Echinakosid modulerar CGAS-STING-vägen för att lindra LPS-inducerad inflammatorisk skada i alveolära epitelceller (A549)

 

Författare:Jianfeng Luo; Tao Bai
Anslutning:Avdelning 1, Institutionen för infektionssjukdomar, Wuhan Jinyintan Hospital, Wuhan 430000, Hubei, Kina

 

Viktiga takeaways (för naturliga ingredienser och kompletterande FoU-läsare)

LPS-exponering skadade A549-alveolära epitelceller, reducerande proliferationsmarkörer och ökar apoptos och inflammatoriska cytokiner.

Echinakosid (ECH) visade dosberoende skydd: förbättrad cellviabilitet/proliferation och minskad apoptos och inflammatoriska mediatorer.

Mekanistiskt var fördelarna förknippade mednedreglering av signalaxeln cGAS–STING–TBK1–IRF3på både mRNA- och proteinnivåer.

En cGAS-STING-vägaktivator (RocA) försvagade/antagoniserade ECH:s skyddande effekter, stödja vägengagemang.

Relevans för botanisk utveckling: Cistanche(肉苁蓉) är allmänt erkänt som en botanisk rik på echinakosid, vilket gör det till ett praktiskt uppströmsmaterial att överväga för produkt-FoU-samtidigt som man kommer ihåg att denna studie ärin vitrooch använder renad ECH.

Tabell 1. Effekter av olika koncentrationer av ECH och RocA på A549-celler (OD570_{570}570​, xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Koncentration (μmol/L)	ECH (OD570_{570}570​)	RocA (OD570_{570}570​)
0	0.45 ± 0.03	0.43 ± 0.04
3	0.42 ± 0.05	0.45 ± 0.06
6	0.43 ± 0.04	0.42 ± 0.05
9	0.46 ± 0.06	0.46 ± 0.07
12	0.44 ± 0.05	0.44 ± 0.05
24	0.47 ± 0.06	0.20 ± 0.03¹

F/P-värde:ECH: 0,857/0,521; RocA: 22.050 /<0.001
Notera:Jämfört med 0 μmol/L: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Sammanfattning (skriven om på engelska, punkt för punkt)

Mål

För att utvärdera omechinakosid (ECH)skyddar mänskliga alveolära epitelceller frånlipopolysackarid (LPS)-inducerad inflammatorisk skada, och om detta skydd är kopplat till reglering avcGAS–STINGsignalväg.

Metoder (studiedesign)

Cellmodell:Human alveolär epitelcellinjeA549.

Cytotoxicitet/viabilitetsscreening:MTT-analys för att testa ECH och en cGAS-STING-vägaktivator (RocA) för toxicitet.

Gruppering:

Kontroll (standardkultur)

LPS (30 mg/L)

LPS + ECH låg/medium/hög dos (9, 12, 24 μmol/L)

LPS + ECH (24 μmol/L) + RocA (12 nmol/L)

Slutpunkter:

Spridning:EdU-färgningochPCNA(Western blot)

Apoptos:Flödescytometri (Annexin V-FITC/PI); Bax/Bcl‑2(Western blot)

Inflammation:TNF‑ , IL‑6i supernatant (ELISA)

Vägavläsningar:cGAS, STING-mRNA(qRT-PCR);cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteiner(Western blot)

 

Tabell 2. Jämförelse av EdU-positiv hastighet, PCNA-uttryck, apoptoshastighet, Bax/Bcl-2-uttryck och TNF- /IL-6-nivåer i A549-celler mellan grupper (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6

