Bestämning av sex fenyletanoidglykosider i Cistanche Tubulosa och Cistanche Deserticola av QAMS

MA Xue-qin, DONG Yang-hong, GUO Qin, DING Hua (Apoteksavdelningen, Nyckellaboratorium för Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Engineering and Technology Ｒforskningscentrum för modernisering av Hui Medicine, Ningxia Medical University, Yingchuan, Ningxia 750004, Kina)

Abstrakt: Syfte Att etablera en HPLC-metod för samtidig bestämning av 6 föreningar inklusive echinacosid, cistanosid C, cistanosid A, acteosid, 2＇－ acetylacteosid och 6＇－ acetylacteosid i Cistanche tubulosa och Cistanche deserticola genom kvantitativ analys av en enda －-komponent av multi-markör. (QAMS) . Metoder Genom att använda echinacosid som intern referens fastställdes den relativa korrektionsfaktorn (ＲCF) för cistanosid C, cistanosid A, acteosid, 2＇－ acetylacteosid och 6＇－ acetylacteosid, och ovanstående 6 fenyletanoide glykosider beståndsdelar och jämförda beståndsdelar av QAMS standardkurvmetod, respektive. Ｒresultat De relativa korrelationsfaktorerna för akteosid, cistanosid C, cistanosid A, 2＇ － acetylakteosid och 6＇－ acetylakteosid beräknades med metoder validerade som 1. 008,1． 871,0． 809,0． 611 och 0. 603, respektive. Bestämningsresultaten jämfördes med de data som erhölls med standardkurvmetoden som återspeglade att den goda reproducerbarheten av de relativa korrelationsfaktorerna och ingen signifikant skillnad i analysresultat observerades mellan den externa standardmetoden och QAMS-metoden. Slutsats Metoden är enkel och tillförlitlig, som lätt kan användas för att samtidigt särskilja och bestämma innehållet av flera bioaktiva beståndsdelar i Cistanche tubulosa och Cistanche deserticola, samt deras kvalitetskontroll.

Nyckelord: Cistanche tubulosa; Cistanche deserticola; Fenyletanoidglykosider; QAMS; Kvalitetskontroll

Cistanche deserticola

Cistanche deserticola YCMa eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wish, traditionell kinesisk medicin för tonifiering av njuren, finns inspelad i 2015 års upplaga av den kinesiska farmakopén. Det är en saftig stam av släktet Cistanche i familjen Lewandaceae, huvudsakligen distribuerad i Inre Mongoliet, Ningxia, Gansu, Qinghai och Xinjiang. Cistanche deserticola och Tubular Cistanche deserticola har extremt högt medicinskt värde. De kommer in i njurarna och tjocktarmens meridianer. Compendium of Materia Medica skriver att Cistanche deserticola "är ett närande men inte allvarligt ämne, så det kallas Cistanche deserticola" och "det är varmt men kan fukta, fylla på men inte torrt, smidigt men inte diarré".

Cstanche deserticola

Det har effekterna att tonifiera njurens yang, gynna essens och blod, fukta tarmarna och göra avföring. Traditionellt används det för njure yang-brist, brist på essens och blod, impotens, infertilitet, ömhet i midja och knän, svaghet i muskler och ben och förstoppning på grund av torr tarm. Det är den mest använda tonifierande njuryang-medicinen i historien. Modern farmakologisk forskning visar att Cistanche deserticola har många effekter som att förbättra sexuell funktion, anti-aging, förbättra inlärnings- och minnesförmåga, anti-Alzheimers sjukdom, avföring etc. Det används flitigt i kliniska recept av kinesisk medicin, traditionella kinesiska patentläkemedel , och enkla preparat och hälsovårdsprodukter [2-5].

Cistanche deserticola-effekt - tonifierande njure

Klicka här för att se produkter från Cistanche for Kidney disease

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

De viktigaste kemiska komponenterna i Cistanche deserticola är fenyletanoidglykosider, iridoider och deras glykosider, lignaner och polysackarider [6]. Moderna farmakologiska studier har visat att fenyletanoidglykosider är de viktigaste aktiva substanserna i Cistanche deserticola och har uppenbara effekter mot Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, myokardischemi och andra effekter. [7].

