Bestämning av echinakosid i vatten extrakt av Cistanche Herba genom HPLC

Abstrakt:

Mål En HPLC-metod etablerades förbestämning av echinakosidivattenextrakt av Cistancheherba.

Metoder Echinakosid bestämdes med HPLC. Separationen utfördes på Inertsil ODS-SP C18-kolonnen med en mobil fas bestående av acetonitril(A) och 0.4% fosforsyralösning (B), genom gradienteluering. Detektionsvåglängden sattes till 333 nm, och kolonntemperaturen var 30 grader. Flödeshastigheten var 1,0 mL·min-1 och injektionsvolymen var 10 μL. Resultat Den linjära relationen mellan echinakosid inom koncentrationsintervallet 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 var bra(r=0.999 8). Återvinningarna var 94,59 %-105,31 % (RSD= 2,93 %,n=9). Innehållet av echinakosid i vattenextrakt av Cistanche herba var 15.527,7.347,12.267 mg·g-1. Slutsats Den etablerade HPLC-metoden med god repeterbarhet är exakt, enkel och genomförbar. Den är lämplig för bestämning av echinakosid i vattenextraktet av Cistanche herba.

Nyckelord:HPLC;vattenextrakt av Cistanche herba; echinakosid; fastställande av innehåll

Cistanche deserticola är en stärkande traditionell kinesisk medicin som vanligtvis används i klinisk praxis och är känd som "ökenginseng" [1]. Cistanche deserticola som registrerades i 2015 års upplaga av den kinesiska farmakopén är den torkade köttiga stjälken med fjällande blad av Cistanche deserticola YC Ma eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Det är varmt, sött och salt och återgår till njurens och tjocktarmens meridianer. Det har effekterna av att ge näring till njurens yang, fylla på essens och blod och återfukta tarmarna och laxermedel [2]. "Shen Nongs Materia Medica", säger att den kan "tonifiera mitten, ge näring till de fem inre organen, stärka yin och ge näring till essensen". Cistanche deserticola innehåller huvudsakligen fenyletanoidglykosider, iridoider och deras glykosider, lignaner och deras glykosider, polysackarider, esterföreningar och alkaloider [3]. Fenyletanolglykosider är de viktigaste aktiva ingredienserna i Cistanche deserticola. Bland dem är echinacoside och verbascoside listade i Cistanche deserticola i den kinesiska farmakopén.

Vägledande komponenter för identifiering och innehållsbestämning. Farmakologiska studier [4] visar att Cistanche deserticola har olika farmakologiska effekter såsom laxermedel, leverskydd, anti-osteoporos, antioxidant, anti-aging och anti-trötthet. Cistanche deserticola vattenhaltigt extrakt kan främja uttrycket av benmorfogenetisk protein 2-gen i råttas osteoblaster, tartratresistent surt fosfatas, osteokalcin i serumet från ovarieektomiserade möss och Smad1, mad5 gener, transformerande tillväxtfaktor, etc. i benmärgen. , har anti-osteoporoseffekter [5-6].

Echinacea kan främja proliferationen av osteoblaster och främja differentieringen av benmärgsmesenkymala stamceller odlade in vitro till osteoblaster [7-9]. Under senare år har det förekommit många forskningsrapporter om innehållsbestämningen av echinakosid och verbascosid i Cistanche deserticola etanolextrakt och dess sammansatta preparat [10-12], men det finns få rapporter om innehållsbestämningen av indexkomponenter i Cistanche deserticola vattenhaltigt extrakt. I denna studie användes högpresterande vätskekromatografi (HPLC) för att bestämma innehållet av echinaceaside i det vattenhaltiga extraktet av Cistanche deserticola.

1 material

1.1 Instrument

LC-20AT högpresterande vätskekromatografi, SPD-20A-detektor, SIL-20A autosampler, CTO-10ASvp-kolonnugn, arbetsstation för LC-vätskekromatografi, Shimadzu Corporation of Japan; MES125P-OCE-DU elektronisk analytisk våg, Sartorius Company, Tyskland; SHZ-D (Ⅲ) multifunktions vakuumpump för cirkulerande vatten, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; RC2B SO25 roterande förångare kylcirkulationssystem, RV 10 D S96 rotationsförångare, IKA Company, Tyskland; DK-S26

Elektriskt vattenbad med konstant temperatur, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; UPR-serien ultrarent vattenmaskin, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Medicinska material och reagenser

Medicinskt material för Cistanche deserticola köptes från Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., batchnummer: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, den främsta traditionella kinesiska farmaceuten vid Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine som den torkade köttiga stjälken med fjällande blad av Cistanche deserticola YCMa. Provet förvaras i Drug Testing Room på det tredje anslutna sjukhuset vid Guangzhou University of Chinese Medicine; Echinacea Glycoside referensämne, innehåll 89,7 %, China Institute of Food and Drug Control, batchnummer: 111670-

201706; acetonitril är kromatografiskt ren (Merck, Tyskland); metanol och fosforsyra är analytiskt rena (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); vatten är ultrarent vatten.