Grupp	EdU-positiv kurs	PCNA/GAPDH	Apoptosfrekvens (%)	Bax/GAPDH	Bcl-2/GAPDH	TNF- (ug/ml)	IL-6 (ng/ml)
Kontrollera	57.38 ± 3.24	1.67 ± 0.15	4.38 ± 1.09	0.37 ± 0.06	1.63 ± 0.12	4.65 ± 1.08	18.47 ± 1.19
LPS	27.51 ± 1.68¹	0.49 ± 0.08¹	36.75 ± 2.31¹	1.59 ± 0.13¹	0.28 ± 0.06¹	30.71 ± 1.68¹	49.23 ± 2.75¹
ECH-L	33.72 ± 1.96²	0.86 ± 0.10²	29.16 ± 2.27²	1.24 ± 0.11²	0.67 ± 0.08²	22.58 ± 1.52²	41.78 ± 2.46²
ECH-M	40.59 ± 2.40²,³	1.27 ± 0.13²,³	21.93 ± 1.64²,³	0.85 ± 0.09²,³	1.08 ± 0.10²,³	15.83 ± 1.16²,³	32.64 ± 2.18²,³
ECH-H	48.21 ± 2.57²,³,⁴	1.58 ± 0.14²,³,⁴	13.86 ± 1.45²,³,⁴	0.49 ± 0.08²,³,⁴	1.35 ± 0.11²,³,⁴	7.91 ± 1.13²,³,⁴	23.59 ± 1.57²,³,⁴
RocA	35.79 ± 2.38⁵	0.92 ± 0.11⁵	25.74 ± 1.69⁵	0.93 ± 0.10⁵	0.74 ± 0.09⁵	19.76 ± 1.20⁵	36.78 ± 2.61⁵

F-värde: 118.927; 85.600; 245.724; 131.552; 159.598; 321.852; 161.353
P-värde:alla<0.001

Anmärkningar (flera jämförelser):
Jämfört medKontrollera: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05
Jämfört medLPS: ² P<0.05P<0.05P<0.05
Jämfört medECH-L: ³ P<0.05P<0.05P<0.05
Jämfört medECH-M: ⁴ P<0.05P<0.05P<0.05
Jämfört medECH-H: ⁵ P<0.05P<0.05P<0.05

 

 

Resultat (huvudfynd)

Jämfört med kontroll,LPS:

MinskadeEDU-positiv ränta,PCNA, ochBcl‑2

Ökadeapoptoshastighet,TNF‑, IL‑6

UppregleradcGAS och STING på mRNA-nivå

ÖkadeBax- och cGAS-STING-vägproteiner (cGAS, STING, TBK1, IRF3)
(Alla statistiskt signifikanta, P<0.05P<0.05P<0.05.)

Jämfört med enbart LPS,ECH (9→12→24 μmol/L)dosberoende:

Återställd spridning(högre EdU-positiv frekvens och PCNA)

Minskad apoptos(lägre apoptosfrekvens, lägre Bax, högre Bcl-2)

Undertryckt inflammation(lägre TNF‑ och IL‑6)

Nedreglerad cGAS–STING-signalering(lägre cGAS/STING mRNA; lägre cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteiner)
(Dosberoende, P<0.05P<0.05P<0.05.)

RocA motverkadeECH:s skydd under LPS-skadeförhållanden (P<0.05P<0.05P<0.05), consistent with cGAS–STING pathway involvement.

Slutsats

ECHökad livskraft och proliferativ aktivitetav LPS-utmanade alveolära epitelceller ochundertryckt apoptos och inflammatoriska svar. Skyddsmekanismen är sannolikt relaterad tillhämning/blockad av överaktiverad cGAS-STING-signalering.

 

Bakgrund (varför detta är viktigt)

Hos patienter som exponerats för eller infekterats av LPS (en viktig gramnegativ bakteriell komponent),akut lungskada (ALI)och dess svåra formARDSär nyckelfaktorer för sjuklighet och dödlighet. Karakteristisk patologi innebär diffus skada påalveolärt epitelochkapillärt endotel, vilket leder till barriärläckage och lungödem.

Trots framsteg inom stödjande vård,effektiva riktade terapier förblir begränsade, så det är viktigt att identifiera nya läkemedelskandidater och mål.