Huvudkemiska beståndsdelar i Cistanche deserticola

För närvarande finns det många metoder för att kontrollera kvaliteten på effektiva ingredienser i Cistanche deserticola. Farmakopén har etablerat metoder för innehållsbestämning av echinacoside och poolside i Cistanche deserticola, vilket är svårt att heltäckande återspegla och kontrollera kvaliteten på Cistanche deserticola. Under de senaste åren, även om det har förekommit rapporter som använder HPLC för att samtidigt bestämma innehållet av fyra fenyletanoidglykosider i Cistanche deserticolamor, krävs flera referensmaterial, vilket ökar experimentkostnaden och applikationen. Det har dock inte funnits några rapporter om den kvantitativa bestämningen av sex fenyletanoidglykosider i Cistanche deserticola, liksom metoden för att bestämma innehållet av Cistanche deserticola med en standard och flera analyser. Det här experimentet etablerade en kvantitativ analys av multikomponenter med en enda tillverkare (QAMS) metod för samtidig bestämning av sex aktiva komponenter i Cistanche deserticola, inklusive echinakosid, antocyanin, glykosid C, glykosid A, 2-acetylantocyanin och {{ 1}}acetylantocyanin, med ett referensämne av echinakosid som referens. Samtidigt genomförde uppsatsen en jämförande studie av innehållet av de sex komponenterna som nämns ovan i två medicinska örter, Cistanche deserticola och Cistanche tubulosa, för att undersöka skillnaderna i de effektiva komponenterna i Cistanche deserticola från olika källor, och för att tillhandahålla experimentella data för kvalitetskontroll av Cistanche deserticola.

1 Material och instrument

Agilent 1260 högpresterande vätskekromatograf; Shimadzu UV-2550 UV-spektrofotometer, Japan; Shanghai Jinpeng FW100 Kvarn för traditionell kinesisk medicin; KQ-500E ultraljudsrengörare (Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); Eppendorfpipett (Tyskland); AL104 Analytisk balans (Mettler Toledo Instrument Co., Ltd.); Destillerat vatten; Alla andra reagens är analytiskt rena. Echinacetin (batchnummer: 111670-200503) från China Institute for the Control of Biological Products; Maorui flower glycoside (batchnummer: Must-12030806, China Institute for the Control of Biological Products); Cistanche glykosid C, Cistanche glykosid A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside är alla egentillverkade i laboratoriet (identifierade av NMR- och MS-spektra), med en HPLC-renhet på över 95 procent; Desert cistanche deserticola YCMa tillhandahålls av Ningxia Yongning cistanche planteringsbas, och den tubulära cistanche tubulosa (Schenk) Wight tillhandahålls av Ningxia Mingde Herbal Tablets Co., Ltd. Ovanstående medicinska material har identifierats av docent Dong Lin i Ningxia College Pharmacy Undervisning och Forskning Office. Metanol, acetonitril (kromatografiskt ren, TEDIA, USA); Wahaha rent vatten; Alla andra reagens är analytiskt rena.

Fenyletanolglykosid är den huvudsakliga aktiva komponenten i Cistanche deserticola

2 Metoder och resultat

2.1 Metodgranskning av ett test och flera utvärderingar

2.1.1 Beredning av referenslösning

Ta en lämplig mängd torkade till konstant viktkontrollprover av echinakosid, poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, {{0}}acetyl poolside och 6-acetyl poolside, väg dem noggrant och tillsätt metanol för att framställa en blandad kontrolllösning med koncentrationer av 0.027, 0.{{10}}27, 0,008, 0,014, 0,022 och 0,007 mg · ml-1, respektive.