2 Metoder och resultat

2.1 Beredning av vattenextrakt av Cistanche deserticola

Ta det grova pulvret av Cistanche deserticola läkemedel, tillsätt 10 gånger mängden destillerat vatten, värm och återlopp för extraktion två gånger, 1 timme varje gång, filtrera, kombinera filtratet och koncentrera filtratet med en rotationsindunstare till ett råläkemedelsinnehåll på 0,100 g·mL-1 och förvara det vid 4 grader för senare användning.

2.2 Kromatografiska förhållanden och systemlämplighet

Kromatografisk kolonn: Inertsil ODS SP C18 kolumn (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fas: acetonitril (A)-0,4 % fosforsyralösning (B), gradienteluering: 0 ~ 5 min, 17 %

A; 5 ~ 25 min, 20% A; 25 ~ 30 min, 17% A; detektionsvåglängd: 333 nm; kolonntemperatur: 30 grader; flödeshastighet: 1,0 mL·min-1;

Injektionsvolym: 10 μL. Under dessa kromatografiska förhållanden är separationen mellan echinakosid och angränsande komponenttoppar större än 1,5, och antalet teoretiska plattor baserat på echinaceasidetoppen bör inte vara mindre än 4,000. Kromatogrammet visas i figur 1.

2.3 Beredning av lösning

2.3.1 Referenssubstanslösning Väg en lämplig mängd echinacosid-referensämne, väg den noggrant, placera den i en 10 ml mätkolv, tillsätt metanol för att lösa upp den och förbered en referenssubstanslösning innehållande 898.794 ug echinaceaside per ml, 4 grader Spara för senare användning.

2.3.2 Testlösning

Mät noggrant upp 2.0 mL vattenhaltigt Cistanche deserticola-extrakt, indunsta till torrhet i ett vattenbad, tillsätt metanol för att lösas upp, späd till volym i en 10 mL mätkolv, skaka väl och filtrera med ett 0,22 μm mikroporöst membran för att erhålla.

2.4 Undersökning av linjärt samband

Mät exakt {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, 3.00 mL av referenslösningen under punkt 2.3.1, placera den i en 5 mL mätkolv, tillsätt metanol för att fylla på volymen och skaka väl för att erhålla en gradientkoncentration på 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 referenslösning, filtrerad genom 0,22 μm mikroporöst membran. Mät enligt de kromatografiska förhållandena under 2.2 och registrera topparean. Utför linjär regression med masskoncentrationen av referensämnet som abskissan (X, ug·mL-1) och topparean som ordinatan (Y), och regressionsekvationen erhålls: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Resultaten visar att echinacea har ett bra linjärt samband inom koncentrationsintervallet 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Precisionstest

Ta 539.276 4 ug ·mL- 1 referenslösning, injicera och mät 6 gånger kontinuerligt enligt de kromatografiska förhållandena under 2.2, och registrera topparean. Resultaten visade att RSD för echinacoside-topparean var 1,81 %, vilket tyder på god instrumentprecision.

2.6 Stabilitetstest

Mät exakt upp 2.0 mL vattenhaltigt Cistanche deserticola-extrakt, indunsta till torrhet i ett vattenbad, tillsätt metanol för att lösas upp, späd till en 10 mL mätkolv, skaka väl, filtrera med en {{ 7}}.22 μm mikroporöst membran, följ de kromatografiska förhållandena under punkt 2.2 och placera vid 0 respektive 2. , 4, 8, 12, 24 timmars injektionsmätning, registrera topparean. Resultaten visade att RSD för echinakosidtopparean var 1,16 %, vilket indikerar att testlösningen hade god stabilitet inom 24 timmar.

2.7 Repeterbarhetstest

Mät exakt 2,0 mL Cistanche deserticola-vattenextrakt och förbered 6 testlösningar parallellt enligt metoden under 2.3.2. Injicera prover för mätning enligt de kromatografiska förhållandena under 2.2 och registrera topparean. Resultaten visade att RSD förechinakosidmasskoncentrationen var 1,28 %, vilket tyder på god repeterbarhet hos metoden.

2.8 Provåtervinningstest

Mät noggrant upp 9 portioner av 1,0 mL Cistanche deserticola-vattenextrakt, tillsätt 0.8, 1.0 och 1,2 mL referenslösning (1,552 mg·mL{{11 }}), indunsta till torrhet i ett vattenbad, tillsätt metanol för att lösa upp och justera till en 10 ml mätkolv; Skaka väl och filtrera genom ett 0,22 μm mikroporöst membran för att förbereda testlösningar med hög, medium och låg koncentration. Förbered 3 kopior av varje koncentration parallellt. Mät enligt de kromatografiska förhållandena under 2.2. Registrera topparean och beräkna provåtervinningen. Hastighet. Resultaten visas i tabell 1.

2.9 Bestämning av provinnehåll

Mät noggrant upp 3 portioner av 2,0 ml Cistanche deserticola vattenhaltigt extrakt, indunsta till torrhet i ett vattenbad, tillsätt metanol för att lösas upp, späd till en 10 ml mätkolv, skaka väl, filtrera med ett 0,22 μm mikroporöst membran och mät enligt de kromatografiska förhållandena under 2.2. Registrera topparean och beräkna echinaceaside-innehållet. Resultaten visas i tabell 2.

Tabell 1 Resultat av återvinningstester av echinakosid

Tabell 2 Resultat av innehållsbestämning av echinakosid i vattenextrakt av Cistanche herba