Echinacoside (ECH)är en fenyletanoidglykosid med rapporterade aktiviteter inklusive antioxidant, antiinflammatorisk, cytoskyddande och antiapoptotiska effekter.
För utvecklare av naturliga produkter:Cistanche (肉苁蓉)är en traditionell botanik som ofta lyfts fram för att vararik på echinacoside, vilket gör det till ett praktiskt källmaterial när man utforskar ECH-orienterade formuleringar – samtidigt som det kräver noggrant standardiserings- och översättningsarbete bortom cellanalyser.

DecGAS–STING-vägär en cytosolisk DNA-avkännande axel som främjar typ I-interferon och produktion av inflammatoriska mediatorer. Bevis tyder på detöverdriven aktiveringav cGAS–STING bidrar till inflammatorisk och autoimmun patologi, och att undertryckande av denna överaktivering kan bidra till att dämpa inflammatorisk lungskada.

 

Material och metoder (FoU-vänlig sammanfattning)

Cellinje och kultur

A549-celler odlades iDMEM med låg glukoshaltmed10 % FBSoch1% antibiotika, med medelstora förändringar varannan dag. Experiment utfördes kl~80–90 % sammanflöde.

Reagens (hög nivå)

ECH(leverantörsinformation anges i originalpapperet)

LPS

RocA(används här som encGAS–STING-vägaktivator)

Analyskit: MTT, EdU, apoptoskit (Annexin V-FITC/PI), ELISA-kit för TNF- och IL-6

Molekylära analyser: RNA-extraktion, omvänd transkription, qRT-PCR-reagens; antikroppar för Western blot (PCNA, Bax, Bcl-2, cGAS, STING, TBK1, IRF3, GAPDH)

Dosval (viabilitetsscreening)

ECH (0–24 μmol/L)visadeingen signifikant cytotoxiciteti A549-celler och därför9/12/24 μmol/Lanvändes.

RocAvar icke-giftig inombords0–12 nmol/Lmedan högre koncentration minskade livsduglighet;12 nmol/Lvaldes ut.

LPS-skadeinduktion och gruppering

LPS-skada inducerades med30 mg/L LPS.

Behandlingsarmarna var som beskrivits i sammandraget (Kontroll; LPS; LPS+ECH låg/medium/hög; LPS+ECH hög+RocA).

Resultatmätningar

Spridning:EdU-positiva celler genom fluorescensmikroskopi; PCNA genom Western blot.

Apoptos:Flödescytometri (Annexin V-FITC/PI); Bax- och Bcl-2-proteinnivåer.

Inflammatoriska mediatorer:TNF‑ och IL‑6 i kultursupernatant med ELISA.

Banuttryck:cGAS och STING mRNA genom qRT-PCR med GAPDH som intern kontroll; proteiner (cGAS, STING, TBK1, IRF3) genom Western blot.

Statistik:ANOVA med SNK‑q post-hoc-testning (GraphPad Prism 9.0), signifikans inställd på P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Resultat (vad förändrades med LPS, ECH och RocA)

1) Cellviabilitet/toxicitetsfönster

ECH tolererades väl upp till det testade intervallet som användes för mekanistiska studier.

RocA krävde försiktig dosering; en icke-toxisk arbetskoncentration valdes.

Figur 1. A549-cellproliferation i varje grupp (EDU-färgning, ×200)

 

2) Proliferation undertrycktes av LPS och återställdes av ECH

LPS reduceradEdU bolagiseringochPCNAuttryck, vilket indikerar minskad proliferativ aktivitet.

ECH ökade EdU-positiva priser och PCNApå ett dosberoende sätt.

Genom att lägga till RocA minskade dessa vinster, vilket tyder på att vägen bidrar till ECH:s pro-överlevnads-/pro-proliferationseffekt.