2.1.2 Beredning av testlösning

Ta cirka 4,0 g medicinskt pulver (80 mesh sikt) från Desert Cistanche deserticola respektive Tubular Cistanche deserticola, väg dem noggrant, tillsätt 50 ml metanollösning för ultraljudsextraktion i 40 minuter, kyl ner dem, tillsätt metanol för att kompensera för den förlorade vikten, filtrera dem separat, ta 1 ml av det efterföljande filtratet, späd 20 gånger och erhåll.

2.1.3 Kromatografiska förhållanden

Agilent 1260 vätskekromatografisystem; Kromatografikolonn TSK GEL C18-kolonn (4,6 id × 250 mm; fem μm); Gradienteluering med acetonitril (B) -0,5 procent ättiksyra vatten (A): 0-10 minuter, 83 procent -80 procent A; 10 – 30 min, 80 procent – ​​75 procent A; 30 – 40 min, 75 procent – ​​70 procent A; Flödeshastighet: 1,0 ml · min-1; Detektionsvåglängd 333 nm; Injektionsvolym: 5 μl; Testning av rumstemperatur. Under ovanstående kromatografiska förhållanden visas kromatogrammen för det blandade referensämnet och testlösningen i figurerna 1-3.

1. Echinacetin; 2. Cistanche-glykosid A; 3. Maorui blomma glykosid; 4. Cistanche-glykosid C; 5.2- Acetylpilosid; 6.6- Acetylpilosid

Figur 1 HPLC-kromatogram av blandad referenslösning

1. Echinacetin; 2. Cistanche-glykosid A; 3. Maorui blomma glykosid; 4. Cistanche-glykosid C; 5.2- Acetylpilosid; 6.6- Acetylpilosid

Figur 2 HPLC-kromatogram av Desert Cistanche-testlösning

1. Echinacetin; 2. Cistanche-glykosid A; 3. Maorui blomma glykosid; 4. Cistanche-glykosid C;5.2- Acetylpilosid; 6.6- Acetylpilosid

Figur 3 HPLC-kromatogram av testlösningen av Cistanche deserticola

2.1.4 Linjärt samband

Ta den ovan blandade referenslösningen och ta 1, 2, 3, 4, 5 respektive 6 μ Injicera provet för detektion enligt ovanstående kromatografiska förhållanden och utför linjär regression med referensprovets injektionsmängd (X) som x-axeln och topparean (Y) som y-axeln. Resultaten visas i tabell 1, vilket indikerar att det linjära förhållandet för varje kontrollprov är bra inom deras respektive injektionsintervall.

Tabell 1 Linjärt samband mellan sex fenyletanoidglykosidreferensämnen

2.1.5 Stabilitetstest

Ta samma testlösning och injicera prover vid 0, 2, 4, 8 och 12 timmar efter beredning för att bestämma toppareavärdena för echinakosid, poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, 2- acetyl vid poolen och 6-acetyl vid poolen. Beräkna RSD på 1,51 procent, 1,80 procent, 1,80 procent, 1,71 procent, 1,85 procent respektive 1,82 procent, vilket indikerar att testlösningen är stabil inom 12 timmar.

2.1.6 Precisionstest

Ta samma blandade referenslösning och upprepa injektionen 6 gånger enligt ovanstående kromatografiska förhållanden. Bestäm toppareavärdena för echinacoside, poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside. Beräkna RSD:erna som 0.23 procent , 0.01 procent , 0.10 procent , 0,20 procent , 0,54 procent respektive 0,32 procent, vilket indikerar god precision hos instrumentet.

2.1.7 Repeterbarhetstest

Väg noggrant 6 delar av testprovpulvret av Desert Cistanche deserticola, förbered testlösningen enligt metoden i "2.1.2" och injicera 5 prover enligt ovanstående kromatografiska förhållanden μ Medelvärdena för innehållet i echinacosiden, poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside bestämdes till 8,48, 8,25, 2,35, 1,49, 6,63 och 1,65 mg · g-1 , respektive. De beräknade RSD:erna var 1,58 procent, 1,44 procent, 1,58 procent, 1,59 procent, 1,05 procent och 1,43 procent, vilket indikerar god repeterbarhet av metoden.

