemoadsorption minskar det inflammatoriska svaret och förbättrar blodflödet under ex vivo renal perfusion i en experimentell modell. J Transl Med. 2017;15(1):216.
19. Krebs HA. Historien om trikarboxylsyracykeln. Perspect Biol Med. 1970;14(1):154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Värdet av maskinperfusionsbiomarkörkoncentration i DCDnjuretransplantationer. Transplantation. 2013;95(4):603–610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS, et al. Proteiner i konserveringsvätska som prediktorer för fördröjd graftfunktion i njurar från donatorer efter cirkulationsdöd. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(5):817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hemoadsorption av CytoSorb i septiska patienter: en fallserie. Crit Care. 2017;21(1):74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Effekt av avlägsnande av extrakorporealt cytokin på vaskulär barriärfunktion hos en patient med septisk chock. J Intensivvård. 2017;5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL, et al. IL-17 producerat av neutrofiler reglerar IFN-gamma-medierad neutrofil migration hos musnjureischemi-reperfusionsskada. J Clin Invest. 2010;120(1):331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K, et al. Fördelaktig effekt av neutrofil elastashämmare på renal varm ischemi-reperfusionsskada hos råtta. Transplantation Proc. 2006;38(7):2201–2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP, et al. En jämförelse av inflammatoriska, cytoprotektiva och skadegenexpressionsprofiler i njurar från hjärndöd och hjärtdödsgivare. Transplantation. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, et al. Strategier för att återställa nivån av adenosintrifosfat (ATP) efter mer än 20 timmar av kall ischemi i mänsklig marginalNjureGrafts. Ann Transplant. 2018;23:34–44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E, et al. Kort Normotermisk maskinperfusion föryngrar kasserade mänskliga njurar. Transplantation direkt. 2019;5(11):e502.