3) Apoptos ökade med LPS och hämmades av ECH

LPS ökade apoptoshastigheten, ökadeBax, och minskadeBcl‑2.

ECH vände dessa förändringar dosberoende (lägre apoptosfrekvens och Bax, högre Bcl‑2).

RocA flyttade fenotypen tillbaka mot apoptos, vilket försvagade ECH-skyddet.

Figur 2. Western blot-analys av PCNA-, Bax- och Bcl-2-uttryck i varje grupp

 

4) Inflammatoriska cytokiner (TNF‑, IL‑6) reducerades av ECH

LPS förhöjda TNF- och IL-6 i supernatanter.

ECH reducerade båda cytokinerna dosberoende.

RocA ökade dem i förhållande till enbart hög dos ECH, vilket överensstämmer med reaktivering av vägen som förstärker inflammationen.

5) cGAS- och STING-transkription inducerades av LPS och undertrycktes av ECH

LPS ökadecGAS och STING mRNA.

ECH sänkte deras uttryck (dosberoende).

RocA ökade uttrycket jämfört med ECH hög dos.

Figur 3. Jämförelse av A549-cellapoptos i varje grupp

 

6) cGAS-STING-vägproteiner nedreglerades av ECH

LPS ökadecGAS, STING, TBK1 och IRF3proteinuttryck.

ECH reducerade dessa proteiner dosberoende.

RocA ökade proteinnivåerna i vägen jämfört med enbart ECH hög dos.

 

Tabell 3. Jämförelse av cGAS/STING mRNA och cGAS–STING proteinuttryck i A549-celler mellan grupper (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Grupp	cGAS mRNA	STING mRNA	cGAS/GAPDH	STING/GAPDH	TBK1/GAPDH	IRF3/GAPDH
Kontrollera	1.00 ± 0.12	1.00 ± 0.11	0.32 ± 0.07	0.36 ± 0.08	0.29 ± 0.05	0.25 ± 0.06
LPS	2.15 ± 0.16¹	2.28 ± 0.17¹	1.68 ± 0.13¹	1.85 ± 0.16¹	1.57 ± 0.13¹	1.62 ± 0.14¹
ECH-L	1.74 ± 0.13²	1.83 ± 0.14²	1.34 ± 0.12²	1.42 ± 0.13²	1.24 ± 0.11²	1.23 ± 0.12²
ECH-M	1.36 ± 0.11²,³	1.31 ± 0.12²,³	0.82 ± 0.09²,³	1.03 ± 0.11²,³	0.86 ± 0.09²,³	0.78 ± 0.09²,³
ECH-H	0.73 ± 0.09²,³,⁴	0.62 ± 0.08²,³,⁴	0.45 ± 0.08²,³,⁴	0.57 ± 0.09²,³,⁴	0.47 ± 0.08²,³,⁴	0.38 ± 0.07²,³,⁴
RocA	1.58 ± 0.12⁵	1.69 ± 0.15⁵	1.17 ± 0.11⁵	1.28 ± 0.14⁵	1.12 ± 0.10⁵	0.97 ± 0.10⁵

F/P-värden:

cGAS mRNA: 103,612/<0.001

STING mRNA: 124,857 /<0.001

cGAS/GAPDH: 160,066 /<0.001

STING/GAPDH: 124.141 /<0.001

TBK1/GAPDH: 150,139 /<0.001

IRF3/GAPDH: 158,576 /<0.001

 

Figure 4. cGAS-STING pathway protein expression in cells of each group

 

Diskussion (tolkning för produkt- och mekanismläsare)

LPS används ofta för att modellera inflammatorisk lungskada. Här försämrade LPS direkt alveolära epitelcellers proliferativa kapacitet och främjade apoptos, åtföljd av förhöjda TNF- och IL-6-två cytokiner som är vitt kopplade till inflammatorisk lungskada.