2.1.8 Provåtervinningshastighet

Ta 9 delar desert deserticola-pulver med känt innehåll under "2.1.7", 3 delar delas in i 1 grupp och varje del är 0,1 g, noggrant vägd. Lägg till varje referenslösning noggrant till varje grupp och beräkna den genomsnittliga provåtervinningshastigheten. Resultaten visas i tabell 2 nedan.

Tabell 2 Återhämtningsgrad för ökenöken efter provtagning

2.2 Bestämning av relativ korrektionsfaktor

2.2.1 Bestämning av relativa korrektionsfaktorer för varje komponent

Använd Echinacetin som referensmaterial och använd flerpunktskalibreringsmetoden [8-11], ta den blandade referenslösningen under "2.1.1", injicera provet för analys och registrera topparean för varje komponent. Beräkna den relativa korrektionsfaktorn (fk/s) för varje komponent baserat på formeln nedan, med echinakosid som referensmaterial. Resultaten visas i tabell 3.

fk/s=fk /fs=( Ck × As) /( Cs × Ak )

I formeln är As topparean för referensämnet s, Cs är koncentrationen av referensämnet s, Ak är topparean för en viss komponent k som ska testas och Cs är koncentrationen av en viss komponent k.

Tabell 3 Relativa korrektionsfaktorer fk/s för varje komponent som använder Echinacetin som referensmaterial

De relativa korrektionsfaktorerna för poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, {{0}}acetyl poolside och 6-acetyl poolside var 1.008, 1,871, 0,809, 0,611 respektive 0,603, med RSD mindre än 1,5 procent .

2.2.2 Effekt av olika injektionsvolymer på f

Undersökte olika injektionsvolymer (1, 2, 3, 4, 5 μl) Som visas i tabell 4, de relativa korrektionsfaktorerna f för olika injektionsvolymer av poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, 2-acetyl poolside , och 6-acetyl poolside är 1,80 procent , 2,26 procent , 1,46 procent , 2,99 procent respektive 3,27 procent , vilket indikerar att olika injektionsvolymer inte har någon signifikant effekt på f för varje komponent.

2.2.3 Effekt av olika kromatografiska kolonner på f

Vi undersökte effekterna av fyra kromatografiska kolonner (YMC-Triart C18, Agilent Eclipse 5 XDB-C18, TOSOH TSK GEL ODS-100V och Agilent ZORBAX SB-C18) på varje faktor. De relativa korrektionsfaktorerna f för poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside i olika kromatografiska kolonner var 2,55 procent, 1,89 procent respektive 3,45 procent 2,49 procent och 2,21 procent (tabell 4) indikerar att olika kromatografiska kolonner inte har någon signifikant effekt på f för varje komponent.

2.2.4 Olika instruments inverkan på f

Effekterna av tre olika HPLC-metoder (Agilent 1220, Agilent 1260, Agilent 1260 II) på varje f undersöktes. Som visas i tabell 4 var de relativa korrektionsfaktorerna f för poolside, Cistanche C, Cistanche A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside under olika instrument 1,69 procent , 2,52 procent , 1,66 procent , 2,06 procent respektive 2,26 procent (tabell 4), Indikerar att olika instrument inte har någon signifikant inverkan på f-värdet för varje komponent.

2.2.5 Olika personals inverkan på f

Effekterna av tre olika individer på varje f undersöktes, som visas i tabell 4. De relativa korrektionsfaktorerna f för poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside var 1,80 procent, 2,26 procent, 1,46 procent, 2,99 procent respektive 3,27 procent vid olika injektionsvolymer. Detta indikerar att olika injektionsvolymer inte har någon signifikant effekt på f för varje komponent.

Tabell 4 Effekter av olika faktorer på den relativa korrektionsfaktorn fk/s för varje komponent

2.3 Bestämning av den relativa retentionstiden för varje komponent

De relativa retentionstiderna för komponenterna av poolside, cistanche glykosid C, cistanche glykosid A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside var 1,91, 2,60, 1,42, 2,99 och 3.{{11} } respektive med RSD mindre än 1,5 procent . Repeterbarheten var bra.

2.4 Jämförelse av mätresultat mellan ett test med flera utvärderingsmetoder och extern standardmetod

Ta cirka 4,0 g öken- och tubulärt cistanche-medicinpulver från olika satser, väg dem noggrant och förbered testlösningen enligt "2.1.2". Använd den externa standardmetoden för att bestämma komponentinnehållet av echinacoside, poolside, cistanche glycoside C, cistanche glycoside A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside, och beräkna sedan innehållet med den etablerade QAMS. Resultaten visas i tabell 5.

Tabell 5 Samtidig bestämning av sex fenyletanolglykosider i Cistanche deserticola och Cistanche tubulosa med extern standardmetod och QAMS-metod mg · g-1

- "betyder inte upptäckt; n=3

Som visas i tabell 5 är den relativa avvikelsen mellan de uppmätta värdena för den externa standarden och de beräknade värdena för QAMS inom 3 procent, vilket indikerar att det inte finns någon signifikant skillnad i mätresultaten mellan de två metoderna. QAMS-metoden har etablerats för kvalitetsutvärdering av olika fenyletanoidglykosider i Cistanche deserticola.

3 Diskussion

Den 2015 upplagan av den kinesiska farmakopén stipulerar att den totala mängden echinacoside och poolside i Cistanche deserticola inte ska vara mindre än 0,3 procent, och innehållet av båda i Cistanche tubulosa ska inte vara mindre än 1,5 procent. Fenyletanolaminglykosider, som en viktig aktiv komponent i Cistanche deserticola, finns i högt innehåll, förutom echinakosid och antocyaniner. Andra komponenter som Cistanche deserticola glykosid C, Cistanche deserticola glykosid A, 2-acetylantocyaniner och 6-acetylantocyaniner finns också i hög halt. Studier har visat att Cistanche glykosid A kan ha en signifikant skyddande effekt på koltetraklorid och alkohol-inducerad leverskada hos möss, och kan förbättra fria radikaler. De totala fenyletanoidglykosiderna av Cistanche deserticola har antiinflammatoriska och antioxiderande effekter. Dessutom har forskning funnit att innehållet av Cistanche-glykosid A och 2-acetyl vid poolen i de medicinska örter som samlas in under våren är relativt högt, och dessa två effektiva komponenter har liknande farmakologiska aktiviteter som echinacoside och poolside. Det rekommenderas att lägga till Cistanche-glykosid A och 2-acetyl vid poolen till indikatorkomponenterna för att bestämma innehållet av Cistanche [15]. Därför kan endast mätning av innehållet av echinacoside och poolside inte fullt ut återspegla de farmakologiska effekterna och den medicinska kvaliteten hos Cistanche deserticola. Det här experimentet använder ett en-test multipla utvärderingsmetoder, med Echinacetin som referensmaterial, för att fastställa de relativa korrektionsfaktorerna för Cistanche glykosid C, Cistanche glykosid A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside med Echinacetin. 

Cistanche-extraktpulver

Genom bestämning av en referenssubstans av Echinacetin analyserades totalt sex fenyletanoidglykosider i det medicinska materialet kvalitativt och kvantitativt, varigenom kvaliteten på det medicinska materialet säkerställdes.

Experimentet undersökte effekterna av olika injektionsvolymer, kromatografiska kolonner, instrument och experimentell personal på den relativa korrektionsfaktorn, och resultaten visade ingen signifikant avvikelse (RSD)<5%); The QAMS method was validated using the external standard method, and the results showed that there was no significant difference between the calculated values of the QAMS method and the measured values of the external standard method, indicating that the relative correction factor established in this experiment is accurate and reliable.