ECH agerade som encytoprotektiva och antiinflammatoriska medeli denna in vitro-miljö, i överensstämmelse med tidigare rapporter om att ECH kan lindra oxidativ stress, inflammation och apoptos i lungskada sammanhang.

cGAS–STING-axeln (och nedströms TBK1/IRF3) verkar vara en mekanistisk nod:ECH-sänkta cGAS-STING-vägmarkörer, ochRocA avtrubbade ECH:s fördelar, vilket stöder hypotesen att ECH skyddar celler åtminstone delvis genomblockerar överdriven cGAS–STING-aktivering.

Vad detta antyder för naturlig botanisk utveckling (Cistanche-sammanhang)

Därför attCistanche (肉苁蓉)är känd förhög echinakosidhalt, det är en logisk botanisk kandidat när man utforskar ECH-centrerade formuleringar som syftar till inflammatorisk balans och epitelskyddsteman.

Att översätta detta till kosttillskott kräver dock försiktighet: det här arbetet ärcellinjebaserad, använderLPS-skadaochrenat ECH, och fastställer inte human effekt, oral biotillgänglighet, metabolism eller kliniskt relevant dosering.

Begränsningar och nästa steg (som antyds av författarna)

Fynden behöver valideras iin vivo ALI/ARDS-modellerför att bekräfta effektivitet och mekanistisk koppling till cGAS-STING under fysiologiska förhållanden.

Ytterligare arbete skulle krävas för att kartlägga uppströms triggers och bekräfta om effekterna är direkt hämning av vägen kontra sekundär till reducerad cellulär stress.

 

Referenser (förvaras kompletta, som tillhandahålls)

Li N, Liu B, Xiong R, et al. HDAC3-brist skyddar mot akut lungskada genom att upprätthålla epitelbarriärens integritet genom att bevara mitokondriell kvalitetskontroll.Redox Biol, 2023;63(1):102746-61.

Long ME, Mallampalli RK, Horowitz JC. Patogenes av lunginflammation och akut lungskada.Clin Sci (Lond), 2022;136(10):747-69.

Mokrý AD. Akut lungskada - från patofysiologi till behandling.Physiol Res, 2020;69(Suppl 3):S353-66.

Wang W, Jiang S, Zhao Y, et al. Echinacoside: en lovande aktiv naturprodukt och farmakologiska medel.Pharmacol Res, 2023;197(1):106951-66.

Pan Y, Liu Y. Echinacoside lindrar ombyggnad av luftvägarna och inflammation i en ovalbumininducerad neonatal musmodell av astma genom att modulera SIRT1-NF-KB-vägen.Allergol Immunopathol (Madr), 2023;51(4):71-7.

Cui YH, Li KF, Jin B, et al. Echinakosid hämmar bleomycin-inducerad lungepitelcellsskada och inflammatorisk respons.Kinesisk tidskrift för patofysiologi, 2021;37(11):2024-30.

Xie W, Deng L, Lin M, et al. Sirtuin1 förmedlar de skyddande effekterna av echinacoside mot sepsis-inducerad akut lungskada genom att reglera NOX4-Nrf2-axeln.Antioxidanter (Basel), 2023;12(11):1925-45.

Alonso Paiva IM, Santos AR, Brito CB, et al. cGAS/STING-vägens roll i kontrollen avBrucella abortinfektion som förvärvats genom luftvägarna.Front Immunol, 2023;14:1116811.

Zhao J, Zhen N, Zhou Q, et al. NET främjar inflammatorisk skada genom att aktivera cGAS-STING-vägen vid akut lungskada.Int J Mol Sci, 2023;24(6):5125-45.

Wu X, Jiang Y, Li R, et al. Fikolin B som utsöndras av alveolära makrofagexosomer förvärrar bleomycin-inducerad lungskada via ferroptos genom cGAS-STING-signalvägen.Celldöd Dis, 2023;14(8):577-92.