Dessutom visade de experimentella resultaten också att det fanns en signifikant skillnad i innehållet av sex fenyletanolaminglykosider i öknen och tubulär deserticola deserticola, och det fanns också en signifikant skillnad i innehållet av effektiva ingredienser i samma läkemedelsmaterial från olika batcher. , vilket är nära relaterat till typen av medicinskt material, tillväxtmiljö och skördeperiod. Sammanfattningsvis har detta experiment etablerat en metod för att bestämma innehållet av Cistanche deserticola med flera utvärderingsmetoder. Genom att använda ett referensämne kan innehållet av sex fenyletanoidglykosider i Cistanche deserticola och Cistanche deserticola beräknas exakt, inklusive echinacoside, poolside, glykosid C, glykosid A, 2-acetyl poolside och 6-acetyl poolside Dessutom har den uppnått innehållsbestämning av flera indikatorer vid brist på referensmaterial, vilket ger en mer vetenskaplig och bekväm metod för kvalitetskontroll av Cistanche deserticola.

referens

［1］ National Pharmacopoeia Commission. Kinesisk farmakopé, del 1 [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2015: 135

［2］ Redaktionskommitté för Kinas flora, Chinese Academy of Sciences. flora of China, Vol. 69 [M]. Beijing: Science Press, 1999: 82

［3］ Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola Y. C. Ma," Desert ginseng" : en recension［J］． Am J Chin Med, 2012,40: 1123.

［4］ Li TM, Huang HC, Su CM, et. al. Cistanche deserticola-extrakt ökar benbildningen i osteoblaster［J］． J Pharm Pharmacol, 2012,64 ( 6): 897.

［5］ Li F, Yang XL, Yang YN, et al. Antiosteoporotisk aktivitet av echinacoside hos ovariektomerade råttor［J］． Phytomedicine,2013,20( 6): 549．

［6. Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Forskningsframsteg om den kemiska sammansättningen och farmakologiska effekterna av Cistanche deserticola [J]. Chinese Wildlife Resources, 2010, 29 (1): 7

［7］Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, et al. Forskning om Cistanche deserticola och dess industriella utveckling [J]. Chinese Journal of Pharmacy, 2011, 46 (12): 882

［8］ Hao Shengyuan, Wang Lei, Li Hong, et al. Bestämning av lovastatin och lovastatinsyra i Hongqu- och Zhibituo-tabletter med användning av en multipelutvärderingsmetod för ett test [J]. Chinese Journal of Experimental Prescriptions, 2017, 23 (5): 74

［9］ Yu Xue'e, Qin Jianping, Li Jiachun, et al. Samtidig bestämning av sju flavonoidkomponenter i totala flavonoidkapslar av Epimedium genom en test-multipel utvärderingsmetod ［ J］. Chinese Journal of Experimental Prescriptions, 2017, 23 (7): 79

［10］Wu Jinfeng, Wang Xue, Pan Youzhi, et al. Samtidig bestämning av aktiva ingredienser i totala glykosider av Cistanche deserticola-kapslar baserad på UPLC och en metod för multipel utvärdering [J]. Chinese Journal of Experimental Prescriptions, 2017, 23 (10): 44

［11］Zhu Jingjing, Wang Zhimin, Gao Huimin, et al. Forskningsframsteg på tillämpningen av en metod för multipel utvärdering i kvalitetsutvärdering av traditionell kinesisk medicin [J]. Chinese Journal of Experimental Prescriptions, 2016, 22 (16): 220

［12］ Luo H. ; Cao Ｒ．Wang L．et. al. Skyddande effekt av Cistanchis A på etanol - inducerad skada i primära odlade mushepatocyter［J］． Biomed Pharmacother. 2016,83: 1071.

［13］ Nan ZD．Zeng KW. Shi, SP. et al. Fenyletanoidglykosider med anti-inflammatorisk aktivitet från stjälkar av Cistanche deserticola odlade i Tarimöknen［J］． Fitoterapia, 2013,89: 167.

［14］Xiong Q. Kadota S．Tani T．et. al. Antioxidativa effekter av fenyletanoider från Cistanche deserticola［J］． Biol Pharm Bull, 1996, 19 ( 12): 1580.

［15］ Qian Hao, Yu Fangjun, Geng Zongcheng, et al. Jämförande studie av innehållet av fyra fenyletanolglykosider i Cistanche deserticola insamlade under olika årstider [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2016, 36 (11): 1971