Zhang SW, Cheng SL, Xing QF. Pakymsyra lindrar skador på kolonepitelceller hos råttor med ulcerös kolit genom att hämma signalvägen cGAS-STING.Journal of Immunology(Kina), 2023;39(8):672-80.

Zhang JJ, Li YY, Qin J. lncRNA LUCAT1 riktar sig mot miR-203a-3p för att påverka apoptos och inflammatoriskt svar i LPS-inducerade alveolära epitelceller av typ II.Journal of Immunology(Kina), 2023;39(8):689-95.

Li J, Deng SH, Li J, et al. Obacunon lindrar ferroptos under lipopolysackarid-inducerad akut lungskada genom att uppreglera Nrf2-beroende antioxidantsvar.Cell Mol Biol Lett, 2022;27(1):29-48.

Hong H, Lou S, Zheng F, et al. Hydnocarpin D dämpar lipopolysackarid-inducerad akut lungskada via MAPK/NF-KB och Keap1/Nrf2/HO-1 väg.Fytomedicin, 2022;101(1):154143-50.

Sasaki M, Kishimoto M, Itakura Y, et al. Luft-vätske-interfaskultur ger SARS-CoV-2-känslighet till A549-alveolära epitelceller.Biochem Biophys Res Commun, 2021;577:146-51.

Wang Y, Fan Y, Huang Y, et al. TRIM28 reglerar SARS-CoV-2-cellinträde genom att rikta in sig på ACE2.Cellsignal, 2021;85:110064.

Yang X, Ma L. Efterbehandling med propofol hämmar inflammatoriskt svar i LPS-inducerade alveolära epitelceller av typ II.Exp Ther Med, 2022;23(4):249.

Duan XY, Sun Y, Zhao ZF, et al. Baicalin dämpar LPS-inducerad alveolär typ II epitelcell A549 skada genom attenuering av FSTL1 signalvägen via ökande miR-200b-3p uttryck.Medfödd immun, 2021;27(4):294-312.

Lei X, Liu X, Yu J, et al. 3-metyladenin lindrar akut lungskada genom att hämma oxidativ skada och apoptos.Heliyon, 2024;10(13):e33996.

Li M, Song J, Tang X, et al. Kritiska roller för PAI-1 vid lipopolysackarid-inducerad akut lungskada.Adv Med Sci, 2024;69(1):90-102.

Jiang T, Yuan D, Wang R, et al. Echinacoside, en lovande sortas A-hämmare, kombinerad med vankomycin mot murina modeller av MRSA-inducerad lunginflammation.Med Microbiol Immunol, 2023;212(6):421-35.

Yang Y, Liu Y, Wang Y, et al. Reglering av SIRT1 och dess roller vid inflammation.Front Immunol, 2022;13(1):831168-83.

Jiang Z, Jiang Y, Fan J, et al. Hämning av cGAS förbättrar akut lungskada utlöst av zinkoxidnanopartiklar.Toxicol Lett, 2023;373(1):62-75.

Domizio JD, Gulen MF, Saidoune F, et al. cGAS-STING-vägen driver typ I IFN-immunopatologi vid COVID-19.Natur, 2022;603(7899):145-51.

Messaoud-nacer Y, Culerier E, Rose S, et al. STING-agonist diABZI inducerar PANoptos och DNA-medierat akut andnödsyndrom (ARDS).Celldöd Dis, 2022;13(3):269-85.

Wen J, Qin S, Li Y, et al. Flavonoider som härrör från lakrits undertrycker LPS-inducerad akut lungskada hos möss genom att hämma cGAS-STING-signalvägen.Food Chem Toxicol, 2023;175(1):113732.

 

Om Cistanche (肉苁蓉) Extract Manufacturer (för produktutvecklare)

För team som utforskarCistanche-baseradutveckling av naturliga ingredienser - speciellt standardiserade extrakt placerade runtechinakosid- Tillverkarens bakgrund och kapacitetsinformation finns här:
https://www.xjcistanche.com/about-us